病 毒 包 膜 在HEV生命周期中的作用

1. 简介

戊型肝炎病毒（HEV）感染是世界范围内引起急性肝炎的主要原因之一。HEV是戊型肝炎病毒科Orthohepevirus病毒属的唯一成员。人感染的HEV病毒至少有四个主要基因型。基因型1和2仅感染人，是发展中国家病毒大型水传播爆发的主要原因。基因型3和4是工业化国家的本地型病毒，感染多为动物传染病。HEV感染通常具有自限性但是能引起多种肝脏疾病包括爆发性肝炎。此外，有报告称免疫功能不全患者能出现HEV基因型3持续感染并能导致肝硬化快速进展。血液供给也发现了HEV感染，产生血液接触传播的可能性。

25年前小型RNA病毒被发现时曾一度被视为无包膜病毒。粪便中的病毒粒子是裸露的，但是最近的研究发现血流中循环的病毒覆盖在宿主的细胞膜下。这些新型病毒粒子具有传染性，但是其不携带表面病毒抗原，对标准中和疗法的中和抗体具有完全的耐受性。这种双重生命周期和甲型肝炎病毒（HAV）类似，另一种系统发生的趋肝病毒和HEV无关。我们最近发现HAV是以包膜的形式存在与血液中，但是脱落在粪便中时是裸露病毒。这些发现的新型包膜型病毒粒子称为“半包膜”病毒粒子，使其感染的基础生物学产生了一系列的问题。在这篇文章中，我们侧重于HEV并讨论了这种包膜对其生命周期的潜在影响。

HEV包膜：一种新型非胞溶性病毒释放和免疫逃避机制

HEV最初从患者粪便中分离出来，通过免疫电子显微镜目测被分为无包膜粒子。这种病毒粒子的直径为27-34nm并具有20面体的形态。衣壳结构类似于杯状病毒，因为HEV最初被误分类为杯状病毒科成员。1990年通过HEV基因组分子克隆，人们认识到：它的衣壳是由病毒开放解读码框（ORF）编码的单一病毒蛋白组成。每个衣壳包括180个ORF2拷贝排成具有T=3对称性的20面体。基于与其他病毒类似的序列和结构，衣壳分为3个域：外壳域（S），中域（M）和突出域（P）。S域形成连续的衣壳外壳，是HEV基因型最保守的区域。P域是中和抗体的主要目标，包含普遍公认的表面细胞受体结合域。

裸露的HEV病毒粒子在粪便中被发现，具有大约1.27g/mL的浮力密度。但是Takahashi及其同事发现培养上清液内的HEV的密度显著较低（大约1.25g/mL）。后续的研究证明血液循环或培养上清液中的HEV粒子被包裹在宿主衍生的细胞膜下。这些膜相关HEV粒子表面缺乏可检测的病毒蛋白并对血清中的中和抗体具有高度的耐受性；因此被称为半包膜HEV或eHEV。从进化的观点来看，HEV包裹在宿主细胞膜内能让病毒具有一些优势。无包膜病毒一般通过感染细胞溶解释放，能从感染病毒的细胞处发出免疫刺激危险信号。但是HEV在释出（exit）期间通过隐藏于宿主源的细胞膜中，能够通过非胞溶性方式释出细胞，依据是HEV感染细胞没有发生细胞病变效应。通过避免细胞溶解，HEV降低了危险信号的水平。

不仅如此，由于宿主细胞膜完全覆盖了病毒抗原，抗体不能结合并中和循环的病毒粒子。显然绝大部分从感染HEV病毒的细胞中释放的病毒粒子被包裹住了，但并不是全部，而且不能沉淀并通过康复期的人血清中和，除非先用去污剂破坏病毒粒子。可以详细分析培养细胞中释放eHEV的过程，理解HEV包膜机制及其对病毒生命周期的影响。

2. 包膜HEV粒子的生物起源

7.2kb正链HEV基因组编码3种蛋白：ORF1、ORF2和ORF3。ORF1是一种大型无结构蛋白，参与HEV RNA的复制。ORF2是一种72KD衣壳蛋白，需要病毒装配和受体结合。第3种病毒蛋白ORF3是一种小型多功能蛋白，对于病毒外出（virus egress）必不可少。ORF3的羧基端包含保守的PSAP（即氨基酸脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸和脯氨酸）晚期结构域和模体，ORF3与肿瘤易感基因101（Tsg101）蛋白相互作用。Tsg101是一种细胞内涵体分选复合物（ESCRT），参与许多包膜病毒的发芽。这种相互作用可能会促进新装配HEV病毒粒子发芽，形成多泡体（MVB）。如果真是这样，那么MVB内包膜的病毒粒子和可能会在MVB浆膜发生胞溶时从细胞中释放出来（图1）。和这一模型一致，Rab27和Hrs，核外分泌物质，以及空泡蛋白分选相关蛋白4（Vsp4），一种从包膜剥夺ESCRT成分的ATP酶，需要HEV出口。此外，CD63和CD81，普遍存在的外来体标志物，已经显示与半包膜HEV病毒粒子有关，进一步表明HEV劫持核外途径流出。这和它在介导HEV释放中发挥的关键作用一致，eHEV内而不是在无包膜HEV粒子中发现了ORF3。

尽管现有证据表明HEV释放以来细胞ESCRT机制，但是eHEV包膜的起源仍不确定。最近一项研究推断该包膜是从反面高尔基网（TGN）中衍生出来的，因为它包含TGN 蛋白质2（TGOLN2）。由于TGOLN2在TGN和内吞层中间循环，膜蛋白有可能通过膜泡运输作用，被运输到MVB中 并“意外地”并入eHEV包膜。通过对完整蛋白质和油脂构成以及eHEV膜成分数量的测定以及它与核外胞膜的比较很可能得到对eHEV膜以及HEV包膜机制更清楚的理解。

图1. eHEV生物起源模型。感染晚期，HEV衣壳在细胞质和壳体化病毒基因组中装配。ORF3与Tsg101（一种ESCRT相关蛋白质）以及病毒衣壳发生相互作用，将病毒衣壳的出芽导入多泡体（MVB）内。ESCRT机制的其他成分，包括Hrs和Vps4，也参与eHEV释放。半包膜HEV粒子随后从感染的细胞内因MVB浆膜胞溶反应释放，这一过程受Rab27和其他宿主因子如SNARE/SNAP控制。eHEV膜的起源仍然未知，但是可能是内部胞器如反面高尔基网的衍生物。

3. 包膜对HEV细胞进入和扩散的影响

假设eHEV和HEV存在不同，很可能是这两种形式使用不同的机制进入目标细胞。对于无包膜的HEV而言，最初的细胞接触可能通过硫酸类肝素多糖蛋白介导，这种物质在多种类型细胞的表面表达并参与包膜和无包膜病毒的接触。但是，无包膜HEV感染对硫酸乙酰肝素的竞争敏感，但eHEV却不会。通过延迟的结合动力学与无包膜的病毒比较时，eHEV的细胞接触也不足，这很有可能是缺乏特异病毒-细胞相互反应的结果。与这次体外观察一致，使用移植了人肝细胞的uPA-SCID小鼠进行测试时，来源于血清或细胞培养的有包膜的HEV，感染性比无包膜的粪便病毒弱。

细胞接触后，无包膜和有包膜的HEV病毒粒子通过网格蛋白和动力蛋白2的途径内化。但是，后续步骤不同。eHEV进入关键取决于早期-晚期体运输和和酸化作用，儿无包膜HEV却不是这样。不仅如此，通过消耗C型1类尼曼匹克蛋白（NPC1）或使用溶酶体酸性脂肪酶（LAL）阻断溶酶体内的脂质降解，能减少eHEV的进入，但却无法减少无包膜HEV的进入。这些结果表明：eHEV包膜在内吞溶酶体内降解，这是一个能暴露衣壳的步骤，使得其能结合受体。因此，无包膜和有包膜HEV粒子在该点位的渗透呈现不同模式：eHEV渗透进入内吞溶酶体，但是HEV的渗透很有可能发生在或浆膜内或浆膜附近（图2）。

图2. HEV进入和扩散的拟建模型。无包膜HEV病毒粒子（HEV）通过口腔获得并通过未知机制进入血流。它们感染，渗透并接着从细胞单层膜基底侧（窦状腺）肝细胞进入血流，这和半包膜HEV（eHEV）一致。eHEV在肝内介导后续步骤。病毒粒子也从感染肝细胞的顶端（胆小管）一侧释放并通过胆道排出进入粪便中。无包膜和有包膜HEV粒子通过独特的途径进入细胞内，但是可能使用相同的假定细胞受体（紫色），这些受体位于细胞表面和内吞体膜。EE，早期内体；LE，晚期内体；N，细胞核。

4. 包膜对HEV宿主间传播的影响

HEV最初通过肠道传播。随后通过摄入传播，HEV通过定义不明的机制进入肠道。尽管人类肠道似乎是HEV的首要目标，但是没有确凿的证据表明HEV进入并在人类肠道细胞内复制。随后，HEV进入血流并被携带到它的主要靶器官肝脏，在这里病毒在肝细胞内繁殖。新合成的病毒粒子从顶端（胆小管）和被感染细胞的单层膜基底侧（窦状腺）释放。然而一些病毒粒子在基底外侧膜（以eHEV形式）释放到窦状腺血液内并重新进入循环系统，大量的病毒通过顶端表面进入胆小管，在这里病毒进入胆道并随后脱落在粪便中。

在胆汁和粪便中仅检测到了无包膜HEV病毒粒子，但是这种从肝细胞顶端表面释放的HEV病毒粒子很有可能是有包膜的HEV有趣的是，最近使用人源化小鼠的研究表明ORF3主要从顶端膜释放。这种可能性与一项研究抑制，该研究显示ORF3主要位于感染HEV的Caco2细胞（一种人肠道细胞系）的顶端表面。从顶端和肝细胞微管释放的eHEV将进入胆汁。使用人胆汁培养的eHEV导致eHEV密度增大，表明胆汁去垢剂能使eHEV膜降解，导致粪便内出现无包膜HEV。

除了粪口途径，传播产生了一种HEV人-人传播途径。已经在血液成分中发现了传染性HEV，并导致输血的免疫功能不全患者产生HEV持续感染。最近的研究发现与从粪便中得到的HEV相比，合体小鼠血清衍生HEV的传染性较弱。由于培养基和血清中的HEV粒子被宿主的细胞膜包裹，包膜可能减少了其与受体细胞的接触，因此降低了感染风险。

5. 包膜对HEV感染相关肝外现象的影响

一些肝外症状与HEV感染有关，包括神经病学、肾脏和风湿病症状。慢性HEV感染患者的尿液中持续检出HEV RNA和抗原，这表明HEV能在肾脏中复制并导致肾功能不全。脑脊液中也检出了HEV RNA和抗原。不仅如此，HEV能在人胎盘细胞和神经元衍生细胞内复制。尽管缺乏HEV在这些组织中发生复制的确凿证据，但是大量的宿主细胞都能通过细胞膜覆盖保护HEV细胞。由于它在血液中的外来体样半包膜结构，eHEV能被不同细胞的内吞作用占据而不依赖病毒受体，但这一导致感染的过程尚不明了。此外，包膜HEV病毒粒子和外来体具有相似性表明eHEV有作为外来体免疫渗透如中枢神经系统等特殊位点的可能。

6. 结论

血液循环中包膜HEV的发现从根本上改变了病毒感染机制和发病机理的概念。加入缺乏针对HEV的特殊疗法，对HEV感染中包膜的作用有更好的理解有助于鉴别治疗介入的目标。未来的研究能够对eHEV包膜的起源和成分以及eHEV释放和再进入细胞的宿主因子/途径有更深入的理解。随着细胞培养系统的进步以及人源嵌合体小鼠模型的发展，在不久的将来有望更详细地揭示HEV包膜这一新的现象。

（摘自viruses，版权归其所有，仅供内部参考）

编译：张凯

审校：王小茜