CMV抗体免疫金快速检测试剂盒的开发与初步应用

　　作者：宋鹏，刘陶，杨浩，韩锋产，陈五岭

　　【关键词】  人巨细胞病毒

　　Development and primary application of immunogold fastdetection kit for human cytomegalovirus

　　【Abstract】  AIM: To develop a cheap and easytouse kit based on dot immunogold filtration assay for analysis of antibody of the human cytomlegalovirus in serum. METHODS:  With prepared GICA apparatus and colloidal gold which were coupled with SPA, the goldSPA conjugate reacted with human IgG in serum and migrated along the nitrocellose strip on which the branched multiple antigenic peptide of human cytomlegalovirus was immobilized. If the serum contained antiHCMV IgG, there would be a red line on the strip where the branched multiple antigenic peptide of human cytomlegalovirus were immobilized. RESULTS:  A total of 120 sera were detected for antiHCMV IgG by GICA and ELISA. The sensitivity and specificity of GICA were 97.9% and 87.5%. The corresponding rate of both tests was 95.8%. CONCLUSION:  GICA is a sensitive, specific, simple and rapid assay for detecting antiHCMVIgG in sera.

　　【Keywords】  Human cytomegalovirus;Branched multiple antigenic peptide; golol colloid; enzymelinked immunosorbent assay

　　【摘要】 目的： 开发一种低成本、简单易用的基于免疫金渗滤法的试剂盒，以用于检测分析血清中的巨细胞病毒抗体.  方法： 将用人工合成的人巨细胞病毒(HCMV)抗原表位的线性肽和分支多抗原肽分别划线固定于硝酸素纤维膜上，制成免疫层析检测试纸条，血清中IgG与测试条上金标记物结合后沿硝酸纤维素膜移动，与膜上的固相抗原结合形成肉眼可见的红色带条并用GICA和ELISA试剂盒对比检测120份血清标本中抗HCMV抗体. 结果： 分支多抗原肽制成的免疫层析检测试纸条的灵敏度为97.9%，特异度为87.5%，两法符合率为95.8%. 结论：  GICA检测血清中的抗HCMV抗体特异性强，灵敏度高，简便快速，有广泛应用价值.

　　【关键词】 人巨细胞病毒；分支多抗原肽；胶体金；酶联免疫吸附测定

　　0 引言

　　人巨细胞病毒（HCMV）感染的普遍性和严重性已引起医学界的高度重视［1］. 但HCMV感染时，临床症状变化很大，可随患者年龄、机体状况、感染途径不同而异. 现今实验室检测手段包括ELISA检测患者血清中IgG和IgM，套式PCR技术检测血清HCMV的DNA，RTPCR检测HCMV的mRNA以及病毒培养等，但由于以上方法耗时耗力［2］，且检测费用较高，不适合在基层临床医疗机构的普及性筛查. 为此，我们采用人工合成的包含HCMV抗原表位的线形多肽以及多抗原肽，采取胶体金免疫层析法［3］，对HCMV进行快速检测.

　　1 材料和方法

　　1.1材料

　　制备型HPLC（Beckman公司）；核酸蛋白检测仪（上海嘉鹏科技有限公司）；激光解析质谱（Hewlettpackard公司）；台式冻干机（军事医学科学院四环仪器厂）； 固相萃取小柱（Waters公司）；芴甲氧羰基（Fmoc）保护的氨基酸（Merck公司）； 1氧3双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼（TBTU ）、1羟基苯并三氮唑（HOBT）（ABI公司）；线性多聚赖氨酸、DIEA、三氟乙酸（TFA）（Sigma公司）； G10, G25凝胶（Pharmacia公司）；乙腈（Fisher公司）；HCMV ELISA对照试剂盒（德国VIRION公司）；氯金酸（成都化学试剂厂）；葡萄球菌A蛋白(SPA)（卫生部上海生物制品所）；点膜器（美国BioDot公司）. HCMV质控血清为第四军医大学全军基因诊断技术研究所提供，血清标本从第四军医大学西京医院收集.

　　1.2方法

　　1.2.1HCMV抗原表位设计参照文献［4］，根据KyteDoolittle亲水性方案预测B细胞表位结果设计合成了HCMVgp55抗原表位序列如下：VTSGSTKD （aa 798 to 805）.

　　1.2.2线性肽的合成将PACPEGPS树脂 0.5 g（替代度0.2 mmol/g）用二甲基甲酰胺（DMF）浸泡30 min，进行活化. 采用对称酸酐法将已经活化的树脂进行第一个氨基酸的连接. 称取待连接的氨基酸 195 mg，加入1.5 mL二氯甲烷DCM和3滴DMF使之溶解，加入1mol/L二环己基碳化二亚胺（DCC）/N甲基吡咯烷酮（NMP）  275 mL，磁力搅拌，室温下反应15 min，过滤除去沉淀，蒸发掉过滤液中的溶剂，得到对称酐. 将对称酐溶于最少量的DMF中（保证最大浓度），加入到活化的树脂中，摇动1 min，然后加入0.1 mol/L 4二甲氨基吡啶(DMAP)/DMF 460 μL，摇动反应90 min，吹去反应液，用10 mL DMF洗涤3次，吹干.  其余7个氨基酸的连接采用原位活化法，将连接有第一个氨基酸的树脂放入反应瓶中，加入300 g/L哌啶/DMF溶液50 mL反应15