人类HPgV-2： 新发现的与HCV感染相关的血源性病毒

摘      要

丙型肝炎病毒（HCV）和人类pegivirus病毒（HPgV，以前称之为GBV-C），分别是黄病毒科，丙型肝炎病毒属和Pegivirus病毒属唯一已知的人类病毒。最近从一位HCV感染患者的血浆中，通过下一代测序技术发现了第二种pegivirus，命名为人类pegivirus2（HPgV-2）；这位患者有过多次血源性暴露，死于病因不明的败血症。HPgV-2具有高度发散性，位于包括啮齿类和蝙蝠pegiviruses的进化枝的深层系统发育分支，与其氨基酸同源性<32%。同时，开发和确认了可高通量筛选血浆样品的分子学和血清学工具，由3个独立的血清学标志物组成的标志物组合将抗体应答与病毒RNA阳性紧密联系起来（99.9%阴性预测值）。从2440例筛查样品中发现另外11例RNA阳性样品（0.45%），结果显示HPgV-2病毒毒株之间的核苷酸同源性达到93%-94%。全部12例HPgV-2 RNA阳性患者均来自于HCV RNA阳性的个体（12/983；1.22%），包括2例HIV共感染样品；在非HCV感染个体中均没有检出HPgV-2 RNA（p<0.0001），包括只感染了HIV（p=0.0075）或HBV（p=0.0077）的个体；在无偿献血者中也没有检出HPgV-2 RNA（p=0.0082）。75%（9/12）的HPgV-2 RNA阳性样品发生病毒血清学标志物抗体反应，而只有1.15%（28/2429）的HPgV-2 RNA阴性样品是血清反应阳性。两个个体的纵向采样显示虽然存在病毒特异性抗体，活动性HPgV-2 感染仍可在血液中至少持续7周。一个个体同时含有HPgV-2 RNA和HCV RNA，却发现两种病毒的血清反应均为阴性，表明从急性共传播事件中，同时感染HCV和HPgV-2 的可能性较高。总之，HPgV-2是一种新的人类血源性传染病毒，很可能通过非肠道途径传播。

简      介

已知感染人类的丙型肝炎病毒属和Pegivirus病毒属成员只有丙型肝炎病毒（HCV）和人类pegivirus（HPgV-1/GBV-C）。HCV感染了全世界约3%的人口，可引起肝损伤，导致肝硬化、肝细胞癌和肝脏移植。相比之下，尽管HPgV感染在血源性暴露风险较高的人群中流行率超过40%，但是并不致病。虽然具有争议性，但是据相关报道，HPgV和HIV共感染会延迟进展为AIDS，可能原因是减少了HIV复制或扰乱了宿主的免疫应答。同时，埃博拉病毒患者共感染HPgV与存活率提高有关。

先前发现的动物丙型肝炎病毒属和pegiviruses多见于动物传染源，包括蝙蝠、啮齿类、奶牛和马。人类丙型肝炎病毒属比如HCV和GBV-B是已确定的肝炎病原体，而传统的pegiviruses分类标准包括系统发育关系、宿主持续感染，但是缺乏非常重要的因素-致病性。但是，泰勒氏病相关病毒（EPgV-TDAV）是一种与马急性肝炎爆发相关的新型pegivirus，该病毒的发现，证明这种普遍分类方法是错误的，而且表明pegivirus病毒属中至少有一个病毒会导致其动物宿主发生肝炎。

无偏性宏基因组下一代测序（NGS）是检测和发现新病原体的既定方法，新病原体具有高度发散性，因而使用传统的分子学方法检测不到。我们采用了NGS和以测序为基础的超速病原体鉴别（SURPI）生物信息学途径进行病原体检测，从一位HCV感染患者（死于原因不明的败血症和多器官衰竭）鉴别出一种新的pegivirus，暂时称之为HPgV-2。后续的系统发育关系、PCR和血清学分析证实了HPgV-2是一种新的人类血源性传染病毒。

结      论

在一位肝炎患者中发现新的pegivirus并进行全基因组测序。用无偏性宏基因组NGS筛查在芝加哥大学医疗中心招募的慢性肝病患者（n=169），以鉴别潜在的新型病因学。在旧金山加利福尼亚大学执行宏基因组NGS和SURPI分析，从一位患者的血浆样品鉴别出3个reads，然后被组装成两个连续的contigs，与猿猴pegivirus A（SPgV-A/GBV-A）的氨基酸同源性接近60%（图1A）。随后从这份样品生成了另外1340万原始宏基因组序列，对应这种新pegivirus的537个reads（通过将BLASTx翻译的核苷酸与SPgV-A、GBV-B、HPgV和牛pegivirus/BPgV蛋白质比对来鉴别）用PRICE重新组装成10个contigs，占假定病毒基因组的40%以上（图1B）。根据这些contigs重新绘制NGS数据（图1C），接着进行PCR和Sanger测序来填补余下的序列空位，并获得几乎完整的基因组草图（图1D）。

图1. HPgV-2的发现和全基因组特征。（A）从死于腹部败血症的HCV感染者（索引病例）的血浆样品中检测出3个NGS reads，与SPgV-A/GBV-A的远源氨基酸同源性<60%，其中两个reads是重叠的。（B）使用BLASTx将已鉴别的 HPgV-2 reads重新组装生成的初始contigs集合与其它pegivirus基因组比对。（C）先用PCR再用Sanger测序填补序列空位。（D）覆盖图，将初始NGS数据映射到几乎完整（>98%）组装的基因组草图。（E）覆盖图，使用RACE获得5’和3’末端后，将后来测序的NGS数据映射到完整的 HPgV-2基因组。（F） HPgV-2的基因组排列。多蛋白内的假定剪切位点用黑三角（结构蛋白）或空三角（非结构蛋白）表示。箭头表示预测的N-连接（红色）或O-连接（蓝色）糖基化位点。

索引病例UC0125.US，是一位70岁的女性，具有镰状细胞病（SCD）、高血压、HCV感染和慢性肾功能不全史，2011年10月由于腹痛到芝加哥大学医疗中心就诊。该患者入院数天后发生快速失代偿，对其进行紧急腹部手术探查，结果发现继发于肠系膜缺血的爆发性结肠炎与胃肠感染。她在入院2.5周后由于败血症和多器官衰竭死亡。尸检报告显示腹部大范围出血性坏死以及符合慢性HCV感染的三期肝纤维化。

这位患者从事纺织行业，具有饮酒及静脉药瘾（IVDU）史。最初她在1998年被诊断为HCV基因型1a感染，1999年用干扰素-α治疗失败，导致2000-2009年转氨酶长期升高，HCV病毒载量为22.6万-1268.5万copies/ml。2003年4月肝脏活检显示轻度汇管区炎症和继发于慢性HCV感染的一期纤维化，2006年和2009年重复活检显示纤维化进展。需要注意的是，该患者由于SCD导致的反复脉管阻塞性危象做过多次换血和输血。最初鉴别到pegivirus序列的血浆样品是该患者在2008年8月28日采集的。

为了证实存在一种新的pegivirus并排除污染的可能性，在雅培实验室单独处理同一天（2008年8月28日）从索引病例收集的另一等份血浆。宏基因组NGS产生了249,693个reads，占基因组草图16,306,796个序列的1.53%。这些reads涵盖了预测完整基因组的98.4%，平均深度是每个核苷酸3,314X±426个reads（图1E）。这个单独组装的共有基因组与基因组草图的同源性达到99.73%，其中不匹配是由于保守序列或分解为不明确的碱基，5’端通过另外306个核苷酸延伸。由于其与pegivirus的结构和系统发育相似性，我们暂时将这种新病毒称为人类pegivirus 2（HPgV-2，毒株UC0125.US），符合近期建立的标准。

该研究还确定了HPgV-2毒株多样性和系统发育等信息，并应用新开发的血清学和分子学诊断工具发现了另外的HPgV-2毒株。整体来说，在我们的研究中，1458例非HCV感染样品都不是HPgV-2 RNA阳性，包括从488位HBV NAT+/Ag+感染个体、494位HIV NAT+/Ab+单一感染个体和476位无偿献血者获得的样品。但是，在每个非HCV感染组，0.8%-1.3%的样品具有HPgV-2血清反应。因而，HPgV-2 RNA检测在HCV+（n=982）与非HCV感染（n=1458）样品之间具有统计学差异（经Fisher精确检验，p值<0.0001）。在所有被测组，HPgV-2病毒血症发生的频率也显著低于HPgV-1病毒血症的频率（经McNemar检验，p值<0.0027）。

讨      论

本文报道了最新鉴定的第二种人类pegivirus，即HPgV-2，从12个病毒株中获得8个全基因组和4个部分基因组序列，所有病毒株均来自HCV感染患者。HPgV-2具有高度发散性，与其它pegivirus的氨基酸同源性<32%。需要注意的是，在494位HIV 单一感染个体、488位HBV感染个体和476位无偿献血者中没有发现活动性HPgV-2感染，相比之下，在983位HCV感染个体中，12位检测到HPgV-2（p<0.0001）。观察到的整体核苷酸多样性（病毒株之间的同源性在93.0%-94.4%），以及直接检测到多种蛋白的抗体，确定了HPgV-2是一种真正的人类传染原。

重要的是，本研究鉴别出的所有HPgV-2案例都是与HCV共感染。与HCV的关联具有统计学意义（p<0.0001），但可能不是排他的，因为观察到在非HCV感染个体中HPgV-2血清反应性的频率较低。血清反应HCV阴性个体的HPgV-2感染假定清除提高了HCV共感染促使HPgV-2持续存在的可能性。有趣的是，pegivirus和丙型肝炎病毒属共感染在马中也被发现。人类HPgV-2共感染是否影响HCV感染的自然史或进程是大家感兴趣的，但是明确HPgV-2的致病潜力很可能被其与HCV的关联所混淆。至今检测的所有HCV阳性样品都来自于美国；需要继续研究来确定HPgV-2病毒血症的全球流行率和其序列多样性的完整范围。既然血清学能够检测既往和近期感染，那么未来完善HPgV-2血清学诊断试验对于明确人类HPgV-2感染的真实流行率至关重要。

迄今的研究表明对应每种哺乳类宿主的pegivirus进化谱系倾向于聚集在一起，与该病毒及其宿主的共发散性模型一致。我们报告的至少12株感染人类的HPgV-2符合这个模式，每个病毒株与另一个病毒株的同源性约94%。目前80多个新的丙型肝炎病毒属和pegiviruses被报告见于蝙蝠，还有多种新型丙型肝炎病毒属见于啮齿类、牛和马，强调了这些病毒在动物传染源中的非凡多样性。因而，HPgV-2是出现于pegiviruses进化历史的早期还是近期由哺乳类传染源的动物传染病溢出事件所致仍待确定。但是与HCV基因型高度多样性相比，个体病毒株之间的序列同源性较高表示地理采样偏差或人类种群最近引入HPgV-2。需要流行病学和基因组学研究来查明HPgV-2的精确进化起源。

节选自刊登在Plos Pathogens中的Discovery of a Novel Human Pegivirus in Blood Associated with Hepatitis C Virus Co-Infection一文

参考文献略

 雅培贸易（上海）有限公司 供稿