分子诊断在病毒性肝炎诊治中的应用

分子诊断往往能发现疾病发生的真正原因，被认为是“更深层次”的实验室诊断技术，目前在临床应用日益广泛，如聚合酶链技术（PCR）。

PCR灵敏度高，特异性强，诊断窗口期短，可进行定性、定量检测，可用于肝炎、性病、肺感染性疾病、优生优育、遗传病、肿瘤诊治等领域。

在《中国医学论坛报》6月21日A12版，笔者简要介绍了分子诊断的基本概念、技术种类、标本的采集及报告单阅读等内容。本期简要介绍分子诊断在病毒性肝炎诊治中的应用。

“大三阳”与 HBV DNA 检测的关系

所谓“大三阳”，指的是表面抗原（HBsAg）、核心抗体和e抗原（HBeAg）同时阳性。

如果病人有“大三阳”，通常说明乙肝病毒在人体内复制活跃，同时HBV DNA检出阳性，说明患者的血液、唾液、精液、乳汁都有病毒存在，传染性很强。因此，“大三阳”与HBV DNA是显著相关的。

但“大三阳”和病毒复制之间不能划等号。例如抗病毒治疗过程中，如果HBeAg、HBV DNA均获得转阴，可认为抗病毒治疗效果显著；如果其中一项阴转，说明有效，但仍需继续抗病毒治疗，直到两项病毒复制指标都转阴为止。事实上，在此类病人中，HBeAg转阴通常会比HBV DNA的转阴有所滞后，那么，检测HBV DNA是更为直接、及时地判断抗病毒治疗效果的重要依据。

“小三阳”与 HBV DNA 检测的关系

所谓的“小三阳”，指的是HBsAg、核心抗体和e抗体同时阳性。

与“大三阳”相比，“小三阳”传染性较小，病毒复制不够活跃。人们通常认为，HBeAg由阳性转阴继而转为HBe抗体阳性，是慢性乙肝好转、稳定的标志。

但是随着研究的深入，人们发现，乙肝病毒容易突变，可造成病毒HBeAg停止表达，转换为“小三阳”。实际上该类患者体内的HBV DNA可能仍然存在复制活跃的情况，其传染性仍很强，且变异后的病毒更不易清除，也特别容易进展到肝硬化。

这种情况可能比“大三阳”危害更大，所以就更应进行HBV DNA定量分析，以确定是否需要治疗和观察抗病毒疗效。临床检测的实际情况也显示，“小三阳”患者的核酸检测中有相当比例显示HBV DNA阳性。

HCV抗体与HCV RNA检测的关系

HCV抗体阳性代表机体受到过HCV的感染，可在病毒清除后仍长时间存在。有报告说该时间可长达9年。

因此，目前还无法准确判别HCV抗体阳性患者是否有病毒血症。HCV　RNA是丙型肝炎的确诊指标。

如何看待PCR检验结果误差值

同样的一份标本，荧光定量PCR检测结果相差10倍，这样的检测误差是否太不“靠谱”了？

其实，这样的报告结果是可以接受的。因为，PCR检测结果的允许误差为：测定值±1个数量级。

例如，1份HBV DNA为4.3×105copies/ml的标本，测定结果可能为4.3×104 copies/ml ~ 4.3×106 copies/ml。这是因为PCR方法采用的是体外核酸扩增技术，1个DNA或RNA分子逆转录成cDNA，经过30个循环体外扩增后，理论上可达到230 PCR产物（10亿多DNA分子）。产物经过扩增后被放大到巨大的数量。所以，如果在核酸提取过程中，有一点点的误差，被扩增后就被显著放大了，这就是相差10倍的结果，也是“靠谱”的检验结果。

当然，为了检验结果的准确性，目前分子诊断行业对检测结果的可靠性提出了新的更高的要求。如中国合格评定国家认可委员会（CNAS）-CL02：2007《医学实验室质量和能力认可准则》，在基因扩增检验领域的应用说明中规定：以室间质评评价界限作为允许总误差（TEa），重复性测量结果偏倚须小于1/2TEa。也就是说，同样是一份HBV DNA为4.3×105 copies/ml的标本，检测结果应该在1.72×105 copies/ml ~ 1.08×106 copies/ml范围才能算合格。

HBV DNA定量单位之间换算

临床工作中，经常遇到患者持其他医院的化验单就诊，因定量单位不一致使医师困惑的问题。其实，在常用的IU/ml和copies/ml两者之间存在换算关系。

为了使不同的检测试剂或系统间结果具有可比性，世界卫生组织生物学标准化专家委员会，委托英国国家生物学标准物质和质量控制研究所（NIBSC）研制了HBV DNA国际标准物质，单位为“国际单位/毫升”，即IU/ml。大部分的SCI杂志都要求用IU/ml，拷贝（copies）是不规范的用法，中文杂志还在使用。

拷贝，一般专指DNA分子，1拷贝DNA就是1 DNA分子。更形象地讲，1拷贝DNA就是1个DNA基因组。因为病毒里一般只有1个DNA基因组，那么可以认为，1拷贝的DNA，代表1个病毒。

IU与拷贝之间的换算关系，不同的病毒，换算系数不一样。对于乙型肝炎病毒（HBV）而言，1IU大概等于罗氏试剂的5.6拷贝。国内公司试剂的换算关系通常是1IU=1拷贝，具体的换算值根据各厂家的确定换算系数进行。

在2008年亚太肝病会议上发表的新指南建议，实用国际单位1 IU/ml≈5.6 copies/ml。这是根据罗氏试剂确定的。因为国外用于HBV DNA定量PCR检测的临床试剂以前只有罗氏公司一家提供。在有HBV DNA国际标准物质以