【新型冠状病毒】新型冠状病毒肺炎核酸检测现状及研究进展

一、新型冠状病毒肺炎临床表现及诊断标准

新型冠状病毒是β属直径60～140 nm的单股正链RNA病毒，其基因特征与严重急性呼吸综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARSr-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERSr-CoV）有明显区别，与蝙蝠SARS（severe acute respiratory syndrome）样冠状病毒（bat-derived severe acute respiratory syndrome-like coronaviruses CoVZC45，bat-SL-CoVZC45）同源性为85%^[5]。研究发现^[7]仅2019-nCoV的B谱系β冠状病毒S蛋白的受体结合域（receptor-binding domain，RBD）分支1能够与血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2,ACE2）结合，感染人体后出现发热、呼吸困难等症状，同时出现白细胞总数正常或降低及淋巴细胞计数减少、影像学表现等。Xu等^[2]（王福生院士团队）对首例新型冠状病毒肺炎死亡患者进行解剖，发现肺部表现为弥漫性肺泡损伤和肺透明膜形成，符合急性呼吸窘迫综合征表现，与SARS和MERS冠状病毒感染的病理特征相似，重者可危及生命。2019-nCoV确诊须病原学检测呈阳性，即实时荧光逆转录-聚合酶链反应（reverse transcriptase–polymerase chain reaction,RT-PCR）检测2019-nCoV核酸阳性，或病毒基因测序与已知新型冠状病毒高度同源^[5]。另外，2019-nCoV对热敏感，56 ℃ 30 min等均可灭活，已有研究证实56 ℃ 30 min和75%乙醇对咽拭子核酸检测结果无明显影响^[8]。

二、2019-nCoV核酸检测

目前使用的2019-nCoV核酸检测方法检测原理及结果的展示方式不同，各有优势。但目前部分试剂盒灵敏度不足，因此有企业利用其他技术方法，如数字PCR技术、基因编辑技术、等温扩增技术、床旁检测（point of care testing，POCT）技术等，研发相应产品，与现有方法形成优势互补^[9]。

（一）实时荧光定量RT-PCR技术

1.检测原理及应用现状：实时荧光定量RT-PCR是目前临床上新型冠状病毒肺炎主要的确诊方法，其基本原理是通过荧光标记的特异性探针，通过对反应过程中PCR产物的标记跟踪，实时监测产物量的增长，根据扩增曲线计算得出起始模板量。2019-nCoV基因组包含5′端的复制酶编码基因[开放读码框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）]和结构蛋白编码基因[刺突编码基因（spike protein，S）、包膜编码基因（envelope protein，E）、膜蛋白编码基因（membrane protein，M）和核衣壳编码基因（nucleocapsid protein，N][10]。根据与其他冠状病毒核酸序列比对发现，ORF1ab片段和N基因分别是冠状病毒属和型别特异性基因。针对这两个基因设计特异性引物来检测2019-nCoV，有的试剂中还加入了S基因，以期提高检测敏感性。与基因测序相比，其检测时间相对较短、操作较便捷，特异性性及重复性更好[11]。Chu等[12]实验表明，检测N基因的灵敏度更高。Corman等[13]对2019-nCoV的检测进行优化，建立了实时荧光定量RT-PCR检测流程。阳性病例确诊需要同一标本两个靶标均阳性，或者两种标本同一靶标均阳性，或者同一标本同一靶标两次阳性。疫情发生后，各科研单位及企业快速参与其中，结合自身的优势，以最快的速度研发核酸检测试剂盒，包括一步法和两步法RT-PCR，其各有优缺点，工作中应根据实际情况进行选择应用。国家药品监督管理局也加快了审批速度，于1月26日应急审批4个2019-nCoV核酸检测试剂产品，其后又持续审批了4个产品。这有助于快速确诊感染病例，对患者的治疗及疫情防控起到了至关重要的作用。

2.质量控制：由于疫情紧张，所批准试剂没有进行足够的性能验证，造成检测能力参差不齐。里进等[14]用2个厂家试剂检测255份标本，发现两试剂结果一致的符合率仅为77.25%，同时发现采样管中保存液成分不同会造成假阴性结果。因此应当在检验各环节进行质量控制，尽量采集发病早期下呼吸道标本，留取痰液，而口咽等部位的标本质量会差一些，建议多部位采样，正确保存运输，并尽快送检。在检测时，各试剂盒推荐的标本处理及核酸提取方法不同会导致RNA提取效率不同。另外实验操作中工作人员需个人三级生物安全防护，穿防护服操作极不方便，建议在生物安全柜内使用自动核酸提取仪。国家卫生健康委临检中心也开展了2019-nCoV核酸检测室间质量评价，样本为自主研发的无生物传染危险性噬菌体病毒样颗粒，来评价各实验室检测结果的可比性或准确性、检测特异性和分析敏感性等。作者所在的齐鲁医院检验科也参加了国家及山东省统一的室间质评，使用目前获批的5个试剂盒进行检测，发现虽然均能检出质控品，但部分试剂准确性、灵敏度、重复性欠佳，不同试剂盒对弱阳性标本检测能力存在差别。在结果分析时除按照规定进行报告外，还应加强临床沟通，考虑多方因素影响，如PCR抑制物的存在、患者用药物情况等[14]。

3.局限性：目前所用的核酸检测试剂盒最低检出限大多在500～1 000拷贝数/ml，少数可达到200拷贝数/ml，灵敏度不足。如果临床鼻咽拭子采样存在问题，或者在病毒感染初期病毒含量低等情况，都可导致核酸检测出现假阴性，因此临床上在可能的情况下可通过采集下呼吸道分泌物、肺泡灌洗液等，提高阳性检出率。但对于传染病来说，假阴性的结果导致感染者漏检，如果管理不当，易发生传染继续播散，这就要求后续的试剂盒研发及优化时，应在不降低特异性的条件下，不断提高检测灵敏度，提高检出率。

（二）其他核酸检测技术

1.基因测序：基因测序技术在疫情初期甄别病原体中起到了至关重要的作用，也为后续基因扩增检测2019-nCoV的开展提供了特异性基因组序列信息。任丽丽等[15]对5份肺泡灌洗液进行Illumina二代测序，同时利用电镜等手段进行形态学确认，鉴定出单独进化分支的2019-nCoV序列。Zhu等[16]（谭文杰教授团队）联合Illumina和nanopore两大测序平台，对4份肺泡灌洗液病毒基因鉴定，也得到了相似结论。目前研究者可以在GISAID、GenBank等平台下载2019-nCoV的基因组序列，患者的病毒基因组测序结果如果和已公布的新型冠状病毒基因序列高度同源，则可作为确诊的依据。但基因测序存在仪器昂贵、操作复杂、耗时长、需要专业人员进行分析等不足，无法在临床上大范围的推广利用[17]。因此，基因测序可用于临床高度疑似、但RT-PCR检测阴性患者的确认，同时也可进一步获得病毒是否发生变异等信息，为后续的疫苗、药物研发等提供数据。

2.数字PCR技术：数字PCR技术克服了荧光PCR不能绝对定量的缺点，且结果不依赖CT值，不采用内参基因和标准曲线，直接给出待测核酸的浓度，实现了绝对定量[18]，具有准确度高、重现性好等优点，目前有结合了油包水微液滴结构和磁珠的BEAMing、液滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）、芯片数字PCR等，均已被应用于肿瘤诊断中，如甲基化、基因突变、循环肿瘤DNA、非编码RNAs等[19]。最近，数字PCR也应用到病毒检测中，Oma等[20]证实数字PCR在检测牛冠状病毒的灵敏度高于普通PCR。面对当前疫情出现的“假阴性”现象，多个研究团队利用数字PCR已取得阶段性成果。中国计量科学研究院宣布基于高灵敏数字PCR技术，针对2019-nCoV ORF1ab、N、E基因，研发出检测试剂盒。其他企业也宣布成功研制出三通道数字PCR2019-nCoV检测试剂盒，但均未获批准进行临床应用。另外，数字PCR系统对设备依赖性强，且价格昂贵，仅集中在少数大医院，限制了其作用的发挥。

3.基因编辑技术：以规则成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated，CRISPR/Cas）系统为代表的基因编辑技术在核酸检测领域发展迅速，特点是具有“向导”作用的RNA序列和编码核酸内切酶活性的Cas基因，对基因及转录产物进行定点修饰编辑[21]。Leist等[22]已经尝试利用CRISPR/Cas9进行MERS-CoV的机制研究，提示CRISP系统可以用来进行冠状病毒检测。Nguyen等[23]也证实了这一点，他们利用CRISPR/Cas13d系统靶向2019-nCoV的ORF1ab和S基因，探讨其对2019-nCoV的治疗作用。因此，针对2019-nCoV设计分别靶向ORF1ab和S基因的向导RNA，识别病毒后，Cas13对这两个基因进行切割，然后联合环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等核酸扩增技术，或者各种生物传感器检测，灵敏度高[9]。Gootenberg等[24]（麻省理工学院张锋团队）利用其建立的SHERLOCK系统，研发出基于CRISPR/Cas13技术的2019-nCoV检测试剂盒，并在McGovern Institute for Brain Research官网上公布了操作流程文档（https://mcgovern.mit.edu/2020/02/14/enabling-coronavirus-detection-using-crispr-cas13-an-open-access-sherlock-research-protocol/#single-post-main-container）。该方法直接检测经过简单处理的临床样本，操作便捷、时间短，如能成功研制并推广，可弥补现有技术的不足。国内也有企业利用此技术研发2019-nCoV核酸检测试剂盒，但目前尚未进行临床验证及应用。另外，由于使用的引物多，向导RNA设计难度高，应注意特异性及“脱靶”效应导致的假阴性。

4.等温扩增技术：与传统PCR相比，等温扩增技术设备简单、扩增时间缩短，同时保持了较高灵敏性及特异性，适合快速检测，在病原检测及分子诊断中广泛应用。根据反应原理的不同，分为LAMP、重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA）、依赖核酸序列型扩增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、链置换扩增（strand displacement amplification，SDA）、滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）等，其中部分已经实现商业化[25]。LAMP是应用最广泛的等温扩增技术，由Notomi等[26]2000年建立，在恒温条件下用一种酶实现核酸快速扩增，形成哑铃状结构。等温扩增技术的重要进展之一是与CRISPR系统相联合，检测基因更精准、快速，发展潜力很大。另一重要进展是在病毒等病原微生物检测的应用，已有研究显示LAMP技术能够快速精准的检测MERS-CoV的ORF基因和N基因，效果优于实时定量RT-PCR[27-28]。自疫情发生以来，已有多个团队利用等温扩增技术研发2019-nCoV诊断试剂盒。2月22日刚获批的1个核酸检测试剂盒的原理为恒温扩增芯片法，具有快速、简便、结果直观和高通量筛选等优点。这扩大了新型冠状病毒的检测手段。但等温扩增技术具有引物设计要求高、不能扩增较长目的片段、易产生假阳性等局限性，因此此方法在2019-nCoV的检测中能否克服上述缺陷，达到快速精准检测的目的，仍有待于临床进一步应用评估。

5.核酸POCT技术：在现场使用便携式核酸仪器及配套试剂，该仪器将核酸扩增、信号收集与结果分析功能整合，减少了中间环节，能快速完成检测，并能有效防止交叉污染[9]。目前国内已有多家企业研发出全自动核酸扩增检测分析仪及配套试剂盒，操作简便，速度快捷，这对在人口密集区或基层开展快速筛查具有重要意义。国家科学技术部也于2月8日对新型冠状病毒现场快速检测产品研发进行应急立项（国科发资〔2020〕28号），以期突破现有技术对人员及场所的限制，缓解患者确诊压力。随着POCT产品的不断研发及应用，能够对当前检测形成有效补充，加快疫情结束速度。但需注意在POCT研发及应用时，不应过于强调“快速、简便”，以免影响其灵敏度，造成假阴性结果。

6.核酸质谱技术：核酸质谱是一种新型软电离生物质谱分析技术，将微流控芯片与质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）集成整合，能最大程度获取信息量，实现精准诊疗。其具有高灵敏度、高通量、操作简便等特点，适用于呼吸系统感染性疾病病原体等的鉴定[9]。Liu等[29]利用MALDI-TOF-MS结合多重PCR技术检测DHAV-1等10种鸭病毒，最低检出限为1.3～7.8拷贝数/μl，且无交叉反应，可用于病毒RNA诊断。目前已有企业基于核酸质谱技术研制出“常见呼吸道病毒及2019-nCoV核酸检测试剂盒（飞行时间质谱法）”，检出限为100拷贝数/ml，可同时检测包括2019-nCoV、甲型流感病毒、乙型流感病毒在内的20种引起呼吸道疾病的RNA病毒。但是由于核酸质谱的两个核心技术芯片和质谱都对仪器设备、工作环境、人员资质等要求很高，难以进行普及。另外，毛细管电泳基因分析技术也可在一个反应内同时检测多种呼吸道病毒，但仅有少数团队报道了该技术在新型冠状病毒检测中的应用，如Sanger测序仪GeXP（GenomeLabGeXP Genetic Analysis System）。

三、总结

2019-nCoV核酸检测在新型冠状病毒肺炎的诊断、疗效监测、疫情防控中发挥了重要作用，目前使用的核酸检测试剂盒多数尚未进行充分的临床评估，在实际检测中应严格按照操作规程，注意规范各种细节，避免假阴性及假阳性的产生，保证结果快速、准确。获得2019-nCoV的基因序列并利用其进行有效检测只是第一步。更多的问题是未知的，包括传染的起源、影响的范围及持续时间，是否有其他动物宿主存在，发病的疾病谱及发病机制，特异性的抗病毒药物及疫苗的研发等，仍有待于进一步研究发现。