全国肿瘤和胎儿游离DNA检测 临床应用及标准化高峰论坛报道

2016年11月23-24日，“全国肿瘤和胎儿游离DNA检测临床应用及标准化高峰论坛”在长沙召开，针对NIPT和肿瘤游离DNA检测实验室基本要求、 游离DNA检测质量保证和标准化（分析前、分析中和分析后）的关键点、游离DNA检测所涉及的商品试剂方法特点及性能验证和游离DNA检测LDTs的性能确认进行讨论。

检测肿瘤游离DNA（ctDNA）的液态活检和检测胎儿游离DNA（cffDNA），目前已分别成为肿瘤治疗和染色体非整倍体无创产前筛查（NIPT）等的实验室检测最热的一个领域，也分别在肿瘤的精准治疗和染色体非整倍体精准无创筛查方面发挥着重要作用，并分别朝着替代组织和常规唐氏筛查的方向快速发展。为进一步加强游离DNA的质量保证和标准化以及对游离DNA相关项目的实验室检测质量进行总结，召开了本次高峰论坛。

1964年夏教授承担了长沙市北区小学生红绿色盲的遗传学调查研究项目，通过发病率的调查及其患儿家系的遗传学分析，认识到批判摩尔根“基因论”是错误的。通过努力，1971年，夏教授在国内建立了Seabright发现的人类染色体G显带技术，在国际上首创了75度烤片法，随后建立了Q带、C带、N带、LX、SCE技术和550-1000条带染色体高分辨技术。并在1973年先后开设了我国首家“染色体病遗传咨询门诊”，率先在我国开展了染色体病的诊断与产前诊断。1981年采用“高分辨染色体技术”，通过特殊病例的研究，将“人类睾丸决定基因”定位于Yp11.32带，纠正了国际上将睾丸决定基因定位于Y染色体着丝粒周围的错误。夏教授曾在一个确诊为鼻咽癌病人的外周血中发现了一个带有t（1;3）（q44;p11）的标记染色体细胞，证明外周血中游离癌细胞的存在，引起了国内外高度关注。1990年与日本长崎大学遗传研究所Niikawa教授合作，首创了用人工合成的由24个核苷酸组成的引物对显微切割的染色体的未知序列的DNA片段进行显微切割染色体。1996年7月，夏教授利用国际“人类基因组计划”研究所公布的EST信息资源，以进化的理论为基础，在计算机上进行同源分析，成功地创建了“基因家族──候选疾病基因克隆”新方法。于1998年3月，克隆了间隙连接蛋白β-3基因（GJB3），并用染色体原位杂交技术将其定位在1号染色体短臂3区3带到3区5带上。随后，对实验室收集的42个相关疾病家系进行突变检测，5月28日终于从浙江和湖南两个神经性耳聋家系中发现了该基因突变，从而确定GJB3是决定人类遗传性神经性高频性耳聋的疾病基因。最后夏教授讲道，希望通过这次会议的交流，在“胎儿和肿瘤游离DNA检测”的临床应用方面在全国实现“三级跳”，在国际上成为“游离DNA检测规则”的重要制定者和重要主导者。

1997年首次在母血中发现胎儿游离DNA，到2008年香港中文大学实验室验证NIPT的可行性。2015年NIPT中国临床应用指南明确了相关适用范围以及开展规范，同年ACOG与ISPD分别修订NIPT临床应用指南，对相关受检人群，相关检测范围进行进一步扩展。2016年7月28日，ACMG出台新声明，其中提到，NIPT－NIPS是目前筛查T21、T18、T13最敏感的技术，性染色体非整倍体可以做，但假阳性较高，要做好筛查前咨询。NIPS技术可以检测CNVs，孕妇有选择NIPT－plus的权利，而且NIPT阳性患者必须要做产前诊断验证和专业的遗传专家指导。母体外周血含有的cffDNA，几乎全部来源于胎盘滋养层细胞。怀孕4周可以检测出来，8周后含量上升并稳定存在。尽管在中低风险人群中游离DNA检测的敏感性和特异性与在高危人群中相似，但由于缺乏足够数据，并考虑卫生经济学问题，NIPT仍不能代替现有的一线筛查。取消了NIPT仅能针对高风险孕妇的说法缺乏足够的临床数据，而对于无创染色体CNV检测以及双胎妊娠的检测，ACOG同样持保守意见，而且有越来越多的数据显示NIPT可以用于中风险人群。NIPT针对常见染色体非整倍体的检测具有高度准确性，在严重遗传病防控检测绝对优于血清学筛查，并且NIPT对重大遗传病防控的支撑作用。NIPT能够拓展检测病种与范围，提高检测准确度，降低检测费用。

朱冠山教授主要从分子检测指导下的肿瘤精准治疗进展、血液分子检测对于肿瘤精准治疗的独特价值、血液分子检测对技术的挑战与研发进展以及肿瘤精准诊疗中血液分子检测的未来与展望等四个方面进行介绍。当前肿瘤药物治疗正处于重大变革时期，治疗手段也分为组织分型指导下的传统治疗和分子分型指导下的精准治疗，也表明分子检测和药物使用同样重要的地位，但是仅靠组织已不能满足临床分子检测需求。游离DNA（cfDNA）及游离肿瘤DNA（ctDNA）都能从凋亡的细胞中捕获。欧盟与中国已批准ctDNA检测用于临床。而且专家共识的发表推动了血液EGFR突变检测标准化。血液检测是有价值的补充方法，特别是动态监测。而且血液检测流程中的三个环节同等重要均须规范，包括：1样本采集方法；2.cfDNA提出方法；3.突变检测方法首选ARMS。ctDNA突变定量信息有望用于治疗决策。肿瘤组织突变定量与疗效成正相关，ctDNA突变定量与治疗方案相关。随着肿瘤精准治疗对分子检测的需求的持续增加，血液分子检测已显示出独特的优势，基于ctDNA的基因突变检测已取得初步成功并展示临床价值，检测方法灵敏度却仍有提高空间，而检测流程标准化是至关重要的。CTC和ctRNA潜力的挖掘有赖富集和提取技术的突破。

张教授主要从NSCLC液体活检背景、NSCLC液体活检应用实践和临床应用的痛点与挑战等三个方面进行介绍。1948年最早发现血浆游离DNA（cell-free DNA），1977-1987年，在肿瘤患者的外周血中成功检测和分离循环肿瘤DNA。根据早期筛查，来判定肿瘤的发生，根据症状，评估肿瘤的异质性及药物的筛选，通过动态检测，了解肿瘤的发生发展以及治疗情况，通过耐药突变检测，对病人实施个体化用药，并及时评估肿瘤复发转移的风险情况。肿瘤恶化加剧或转移会导致MCNA（即每毫升血浆中某一突变基因拷贝数变化）。NSCLC液体活检应用实践中，主要包括ctDNA肺癌基因检测，通过ctDNA检测，为48.9%的肿瘤患者找到actionable variation（>2500）。肺癌基因检测是杜依肺癌临床常见4种突变类型，11个基因，189种热点突变的联合检测，以及不同建库试剂盒测试等。张教授在介绍BGI检测质控点时，重点讲样本采集时，组织样本应大于60mg，肿瘤细胞占比则大于30%，坏死细胞小于10%；FFPE样本切片厚度在5-10 μm之间，肿瘤组织要大于70%；外周血量在10ml左右。在数据质控中，质谱信息核对21位点，需要确认样本信息正确；对于数据量、测序深度、碱基质量值质控，必须保证数据质量；对于变异检测流程严格按照参考值设置和进行阈值控制。NSCLC面临很多的挑战与困难，其中包括了检测技术低起始量、低丰度变异检测、小片段、短半衰期等。数据库缺乏健康基线（baseline）及疾病数据库（high quality data）等，而且缺少基于诊断的多中心临床液体活检实验以及数据库从建立、开发到应用的行业或专业标准以及实验室标准。

DNA序列是所有生物物种遗传信息的携带者。50年前，DNA双螺旋结构的发现告诉人们：如果我们不能“阅读”序列，就不能揭开生命的奥秘。人类基因组计划所测定的DNA序列，进一步了解了生老病死的奥秘，人类和其他生物的DNA序列成为生命科学和生物技术的上游和源头。人类基因测序是生物技术、信息技术等的有机集成。从样品制备到“解读”序列，再到最后的序列组装和注释，每一个环节都有严格的质量要求。人类只有一个基因组，人类基因组是全人类共同的财富和遗产。基因组学是生命科学所有学科的基础，又是二十一世纪生命科学的前沿和新的起点。“组”与“组学”就是把生命科学几乎所有学科都“-组化” 和“-组学化”了。人类基因组计划是人类历史上第一次“共有、共为、共享”的计划，所有具备能力的国家共同合作进行研究，而其研究结果也由全世界人民平等自由地分享。随着人类对基因认识的加深，转基因作物的发展步伐也许会加快，这将对人类提出更为严峻的挑战。这些挑战，必须认真去面对，慎重加以解决。

临床医生选用液体活检的方法中，二代测序（NGS）占86%，其次是ARMS法，占69%，微滴式数字PCR （Droplet Digital PCR）占38%。检测已知的、单个临床可药物抑制的靶点，液体活检技术推荐ARMS方法，而检测已知的、多个平行临床可药物抑制的靶点，液体活检技术推荐NGS方法。对于EGFR突变并且接受一线EGFR-TKI治疗的患者而言，C3 pEGFR突变状态可能是疗效预因子，而这一结论有待进一步前瞻性临床研究证。早期诊断的可行性，多数肺癌患者ctDNA浓度小于0.5%，新的检测技术的产生使早期肺癌的诊断成为可能。液体活检作为通用癌症筛查在增加检测方法敏感性的同时，假阳性率也会增高，而且当下还未发现所有肿瘤都通用的标志物，而且不是所有肿瘤都会以相同的方式释放ctDNA。ctDNA浓度不仅仅与肿瘤负担相关，也与释放至血液的阻力相关。肿瘤游离DNA检测标准化的要点主要包括CAGC-POI项目临床NGS和ctDNA：总体技术要点与可靶向作用位点等，临床样本类型与处理，技术层面：Panel多大合理、不同生物材料的合理深度、流程标准化，信息学分析如何标准化、数据管理与结果解读与报告？结果用于临床决策谁主导？临床诊断与研究的区别。用于发现未知基因，探索疗效监测、预后判断和发现耐药机制等，液体活检技术建议使用NGS。液体活检包括CTC和ctDNA可能用于肺癌早期诊断和复发监测，但目前仅限于科研探索。将NGS用于临床研究时，需平衡患者利益、伦理要求和科学发现之间的关系，以患者利益为至上。

林教授主要介绍了肿瘤游离DNA技术应用概况和肿瘤游离DNA检测技术验证方法介绍等两个方面的内容。

《MIT技术论》杂志将液体活检技术列为2015年十大突破技术之一。根据摩根大通预测，2020年，全球液体活检市场将达到约230亿。并表示，血液样本中携带的信息可以用作诊断、评估多种疾病的潜在分子标记物。液体活检可作为组织活检的有效补充。液体活检以其非侵入性、可实时取样、实时监控治疗及患者耐药情况和信息丰富等优势，弥补了组织活检取样困难，需要手术或穿刺、无法实时反映患者的突变情况等不足。当下，液体活检也面临诸多挑战，包括：样本间差异大，早期患者ctDNA的含量低、对检测灵敏度要求高，需要医学和相应指南规范解读等。Thermo Fisher液体活检实现0.1%检测下限的非小细胞肺癌液体活检试剂盒。针对NSCLC患者cfDNA检测primary tumor drivers、检测耐药突变（eg. T790）、检测灵敏度低至0.1%、试剂盒所选区域经OncoNetwork和MD Anderson Cancer Center审核优化、包含35个扩增子、针对肺癌相关11个基因并且覆盖157个与氨基酸变化相关的热点突变（hotspot）。利用高通量测序平台，从外周血样本来源的cfDNA中检测低至0.1%的体细胞突变（somatic mutations）， 开展肿瘤靶向用药分子分型。 

“性能验证”广义为通过提供客观证据证明特定的要求得到满足。而“性能确认”指通过检查和提供客观证据证明，对一特定预期应用的要求始终能得到满足。性能验证和性能确认FDA和ISO术语相似，差异在后者的“预期用途”。

李教授着重讲述了性能验证或确认的5W1H，即为什么要验证或确认（Why）；什么时候验证或确认（When）；验证或确认什么（What）；在哪里验证或确认（Where）；谁来验证或确认（Who）和如何验证或确认（How），并强调应该在使用新的商品检测试剂或检测系统时进行性能验证，而性能确认应该在实验室自己建立方法及配制试剂或建立检测系统时进行。NGS阳性结果，有必要时（如有假阳性结果倾向），可使用相同或不同的方法进行确认实验，不同的NGS平台假阳性率有的可高至7.8%，确认实验可为另一个临床已确认的方法；确认实验在使用前也应该进行确认评价；两个不同的NGS平台确认或比较结果，可能是一个合理的选择。ctDNA的NGS性能确认较为复杂，主要是因为检测涉及的步骤多，所产生的数据量大，且算法复杂。性能确认很难做到理想化。通过性能确认所得到的性能指标，可用于在患者标本检测时，建立质量控制方法。分析方法的性能确认的目的，是证明方法用于检测的有效性。而临床性能确认的目的，是证明检测能满足相应的临床预期用途主要是观察分析性能确认建立的阳性和阴性判断，在根据其临床预期用途的临床实际应用中，是否能满足应用要求。

李教授首先介绍了基因测序技术的发展，从1953年DNA双股螺旋的发现到新一代测序技术（next-generation sequencing）在2007年被Nature Methods评为生物领域影响力最大的技术，测序技术日益发展。精准医学不等于高通量测序，高通量测序是目前精准医学实践最为成熟的支撑技术。并介绍了高通量测序技术的临床应用，其中包括染色体非整倍体无创产前筛查（NIPT）、胚胎植入前遗传学筛查（ Preimplantation Genetic Screening，PGS）和胚胎植入前基因诊断（Preimplantation Genetic Dignosis，PGD）、肿瘤靶向治疗基因突变检测、单基因遗传病检测以及病原微生物检测：如HPV基因分型、宏基因组（Metagenomics）测序等。高通量测序技术临床应用的标准化的关键点，其中包括1.检验申请单是合适的；2.标本在采集、运送和保存应该是正确的；3.实验室环境条件应是符合温湿度要求，尽可能的避免灰尘、电磁、振动等干扰；4.仪器设备状态应该定期维护、定期校准；5.试剂性能应该经过验证或性能确认；6.实验室人员也应该是经过外部和内部培训，是有能力胜任的；7.SOP的可操作性及全员遵循得到结果的过程应该有监控；8.针对差错、投诉、失控等分析原因采取措施的质量持续改进；9.临床医生能正确的理解和应用检验结果于患者疾病的诊断和治疗等。高通量测序实验室质量管理与标准化任重道远，还需要各位同仁的共同努力，没有精准的检测就没有精准医疗。

韩瑾教授主要介绍了高通量测序技术在无创产前检测应用的原理与效能和无创产前检测临床应用问题与思考。使用二代测序技术对游离DNA的碱基进行测序，运用生物信息学软件将测序结果与已知的人类基因组进行比对，确定样本中DNA片段的来源。利用公式计算每条染色体的Z-score，胎儿为染色体非整倍体高风险时的chrN Z-score较胎儿为正常核型的Z-score高。高通量测序技术检测其它性染色体异常，而导致性染色体检测不准确的原因包括以下几点：1.许多性染色体异常均为嵌合体；2.Y染色体，由于片段较小与x 染色体中存在同源性；3.X染色体有年龄相关性缺失（The age-related loss）。MPS适用于无创产前检测21三体、18三体、13三体。而本研究通过大样本的实验也证明了SSP在无创产前检测中具有高灵敏性和特异性；适用于大样本的胎儿非整倍体的产前检测；可应用于所有染色体非整倍性的检测，包括性染色体。且SSP体积小，更适用于临床产前诊断实验室中。NIPT技术可实现对胎儿非整倍体高灵敏度高特异性的检测，尤其是21三体综合征。胎儿21三体综合征及其他染色体异常必须经过绒毛或羊水穿刺进行确诊，而且不建议单独使用孕妇年龄对胎儿唐氏综合征的风险进行评估。如果在早孕期无法提供NIPT检测，应联合应用超声测量NT和母体血清学标志物的筛查方法进行风险评估。当NIPT延伸应用到检测微缺失/微重复综合征及其他少见三体时，应局限于具有显著临床特征的疾病，并评估其检出率、假阳性率、临床疾病的严重程度。NIPT检测染色体微缺失重复可以提高对于产前无特异表现的胎儿的检出率，但是假阳性结果造成的焦虑及进入穿刺后病例的流产风险也存在。

产品注册前需要明确以下内容，包括：产品属性、产品类别和管理归属等内容。无论类别如何，无论注册单元如何划分，与检测相关的所有仪器与试剂都需要在产品注册时有所体现。一个产品从最初的科研完成后，产品研究的过程从原材料、反应体系、工艺、分析性能、临床性能等一系列的验证都需要有客观数据证实。

安教授主要强调了创新医疗器械相关的申请条件及存在的问题。申请人经过其技术创新活动，在中国依法拥有产品核心技术发明专利权，或者依法通过受让取得在中国的发明专利权或其使用权；或者核心技术发明专利的申请已由国务院专利行政部门公开；产品主要工作原理/作用机理为国内首创，产品性能或者安全性与同类产品比较，有根本性改进，技术上处于国际领先水平，并且具有显著的临床应用价值。申请人已完成产品的前期研究并具有基本定型产品，研究过程真实和受控，研究数据完整和可溯源。相关程序仍存在诸多问题，例如审批的所有条件都需要满足，但是企业提交资料不充分；产品不成熟，缺乏足够的验证数据等。对于IVD产品来说，不仅要有可靠的实验室验证数据，也应当有足够的临床使用效果好明确的预期用途。

编辑：葛玲宇