二价金属离子转运蛋白1 与铁转运

1. 二价金属离子转运蛋白（DMT1/DCT1/NRAMP2）的发现

1997年，一种铁转运蛋白通过不同的方式被发现。Gunshin等人利用非洲爪蟾卵母细胞表达系统发现了二价阳离子转运蛋白1（DCT1）。DCT1是一种跨膜糖蛋白，介导广泛基质范围的二价金属离子的pH依赖性和质子偶联转运，例如Fe2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Cd2+、Cu2+、Ni2+和Pb2+。

Nramp1（天然抗性相关巨噬细胞蛋白1：溶质转运蛋白家族11成员1蛋白，SLC11A1），它调节宿主对包含在吞噬体内的抗原性无关细胞内病原体感染的易感性，之前在小鼠Bcg/Ity/Lsh位点中被发现。我们分离出了其同源序列，人NRAMP1和NRAMP2。Fleming等人采用定位克隆方法鉴别出了小鼠（mk）和Belgrade大鼠模型中的致病突变，两者均显示出着色不足小红细胞性贫血症状。他们证明了Nramp2基因（Gly185Arg）在mk小鼠和b大鼠两种动物模型中均发生了突变。

后来，由NRAMP2编码的DCT1被重命名为二价金属离子转运蛋白1（DMT1），而这一铁转运蛋白DMT1（SLC11A2）的发现开启了铁代谢研究的新纪元。

2. 四种DMT1异构体的表达和结构

2.1 四种DMT1异构体的不同分布机制

预计DMT1有12个跨膜结构域，而且其N-和C-末端区域均位于细胞质中（见图1）。DMT1的表达以组织和细胞类型特异性及铁依赖性方式得到周密调节。据Gunshin等人报道，DMT1 mRNA水平在铁缺乏动物的十二指肠中是升高的。在3’-非翻译区含有铁反应元件（IRE）的DMT1 mRNA中观察到这种调节，在铁缺乏情况下IRE可与铁调节蛋白（IRP）结合，导致转录本的稳定化和随后DMT1多肽的合成增加。还应注意，DMT1 mRNA包括不含IRE的其他异构体，其通过选择性剪接产生并且对铁浓度无反应。它们在其C-末端区域编码不同的氨基酸序列并产生两种不同的DMT1异构体（I和II）。DMT1异构体II（DMT1-II）mRNA，不包含IRE，在C-末端编码由25个氨基酸片段组成的蛋白质，而另一个异构体mRNA（DMT1-I），含有IRE，编码由18个氨基酸片段组成的蛋白质。此外，DMT1基因启动子的选择性使用产生两种DMT1转录变体，其在编码5’-非翻译区的核苷酸序列及后续N-末端氨基酸上有所不同。从5’-上游启动子和外显子1A转录而来的多肽用DMT1A表示，从另一个启动子和外显子1B转录而来的多肽用DMT1B表示。DMT1A在DMT1B的上游包含额外29个氨基酸。DMT1共有四种不同的异构体，A-I、A-II、B-I和B-II。

图1. DMT1细胞分布机制。

DMT1有四种异构体，分别是A-I、A-II、B-I和 B-II。这四种异构体显示出不同的亚细胞定位。所有DMT1异构体均在高尔基体中发生N-连接糖基化，并转移至质膜。细胞膜部分的免疫印迹试验发现DMT1为90-116kDa的弥散状或梯状条带（糖基化），经肽N-糖苷酶F处理后其表观分子质量从90-116kDa转变为50kDa（去糖基化）。较长形式的 DMT1A的N-末端包含质膜固定信号，而DMT1A-II和DMT1B-II的C-末端包含retromer结合信号（作为再循环内体分布信号）。

四种DMT1异构体在其第7和8跨膜结构域之间的预测细胞外环中均包含两个天冬酰胺残基，即N-连接糖基化位点。人们普遍认为N-连接糖基化对蛋白质正确折叠至关重要，并且发生于内质网（ER）和高尔基体中。免疫印迹试验发现DMT1为90-116kDa的弥散状或梯状条带，经肽N-糖苷酶F（PNGase F）处理后其表观分子质量从90-116kDa转变为50kDa。它们在高尔基体中被高度糖基化，正确折叠并转移至质膜（plasma membrane）（见图1）。

在质膜，每种DMT1异构体沿着不同的途径到达不同的终点。也就是说，DMT1A-I主要定位于质膜，DMT1A-II和DMT1B-II位于再循环内体，而DMT1B-I位于晚期内体/溶酶体。我们使用诱变技术发现了每种DMT1异构体如何遵循不同途径的机制。DMT1A-I异构体的N-末端胞质区中额外29个氨基酸序列上一个亮氨酸16残基（Leu16）的交替排列导致错误定位，表明Leu16作为质膜的驻留信号具有一定作用。在正确定位DMT1B-I的情况下，含有突变非功能性驻留信号的DMT1A-I被错误定位至晚期内体/溶酶体（见图1）。DMT1A-I在极化吸收细胞的顶端膜上表达，但DMT1A-I的N-糖基化突变体的检测不再局限于顶端，而是在顶端和基底外侧膜上均发现了等当水平。因而，DMT1异构体的N-聚糖在分子向顶端膜的极化分选中起到关键作用。另外三种DMT1异构体主要以网格蛋白依赖性方式被内吞。在DMT1A/B-II异构体的C-末端胞质区，有一个Øx（Leu/Met）x序列（其中Ø可以是任何疏水氨基酸、x可以是任何氨基酸），是 DMT1A/B-II与retromer货物识别复合体结合所需的并代表一种新retromer结合基序（见图1）。众所周知，逆转运复合体（retromer）是一种蛋白质复合体，在跨膜受体从核内体（endosome）到反面高尔基体管网状结构（trans Golgi network，TGN）的再循环过程中发挥重要作用。retromer由一种膜泡分选蛋白（Vps）三聚体（包含Vps26、Vps29和 Vps35）和一些膜相关分选连接蛋白二聚体（SNX1、 SNX2、SNX5和SNX6）组成。Vps26、Vps29和 Vps35复合体可与DMT1A/B-II 而不是DMT1A/B-I异构体直接结合，并将DMT1A/B-II异构体运送至再循环内体，转铁蛋白受体1（TfR1）共定位于其中。TfR1以不依赖retromer的方式转运至再循环内体，而DMT1A/B-II在核内体完全成熟之前直接被retromer复合体识别并转运至TGN。然后DMT1A/B-II从TGN转运至再循环内体。因而，Øx（Leu/Met）x基序是再循环信号，负责DMT1A/B-II的正确核内体循环。TfR1和DMT1A/B-II在功能上是偶联的，以便使Tf结合铁（TBI）进入Tf-TfR1循环。随后TfR1和DMT1A/B-II再循环回到质膜。DMT1B-I不仅在N-末端没有质膜驻留信号，而且在C-末端也没有retromer结合位点。因此，该分子无法被retromer复合体识别，且无法逃离日渐成熟的核内体。最后它被转运至晚期内体/溶酶体。

2.2 DMT1异构体的不同表达水平

这四种DMT1异构体的蛋白表达水平在组织类型间各不相同：DMT1A-I在十二指肠和肾脏中高表达，而且吸收细胞可将食物或尿液中的非Tf结合铁（NTBI）吸收到胞质溶胶中；DMT1B-I表达于网状内皮系统并将铁从晚期内体/溶酶体转运至胞质溶胶。DMT1A-II表达于十二指肠；与其他异构体相比，其表达水平相当低。DMT1B-II表达于周围组织，并使转铁蛋白释放的铁进入再循环内体。DMT1表达模式的良好调节取决于细胞或组织类型。目前尚不清楚转录和翻译过程的细节，比如细胞如何改变不同启动子，或何种因素引发选择性剪接以产生最有效摄取铁的特异性DMT1 mRNA。

2.3 DMT1的结构

人DMT1及其同源蛋白NRAMP1在所有生命王国中都是高度保守的，因此可能具有共同的转运机制。高度同源的原核NRAMP家族成员，头葡萄球菌DMT（ScoDMT）和Eremococcus coleocola DMT（EcoDMT），与人DMT1具有30%的序列一致性并突出了NRAMP家族的高度保守性。DMT1作为二级主动转运蛋白，将二价铁的转运与相同方向的质子转运耦合，其中KM在低μM范围内。

近期，结构分析逐渐揭示了DMT1如何组织其构象变化以使铁和质子穿过转运蛋白。分析表明DMT1在由1-5个跨膜结构域和6-10个跨膜结构域组成的两个结构类似结构域之间呈假对称关系。两个结构域在膜内交织并以相反的方向排列。据推测，金属与跨膜结构域1和6中的保守金属结合残基结合，随后发生构象变化以有效地转运质子。突变分析发现，跨膜结构域6上的保守组氨酸可能在质子转运中起重要作用。仍需进一步分析来阐明从二价铁与DMT1结合，到转移至胞质溶胶铁伴侣分子中的完整机制。

3. 细胞类型特异性铁吸收

3.1 小肠铁吸收

哺乳动物从饮食中获取的铁主要有两种形式，血红素铁和非血红素铁。这两种铁被近端小肠上皮主要是十二指肠吸收。对于非血红素铁，已知二价铁比三价铁更易吸收。然而，由于饮食中的大多数非血红素铁为三价铁复合物，所以必须将其还原成二价铁，肠上皮细胞顶端膜上表达的DMT1才能成功转运。Mackie 等人发现了十二指肠细胞色素b（DcytB），其表达于刷状缘表面且具有高铁还原酶活性。DMT1A-I可与DcytB一起将来源于食物的二价铁吸收到胞质溶胶中（见图2，左）。血红素铁仅占饮食中可用铁的一小部分，但普遍认为它比非血红素铁更易吸收。饮食中的血红素可穿过顶端膜，随后被血红素氧化酶1（HO1）分解代谢（异化）。这个过程在吸收上皮的胞质溶胶中产生了二价铁。铁伴侣分子可立即捕捉到来源于血红素和非血红素铁的二价铁，然后将其从顶端转移至基底外侧（铁伴侣分子的详细机制参见第5和6节）。

图2. 细胞类型特异性铁吸收机制。

在吸收细胞中，定位于顶端膜的DMT1A-I在Dcytb高铁还原酶活性的作用下参与了非Tf结合二价铁吸收。在大多数细胞类型中包括红细胞，Tf结合铁通过Tf-TfR1途径吸收。在核内体中，低pH条件下，三价铁从Tf中释放出来，经Steap3还原为二价铁，然后定位于核内体膜的DMT1A/B-II将其输入胞质溶胶中。在吞噬细胞中，细胞吞噬受损或衰老的RBC。RBC降解产生的血红素通过定位于溶酶体膜的HRG-1转运至胞质溶胶。定位于ER胞质面的HO-CRP复合物将血红素分解为二价铁。二价铁通过FPN1输出到体液中。释放出来的铁对于新RBC的生成来说是重要的供应。血红素可经由FLVCR1输出。

随着胞质溶胶中的铁到达基底外侧膜，膜铁转运蛋白1（FPN1, SLC40A1）-铁唯一的细胞外排通道，定位于质膜的这一侧。近期的结构研究发现，FPN1有12个跨膜结构域且仅转运二价铁。膜铁转运辅助蛋白（HEPH）是一种多铜铁氧化酶，是从十二指肠肠上皮细胞基底外侧输出铁所必需的。在HEPH突变小鼠中，FPN1仍定位于基底外侧膜但HEPH仅位于核上隔室，减少了铁从肠上皮细胞输出到循环中。FPN1从肠上皮细胞输出铁后，HEPH立即将二价铁氧化为三价铁，随后被体液中的Tf捕获。经过这些步骤，铁成为了人体的一部分（见图2，左）。

3.2 红细胞通过Tf-TfR1途径进行铁吸收

大多数类型的细胞包括红细胞均利用Tf-TfR1介导的途径将铁吸收到胞质溶胶中（见图2，中）。Tf是存在于循环中的一种糖蛋白，与两个二价铁紧密结合。一旦两个全铁-Tf（holo-Tf）在质膜上与 TfR1结合，Tf-TfR1复合体就会被内吞并送至核内体，通过ATP依赖性质子泵酸化至pH 5.5-6.0。核内体酸化使三价铁与Tf的结合变弱并且铁从Tf中释放出来。核内体膜上有另一种具有高铁还原酶活性的酶，前列腺六次跨膜上皮抗原3（Steap3），是三价铁变为二价铁以便使铁穿过DMT1A/B-II所必需的。脱铁-Tf-TfR1复合体再循环回到质膜，开始另一轮 Tf-TfR1循环（见图2，中）。

3.3 吞噬细胞中的铁再循环

成人约有25万亿红细胞（RBC），每秒我们通过网状内皮系统巨噬细胞的噬红细胞作用约循环利用250万RBC。RBC通过网状内皮系统降解而回收的铁，占日常所需铁的90%以上。巨噬细胞通过以下几个步骤吞噬受损或衰老的RBC（见图2，右）：血红素（heme）从血红蛋白（RBC的主要成分）的降解产物中释放出来，并通过HRG-1转移至胞质溶胶；HRG-1是一种跨膜血红素通透酶，表达于巨噬细胞、定位于溶酶体膜。在细胞质中，HO1，位于光滑ER的胞质面，通过接收NADPH-细胞色素P450还原酶（CPR）的电子来分解代谢血红素，然后释放二价铁。FPN1高度表达于巨噬细胞，使二价铁进入循环供再利用。血浆铜蓝蛋白（CP）是另一种多铜铁氧化酶，促使二价铁氧化成三价铁，是将铁有效载入脱铁-Tf（apo-Tf）所必需的。过多细胞内血红素可导致氧化应激和膜损伤，猫白血病病毒C亚类受体相关蛋白1（FLVCR1, SLC49A1）介导血红素输出。FLVCR1有12个跨膜结构域并位于质膜中。已知 FLVCR1对于胞质溶胶中的血红素池调节很重要，也是红细胞生成不可或缺的。

有些包含铁的蛋白，比如铁蛋白，在溶酶体中降解并将铁释放到溶酶体腔中。这种铁将由 DMT1B-I或其同源NRAMP1转运，两者均定位于溶酶体膜。因此，每种DMT1异构体在适当的膜上表达，然后有效摄取和利用铁。

4. DMT1的降解

DMT1表达有两种主要调节机制：一种是mRNA通过 IRE-IRP机制稳定化，另一种是蛋白通过泛素－蛋白酶体系统降解。DMT1A/B-I的3’-非翻译区包含IRE序列。DMT1A-I可在吸收肠上皮细胞的顶端膜发挥作用，而DMT1B-I存在于晚期内体/溶酶体中回收腔中的铁。两种异构体均可通过IRE-IRP调节系统控制。DMT1A/B-II，存在于再循环内体中，在功能上与Tf-TfR1循环偶联以摄取TBI。大多数日常摄入和再循环的铁用于红系细胞产生血红素蛋白，与DMT1A/B-II偶联的 Tf-TfR1循环是这些细胞的主要铁吸收途径。DMT1A/B-II的mRNA中不包含IRE序列，因此IRE-IRP调节系统不能成为红系细胞获取铁的主要调节途径。因而，人们猜测使这些细胞表达DMT1蛋白的主要调节机制可能是转录控制和/或蛋白降解控制。

蛋白泛素化修饰在各种细胞过程中扮演重要角色。一种蛋白质通过泛素－蛋白酶体途径降解包含两个离散而又连续的步骤：通过多个泛素分子的共价结合标记底物蛋白；随后用26S蛋白酶体（由20S催化核心和19S调节复合物组成）降解标记的蛋白。作为单一分子或聚泛素链，泛素与自身和/或其他蛋白共价相连。泛素与靶蛋白的赖氨酸残基的ε-胺结合，需要经历E1（泛素激活酶）、E2（泛素结合酶）和E3（泛素连接酶）等一系列ATP依赖性酶催化步骤。E3与底物蛋白结合，并且也与E2结合形成E2-E3底物复合体。该复合体的形成和识别对于结合级联（conjugation cascade）具有最高水平的底物特异性。已知E3泛素连接酶的特点是保守的结构域，以及泛素从E2转移至底物的机制。E3主要分为三个家族，分别为真正有趣的新基因（RING）、E6AP C-末端同源（HECT）和RING-between-RING（RBR）连接酶。

已知其中一种E3连接酶，WW-HECT型E3的Nedd4家族，通过泛素化和内吞作用调节很多离子通道和受体。Nedd4是真核细胞中高度保守的基因，是E3 HECT泛素连接酶的Nedd4家族的创始成员，在人类中由9个成员组成（例如Nedd4-2、ITCH等）。Nedd4连接酶一般通过其WW结构域直接与其同类底物结合，在大多数情况下与靶蛋白中富含脯氨酸的PPxY（PY）基序相互作用。两种这样的蛋白，Nedd4家族相互作用蛋白1（NDFIP1）和NDFIP2，最初被认定为 Nedd4 WW结构域结合蛋白。NDFIP1和NDFIP2在高尔基体中普遍存在，并包含两个PPxY基序。它们作为接头蛋白通过WW-PPxY作用与 Nedd4家族连接酶相互作用，然后招募（recruit）E3连接酶到DMT1上介导DMT1的泛素化和后续降解（见图3）。铁暴露使NDFIP与DMT1之间的相互作用提高，表明这种泛素介导的DMT1降解机制对于维持铁稳态很重要。这一机制在酿酒酵母中保留下来，NDFIP样蛋白Bsd2p负调节 Smf1p-一种类似于DMT1的金属离子转运蛋白。Bsd2p招募酿酒酵母中的Nedd4同系物Rsp5，促使 Smf1p泛素化并运输至膜泡进行降解。DMT1表达通过生成和降解两个途径来严格调节。

图3. DMT1的泛素化降解机制。

NDFIP1和NDFIP2均定位于高尔基体并与DMT1结合。 通过NDFIP PPxP基序与E3连接酶WW结构域之间的相互作用，NDFIP可招募Nedd4 E3泛素连接酶，引起泛素介导的DMT1降解。

5. 铁伴侣分子PCBP2与铁转运蛋白合作进行直接铁转运

多聚胞嘧啶结合蛋白（Poly r(C) binding proteins，PCBP1-4）最初被报道为RNA结合分子。每个PCBP异构体包含三个K同源结构域（KH），这些结构域与单链RNA和DNA结合。两个连续的结构域（KH1和KH2）位于N-末端，然后是一段较长的间隔区。第三个KH结构域（KH3）位于C-末端。PCBP的KH结构域被归类为典型的1类KH，并具有一个保守的GXXG环，与RNA主链相互作用。很多报告指出 PCBP通过与靶mRNA中的单链poly r（C）基序相互作用，在转录后和翻译调节中扮演重要角色。PCBP1基因无内含子，被认为是PCBP2 mRNA经过逆转录转座插入形成的。PCBP2和PCBP1有旁系同源基因（PCBP3 和PCBP4），被认为是由于全部基因的复制事件而产生的。PCBP1与 PCBP2的序列相似性最高。在 PCBP中，只有PCBP1与PCBP2在哺乳动物细胞中普遍高水平表达。根据之前的报道，PCBP2在细胞中的真实蛋白浓度为100nM。实际上，PCBP大量表达，预计约占总蛋白的0.5%。PCBP3和PCBP4在某些组织中和在某些发展阶段低水平表达。

近来，已明确 PCBP有不同的重要功能，也就是铁结合活性以及将铁转移至其他分子。有趣的是，我们的体外实验和其他使用Pcbp2-/-小鼠进行的体内实验研究均证明，虽然PCBP2与PCBP家族的其他成员在很大程度上共享氨基酸序列，但PCBP2所起的作用并不重复。PCBP没有跨膜结构域且已知为可溶性蛋白，主要位于胞质溶胶中。然而，分馏实验发现在微粒体部分检测到相当多的PCBP2。这个结果表明PCBP2可与膜相关蛋白相互作用。有趣的是，微粒体部分中的PCBP1量比PCBP2量少。在后面的章节中，我们关注PCBP2并描述其作为铁伴侣分子的详细功能。

很多文章报道了在芬顿反应（Fenton reaction）中二价铁催化羟基自由基形成，此自由基导致细胞损伤和器官功能障碍。主要的铁转运蛋白，DMT1和FPN1，只能转移二价铁不能转移三价铁。在循环血浆中，通过FPN1输出的二价铁立即被CP或HEPH氧化成三价铁，然后与Tf结合。形成蛋白-铁复合体大大有利于减少胞质溶胶和体液中羟基自由基的产生。虽然大家都知道芬顿反应是有害的，但一般认为由DMT1吸收的或胞质溶胶中含铁蛋白降解产生的二价铁，作为胞质溶胶中的可变铁池漂浮着。因而，我们假设某些蛋白比如细胞外液中的Tf，应广泛位于胞质溶胶中且与二价铁结合，不仅使其处于非危害状态还是生物可利用的形式，因为胞质溶胶中的铁蛋白是一种铁储存分子，无法立即用于各种代谢途径。研究发现DMT1的C-末端胞质区对于新内吞再循环信号具有结构要求，而DMT1A和DMT1B的N-末端胞质区分别由99和70个氨基酸组成，其功能尚不明确。我们发现了DMT1的N-末端胞质区有一个新功能，借助这个功能DMT1可与PCBP2结合。铁耗竭而不是铁负载的PCBP2，与DMT1的结合能力很强。另一方面，铁负载的DMT1可与PCBP2相互作用，而铁耗竭的DMT1则不能（见图4，左）。一旦PCBP2表达减少，经由DMT1途径的铁吸收将显著降低。在3 Fe:1 PCBP2化学计量比、微摩尔亲和力低的情况下，PCBP2可在体外与二价铁结合。二价铁从DMT1转移至PCBP2通过两分子直接结合来实现。体外和体内实验均证明了PCBP2的KH2结构域在其与DMT1相互作用的过程中起到关键作用。据推测，铁与DMT1的铁结合位点结合，导致铁耗竭的PCBP2-DMT1复合体发生构象变化，随后直接将二价铁从DMT1转移至PCBP2并恢复原始DMT1构象状态来传递另一个铁。

结构分析证明FPN1的N-末端和C-末端区域均位于细胞胞质中。PCBP2可与FPN1的C-末端胞质区结合，其他PCBP成员不能，且KH2结构域是产生相互作用的重要区域。铁负载的PCBP2可与铁耗竭的FPN1相互作用。铁耗竭的PCBP2既不能与铁耗竭的FPN1也不能与铁负载的FPN1结合。此外，PCBP2沉默使通过FPN1输出的铁减少。也就是，铁负载的PCBP2，仅与铁耗竭的FPN1相互作用，直接将铁赠予FPN1（见图4，右）。一旦PCBP2失去铁，它将从FPN1中释放出来并与新吸收的铁结合。难以发现DMT1的N-末端胞质区与FPN1的C-末端胞质区存在任何相似性，两者分别与铁耗竭和铁负载的PCBP2特异性结合。研究表明PCBP2通过铁结合介导的某些构象变化，可能是其与两个不同胞质区结合所必需的。还需要考虑由于铁穿过分子诱导转运蛋白每个胞质区产生的构象变化。考虑到PCBP2在铁吸收和释放中的作用，推测其可能作为“网守（gateway keeper）”发挥关键作用，使铁安全地分布于铁输入蛋白/输出蛋白与胞质溶胶之间。

图4. 通过铁伴侣分子PCBP2进行安全和游离铁转运的机制。

PCBP2包含三个KH结构域，KH2结构域对于其与DMT1和FPN1结合起到重要作用。KH3结构域对于HO1-PCBP2结合很重要。铁耗竭的PCBP2（脱铁形式）可与DMT1的N-末端胞质区结合并直接接收铁。一旦 PCBP2获得了铁，铁负载的PCBP2（全铁形式）将从DMT1中释放出来。如果是FPN1，铁负载的PCBP2（全铁形式）可与FPN1的C-末端胞质区结合并直接将铁赠予FPN1。一旦PCBP2失去铁，铁耗竭的PCBP2（脱铁形式）将从FPN1中释放出来。

6. 血红素通过HO1-CPR-PCBP2代谢区室降解的机制

血红素降解和铁再循环途径主要在巨噬细胞中发挥作用。随着受损或衰老的RBC被巨噬细胞吞噬，血红蛋白结合触珠蛋白及血红素结合血液结合素分别与巨噬细胞清道夫受体CD163和低密度脂蛋白受体相关蛋白LRP/CD91结合，这些受体-配体复合物被巨噬细胞内吞。然后，RBC、血红蛋白结合触珠蛋白及血红素结合血液结合素在溶酶体中降解。HRG-1，强烈表达于巨噬细胞中并特异性定位于吞噬溶酶体膜上，对于巨噬细胞维持铁稳态是必不可少的，且在噬红细胞作用期间将血红素从溶酶体转移至胞质溶胶。哺乳动物HO酶，使用CPR赠予的电子，以分子氧为代价，将细胞内血红素分解为胆绿素、一氧化碳和二价铁。HO通过其C-末端跨膜区固定于光滑ER上，而N-末端胞质区在其对血红素分解代谢的催化活性中起到重要作用。血红素降解产生的二价铁是最大铁来源之一，尤其是在吞噬细胞或吸收肠上皮细胞中。因而，我们假设铁伴侣分子应是细胞内安全铁运送所必需的，并调节经由该代谢途径产生的二价铁。我们证明了HO家族成员，HO1和HO2，与PCBP2而不是PCBP1、PCBP3或PCBP4特异性结合，且PCBP2与CPR竞争结合HO1。在血红素负载的细胞中，血红素促使HO1-CPR复合物形成并减少了HO1-PCBP2相互作用。用纯化蛋白进行的体外实验表明，HO1在血红素存在的情况下可与PCBP2结合，而铁负载的PCBP2对HO1的亲和力显著低于铁耗竭的PCBP2。铁诱发PCBP2从HO1分离。PCBP2的KH3结构域对于HO1-PCBP2相互作用很重要。HO1和PCBP2以4:1M比例形成复合物，PCBP2可从HO1低聚体获得多个二价铁原子。总体来说，我们以前的研究提出了PCBP2通过HO1和铁转运代谢区室（metabolon）在血红素分解代谢的过程中发挥假定功能的一个综合模型（图5）。因而，我们阐明了铁相关分子（输入蛋白DMT1、输出蛋白FPN1和HO1-CPR复合物）与PCBP2之间的关系，并且自此以后将铁耗竭的PCBP2称为脱铁-PCBP2（apo-PCBP2）、铁负载的PCBP2称为全铁-PCBP2（holo-PCBP2）。HO1和CPR均定位于ER膜，在稳定状态条件下脱铁-PCBP2与HO1结合（图5）。一旦血红素穿过细胞，其可与HO1上的铁结合位点结合。这是开始血红素降解过程的第一个“触发事件”。血红素与HO1上的血红素结合位点结合，然后引起该酶发生构象变化。HO1和CRP可通过其胞质区形成复合物，这一变化促使CRP与HO1紧密结合以转移电子来降解血红素，并使脱铁-PCBP2分离。血红素降解后，CRP与HO1分离而脱铁-PCBP2与HO1结合以接收释放的二价铁。在血红素降解过程的最后一步，全铁-PCBP2与HO1分离，将其金属离子转移至其他蛋白受体。全体-PCBP2分离后，另一个脱铁-PCBP2分子与HO1结合。PCBP2主要存在于胞质溶胶中，能够回收血红素在ER的胞质面降解产生的二价铁。用血红素孵育细胞后，PCBP2改变了其亚细胞分布，导致微粒体部分的水平下降而胞质溶胶中的水平升高。假设脱铁-或全铁-PCBP2与HO1相互作用，以确保PCBP2留在HO1和CPR的微环境中。虽然PCBP2不是HO1的血红素降解活性所必需的，但其作为蛋白整合复合物的一部分起到一定作用，形成了功能性代谢区室（HO1-CPR-PCBP2）以防止在胞质溶胶中产生游离/不稳定的铁（见图5）。未来仍需研究其中涉及的精确分子过程。

图5. 血红素通过HO-CPR-PCBP2代谢区室降解的机制。

一旦血红素穿过细胞，其可与HO1上的血红素结合位点结合。血红素与HO1结合改变了HO1结构，使CRP与HO1紧密结合并转移电子来降解血红素。HO1的构象变化导致HO1-PCBP2分离。然后，CPR与HO1快速分离，铁耗竭的PCBP2（脱铁PCBP2）与HO1结合来接收释放的二价铁。在最后一步，铁负载的PCBP2（全铁-PCBP2）与HO1分离，将其金属离子转移至其他蛋白受体。全体-PCBP2分离后，另一个脱铁-PCBP2分子与HO1结合。本示意图引自参考文献并做了修改。

7. 其他铁转运蛋白

众所周知，DMT1是细胞中最重要的铁转运蛋白。近期发现，很明显其他铁转运蛋白也在铁转运过程中发挥一定作用。

NRAMP1（SLC11A1）是DMT1的旁系同源蛋白，具有65%的氨基酸序列一致性，主要表达于巨噬细胞。在溶酶体膜和含病原体的吞噬体中也发现了它，它参与了抗沙门氏菌、利什曼虫和分枝杆菌的促炎症反应。NRAMP1以及DMT1均有12个跨膜结构域，并表现出铁转运活性。它从吞噬体输出铁到胞质溶胶中，通过减少细菌所需的铁而有助于抑制细胞内细菌生长。仍不清楚哪些蛋白可与 NRAMP1结合并充当铁受体。未来有必要对 NRAMP1铁转运活性进行研究，以阐明控制对吞噬细胞中细胞内病原体的先天免疫或易感性的促炎症反应机制。

SLC39A蛋白是在所有系统发育水平的生物体中发现的金属离子转运蛋白的更广泛ZRT-、IRT样蛋白（ZIP）家族的成员。有14种SLC39A相关蛋白由人类基因组编码，且大多数ZIP转运蛋白有8个预测跨膜结构域和1个相似的预测拓扑学，其中该蛋白的N-和C-末端位于质膜的外表面。已发现ZIP蛋白将金属离子从细胞外部或细胞内胞器腔转运至胞质溶胶。据报道，某些ZIP蛋白，尤其是ZIP8、ZIP13和ZIP14作为铁转运蛋白具有重要作用。ZIP8与ZIP14有50%的氨基酸序列相同，并主要位于质膜以帮助转运NTBI。DMT1在pH 5-6时铁转运活性最强，但ZIP14在pH 7.5时活性最强，使其非常适合吸收血浆中的铁，比如循环中的NTBI。某些小鼠研究表明血浆NTBI被肝脏和胰腺快速清除。DMT1A-I，定位于质膜，其表达水平在肝脏和胰腺中均非常低，而ZIP14却大量存在于这些组织中。这些研究证明在肝脏和胰腺中，NTBI主要通过ZIP14而不是DMT1被肝细胞和腺泡细胞吸收。据报道，ZIP13定位于ER/高尔基体，其N-和C-末端均位于腔测，负责将锌从小鼠细胞的ER/高尔基体转入胞质溶胶。ZIP13也参与了铁从胞质溶胶转移至分泌室，而且在人类中其突变体可由于ER中铁缺乏而导致胶原合成异常。ER是胶原合成后修饰的场所。赖氨酰羟化酶和脯氨酰4-羟化酶分别促使胶原中的赖氨酰和脯氨酰残基羟基化。这两种酶，需要二价铁作为辅因子，均存在于分泌室ER的腔中以便胶原合成。另外，ZIP13有一些其他ZIP家族成员没有的结构域。最近有人报道了ER与胞质溶胶之间铁转运的重要性，很明显ZIP蛋白对铁转运贡献很大。我们近期的发现表明PCBP2起到网守的作用，可与DMT1或FPN1转运蛋白结合，但ZIP金属离子转运蛋白与铁伴侣分子蛋白之间的相互作用仍然是未知的。未来研究需要关注ZIP蛋白如何接收胞质溶胶中的铁或如何将铁释放到胞质溶胶中。

8. 结论

本文概述了DMT1和近期发现的铁伴侣分子PCBP2（见图6）。铁稳态的调节非常严格，且主要的铁输入蛋白DMT1有3种调节方式：

1）通过 IRE-IRP结合进行翻译调节；

2）根据铁水平进行泛素化降解；

3）PCBP2作为网守的作用。

人类具有出色的多种调节系统，使铁水平维持在较窄的范围内。

6. 铁转运的精妙机制。

总而言之，PCBP2参与了所有三种铁吸收途径；通过DMT1A-I吸收NTBI，通过DMT1A/B-II吸收TBI以及通过HO使血红素降解释放出铁。此外，PCBP2可将铁转移至铁输出蛋白FPN1。PCBP2作为铁“网守”起到重要作用。本示意图引自参考文献并做了修改。

如何安全转移二价铁的机制使科学家们困惑了很多年。以铜为例，多种伴侣蛋白参与铜转运且每种伴侣蛋白具有特异性结合伙伴。PCBP是目前已知的唯一铁伴侣分子，一些不同的蛋白也可能作为铁伴侣分子。线粒体是细胞中的主要铁消费者，但尚不清楚铁是如何到达线粒体的。一些报道表明，铁从含有Tf的核内体直接转移到线粒体，以及通过核内体和线粒体之间可能的直接接触绕过胞质溶胶，可能是红系细胞中线粒体的铁转运途径。然而，这一机制对促使铁流入线粒体的作用大小以及在非红系细胞中是否有用尚不明确。当细胞负载血红素时，胞质溶胶和线粒体中的铁池水平升高。这表明血红素降解产生的二价铁最初释放进入胞质溶胶，然后转移至线粒体。应当有一个特殊途径将胞质溶胶中的铁，尤其是血红素在胞质溶胶中降解产生的铁，转运至线粒体或FPN1。铁不仅是血红素和线粒体中产生的铁硫簇所必需的，也是各种细胞质和核功能所必需的。为了明确所有细胞类型中的铁稳态机制，有必要揭露铁转运蛋白和铁伴侣分子的调节。