免疫热点问与答
免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。免疫系统的功能主要表现为三方面，即防御功能、稳定功能及免疫监视作用，这些功能一旦失调，即产生免疫病理反应。当自我稳定功能过高时，会可能患类风湿关节炎等；当防御保护功能过高时，会出现过敏反应，过低则会得免疫缺陷综合症；免疫监视功能过低时，可能会形成肿瘤等。
定向点金《临床实验室》汇集读者问题，结合本期主题“免疫”，形成免疫相关热点话题，邀请相关专家与研究人员“答疑解惑”，以期有助于免疫的实验检测与临床应用。
问题一：在室内质控良好的前提下，发现几例患者血液标本尿素和肌酐很高，临床诊断肾衰或尿毒症，但检测标本胱抑素C含量正常，理论上讲应该升高，反复检测均如此，如何理解或解释此种现象。
山东大学齐鲁医院检验科王传新主任（中华医学会检验分会免疫学组副组长）：尿素、肌酐、胱抑素C是肾功能重要检测指标。
尿素作为氨基酸分解代谢产物，主要由氨在肝脏内合成，经肾脏随尿排出，少量经肾小管重吸收，受饮食影响较大；肌酐是肌酸的代谢产物，在肌肉中通过非酶脱水反应形成，释放入血，随尿排泄，做为小分子物质，通过肾小球滤过，在肾小管内很少吸收，每日体内产生的肌酐，几乎全部随尿排出，受年龄、性别、种族、体重等因素的影响，不易受饮食影响；胱抑素C广泛存在有核细胞和体液中，在所有有核细胞内以恒定速度持续转录与表达，无组织特异性，生成率不受年龄、性别、肿瘤、免疫性和内分泌疾病影响，循环中的胱抑素C仅经肾小球滤过而被清除，在近曲小管完全重吸收并降解。
肾小球病变早期，血中胱抑素C首先升高；当肾小球滤过功能降低1/3以上时，血中尿素、肌酐才开始升高。一般情况下，尿毒症的病人，血中尿素、肌酐和胱抑素C均保持较高的水平。当机体暴露于外来毒物（如百草枯）时，机体有核细胞合成胱抑素C障碍，尿毒症病人可以出现血中尿素、肌酐升高与胱抑素C不一致的现象。
济南军区总医院检验科胡成进主任（中华医学会检验分会免疫组委员）：循环中的胱抑素C仅经肾小球滤过不被肾小管吸收而被清除，是一种反映肾小球滤过功能变化的内源性标志物，是早期反映肾小球滤过功能受损的标志。胱抑素C不受年龄、性别和药物的影响。这几例肾衰患者胱抑素C正常，可能原因：1.如果患者行血液透析治疗，胱抑素C是小分子物质，由122个氨基酸组成，相对分子量为13300，被透出体外而测不出或正常；2.患者体内浓度很高，免疫测定出现HOOK效应，导致假阴性；3.方法学问题：临床用的测定方法不一，灵敏度和抗干扰能力不同。胱抑素C的抗体亲和力低，会导致出现检测结果偏低现象。已明确诊断尿毒症或肾衰患者不建议检测胱抑素C。
淮安市第一人民医院检验科姜玉章主任（江苏省医学会第六届微生物与免疫学分会委员）：通常肾衰或尿毒症血液中胱抑素C水平应增高。如质控系统很好，发生上述现象可能为：1、胱抑素C检测采用免疫比浊法。要考虑标本中胱抑素C含量较高，需进一步稀释检测；2、标本本身是否有不足？可重新采集标本检测；3、该患者以前检验结果及趋势分析，必要时到临床具体了解原因。
问题二：发热待诊患者诊断，临床常需要实验室进行伤寒相关实验诊断，请问目前是否有较敏感、特异的方法可取代肥达氏试验？
王传新主任：伤寒相关实验检测传统方法为细菌培养和肥达试验。细菌培养特异性高，是确诊伤寒的金标准，但结果易受抗生素、培养条件、标本采集的质、量和时间等多因素影响，敏感性低且费时；肥达试验是用伤寒杆菌的菌体（O）抗原和鞭毛（H）抗原以及副伤寒甲、乙、丙菌液与稀释的待测血清反应，根据凝集效价判断血清中有无伤寒杆菌的抗体，由于伤寒杆菌的O抗原与A群、B群沙门氏菌有部分相同抗原，与甲、乙两种副伤寒杆菌有一定的交叉反应，肥达反应诊断伤寒杆菌特异性差，敏感性低，常出现假阳性，而且抗原抗体结合出现凝集沉淀常需要时间较长；大孔反应板凝集试验原理与肥达反应相同，结果观察更为清晰。目前其他免疫学检测方法有金标法、ELISA法和PCR技术等，金标法、ELISA法具有较高的特异性和敏感性，操作简单、快速，阳性反应表明有伤寒杆菌或伤寒抗原存在的可能，但存在一定的局限性。PCR检测，高特异，受试剂、操作等因素影响，阴性不能排除伤寒可能。
胡成进主任：伤寒的实验室诊断最经典的方法是肥达反应，已有100多年历史, 始终伴随着争议。以往由于条件所限，肥达反应是疑似病例诊断为伤寒的唯一的实验室手段。但肥达反应存在诸多问题，在诊断上不敏感不特异，已表现出显著的局限性，需要改用其他检测方法以克服肥达反应在检测特异性和灵敏度、以及检测时限上存在的问题。比如ELISA方法可以代替肥达反应来监测血清中抗原或抗体，是一种相对既灵敏又特异的诊断方法；还有其他一些商品化的IgM抗体检测试剂盒，包括Tubex test、Typhidot/Typhidot-M、IgM Dipstick等，其敏感性和特异性均优于肥达反应。但血清学方法存在共同的缺点，即存在明显的交叉反应，原因与沙门菌属基因组90%以上为共有，拥有很多共同抗原有关。因此，在现场条件不容许使用培养或肥达反应的地方，一些简单的血清学方法可能有用武之地，只是方法特异性低的问题还需要进一步解决。
分离培养法是最基本也是诊断伤寒病例的金标准。培养所用的标本可有骨髓、血液、粪便和尿液。由于培养方法受标本采集时机和抗生素应用的影响，阳性率会大大降低，而且培养所需时间较长，因此该方法存在明显不足，但可为预防控制，预测伤寒的流行趋势，菌株的进化关系等提供基础资料。
PCR检测标本中的伤寒沙门菌核酸，是目前公认最为敏感和特异的诊断方法。但PCR方法容易受污染影响，另外，伤寒和甲型副伤寒沙门菌是胞内寄生菌，抗生素的滥用加剧了血液中细菌数量的减少，制备DNA模板过程中样品的损失增加PCR扩增的难度，其特异性和敏感性目前仍存有争议。
姜玉章主任：敏感性和特异性通常是一对矛盾，且快速、敏感性高且特异性好的检测方法是临床和检验人员追求的共同目标。对发热待诊患者进行伤寒相关实验诊断较敏感、特异的方法，除肥达氏外，有：1、沙门氏菌测试片；2、骨髓培养法；3、沙门氏显色培养基法。
问题三：“红斑狼疮”检验项目的特异性：抗双链DNA阳性率总感觉偏低，更换试剂品牌与检测方法后，是否敏感性不够高？明知是现症病人，检测结果均为阴性，如何解释此现象？
王传新主任：系统性红斑狼疮诊断标准明确分为两类：临床标准和免疫学标准。抗dsDNA抗体阳性只是SLE的免疫学诊断标准之一，抗dsDNA抗体可以作为治疗监测和预后评价的有效依据，其滴度与SLE活动度相关，尤其与狼疮肾炎之间关联密切。除此外，该现象也可能与抗双链DNA抗体测定方法有关。
目前常用测定方法有间接免疫荧光法（IIF）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和印迹法（LIA）等。绿蝇短膜虫为标准基质的IIF为其测定的金标准，高特异，主要用于检测中高等亲和力抗dsDNA抗体。因其敏感度不高，其阴性不能排除SLE的可能，此抗体也偶见于健康人血清中。
LIA与ELISA测定抗dsDNA抗体会出现假阳性或假阴性，不同厂家结果可能不同，即使同一厂家的两种产品对抗dsDNA抗体测定也会存在差异。ELISA比LIA敏感度高，但鱼精蛋白预包被ELISA特异性低，核小体或重组质粒预包被ELISA特异性明显提高。ELISA与LIA可能检测到没有临床意义的低亲和力抗体，其检测阳性结果应通过IIF法确认。
胡成进主任：抗dsDNA抗体是系统性红斑狼疮（SLE）的标记抗体之一，多出现在SLE的活动期，抗dsDNA的量与活动性密切相关。目前临床常用的检测方法有短膜虫间接免疫荧光法（CLIFT）、酶免疫印迹法（LIA）、胶体金斑点法（DIGFA）和酶联免疫吸附法（ELISA），这四种方法中特异性最高的为短膜虫间接免疫荧光法，敏感度最高为酶联免疫吸附法。不同的检测方法敏感度和特异性有所差异，但特异性一般在90%以上，敏感性均不高。现症病人，检测结果均为阴性，可能原因有：1.检测方法敏感性不高；2.患者治疗后病情处于非活动期。建议联合检测其他标记性抗体（抗Sm抗体、u1RNP、核糖体P蛋白、核小体、PCNA抗体等）以提高其敏感性，最好同一检测指标有不同方法学的比对，防止漏检提高诊断准确性。
姜玉章主任：红斑狼疮患者抗双链DNA阳性率为40-60%，检测结果可依质控分析，最好不要凭感觉。
广州康润生物：抗dsDNA抗体是SLE的标志性抗体，包括IgA、IgG和IgM，对于SLE的诊断和疾病检测都有重要作用，但是该指标并不仅见于SLE也可见于其他自身免疫性疾病和感染性疾病等，通常检测IgG，部分也检测IgM；dsDNA抗原双链结构是保证其抗原性的基础，也决定了其实验检测的敏感性和特异性，但是该结构的稳定性较差，造成该项目的检测敏感性相比其他自身抗体偏低。现有dsDNA的临床检测在国外主要采用的方法是：间接免疫荧光法（IFA）、酶联免疫吸附法（ELISA）和放射免疫（Farr），在国内还有较多实验室使用固相膜酶免方法（BLOT）。IFA的特异性较好但是敏感性偏低；ELISA使用最为广泛，敏感性较高但是特异性偏低且各个厂家试剂盒之间结果差异较大；Farr的敏感性和特异性都较高，但存在放射性问题，且不同来源试剂盒尤其是进口与国产产品之间结果存在较大差异；BLOT由于稳定性较差，敏感性和特异性都不太好，在国外应用较少。各种方法学之间的结果之间差异较大，在此情况下为保证检测的综合敏感性和特异性，通常采用多种方法学组合平行检测，常采用的组合有：IFA+ELISA，Farr+ELISA，综合敏感性可以达到70%。在换用试剂盒之后，应注意采用相同的QC PANEL进行比较，而且该PANEL应该包括SLE和非SLE自身免疫性疾病、感染性疾病和健康对照组，才能对其敏感性与特异性指标进行比较。在得到可靠的组合后，尽量不要轻易改变以保证结果的稳定性。
自身免疫性疾病的自身抗体表现非常复杂，尤其是SLE。在初诊病例中也是有相当一部分无法检测出dsDNA抗体；且疾病在治疗发展过程中抗体的阴阳性和滴度都会发生变化，因此经常会发生现症病例无法检测出dsDNA抗体阳性，或者前阳后阴、前阴后阳的结果变化；目前情况下只能依据选取的可靠方法学及试剂盒组合的检测结果尽量保证结果的准确性，尤其是稳定性。
问题四：丙型肝炎的快速检测有什么好的方法？现有的快速方法不是阳性率太低就是假阳性太多，请推荐一些检测方法。
王传新主任：丙型肝炎免疫学检测主要为血清学检测，一般分为筛查和确认试验两类，筛查试验主要有金标法、ELISA及发光法等，确认试验有重组免疫印迹法（RIBA）及核酸定性。金标法敏感度和特异性均不够理想，一般作为应急快速检测使用，其测定样本最好用其他试验进行补测，以判定最终结果；ELISA及发光法用来测定丙肝抗体和/或抗原，作为筛检试验，具有较高的敏感度，但特异性较低，存在假阳性，阳性反应一般需确认试验进行确诊；RIBA特异性高，实验烦琐；核酸定性特异性高，但阴性不能排除丙肝感染。
胡成进主任：丙型肝炎的实验室检测主要以丙肝抗原、丙肝抗体和丙肝核酸RNA检测为主。其中丙肝快速检测方法（检测时间一般在1小时内）主要是丙肝抗体检测：1.化学发光法（50-60min）；2.胶体金试纸条（15-20min）；3.美国FDA通过的OraQuick快速检测试纸（20min）。就相对快速检测而言，推荐应用自动化学发光法检测丙肝抗体：1.灵敏度高于胶体金试纸条，特异性高；2.检测速度优于酶联免疫吸附试验和重组免疫印迹试验；3.仪器自动化程度高，人为干扰因素少，是一种相对快速的丙肝筛查方法。
姜玉章主任：丙型肝炎的快速检测：金标法等，建议大家在确保质量之后，再关注快速，否则会很麻烦。丙型肝炎病毒的检测方法，除金标准法外，目前主要有：ELISA法、化学发光和基因检测，前两者假阳性据研究约占40%。
问题五：如何建立免疫质控的 CUT OFF值？
王传新主任：该问题不够明确，免疫质控是通过对检测系统进行准确度（阳性或阴性）的验证，同时根据实验室需要制定自己的准确度范围目标，通过精密度加以保证。质控品一般有明确的符合一定要求的阴性或阳性结果。
CUT OFF值是鉴别样品，作为判断特定疾病、状态或被测量存在或不存在的界限的量值，即特定定性测定试剂的“阳性判定值”。在实际应用中，生产厂家或研发人员利用ROC曲线，根据检测目的及临床特异性和敏感性要求设计确定CUT OFF值，其会综合平衡考虑感染者、未感染的健康人群及未感染的患有其他疾病的人群检测情况。CUT OFF值不等同于试剂测定下限，理想情况下，实验室应在其面向的测定人群中对其进行确认。特定检测试剂或系统一般会注明CUT OFF值。
胡成进主任：确定CUT-off值的方法一：使用阴性血清测定结果均值的2或3倍作为阳性判断值：取一定数量（通常较少）的阴性血清样本，使用已建立的酶免疫测定方法或试剂盒测定，如果上述阴性血清样本的吸光度均值为0.05，则该次测定的阳性判断值为0.10或0.15。例如现有的试剂盒结果的判定以P/N或S/N≥2.1为阳性，其依据即是以阴性参考血清的2倍作为阳性判定值。这种Cut-off值设定方法，可以较为避免假阳性结果的出现，但假阴性可能比例较高。总的来说，这是一种非常粗糙的Cut-off值设定方法。
确定CUT-off值的方法二：首先测定大量（数千）正常人血清样本，然后将所得到的吸光度均值＋2或3个SD作为阳性判断值：当正常人血清样本数量足够大时，使用特定的酶免疫测定方法测得的吸光度值将呈正态分布，在具有95.3％（单侧）的可信度的情况下，可以将从正常人血清测得的吸光度均值＋2SD作为阳性判断值；如要求99％（单侧）的可信度，则以吸光度均值＋3SD作为阳性判断值。与第一种方法相比，这种Cut-off值设定方法更为科学一些，建立在统计学的精确计算的基础上，但由于这种方法仅考虑阴性人群，故而难以确定“灰区”，有可能会出现较多的假阴性，因其将整个“灰区”几乎都归为阴性。
确定CUT-off值的方法三：在测定大量正常人血清样本的同时，测定大量阳性血清样本，如测定值为正态分布，则根据u检验的特点，以单侧99.5%的可信限先分别确定阴性和阳性的Cut-off值；如为非正态分布，则百分位数法单侧95％或99％来确定Cut-off值。阴性和阳性人群的Cut-off值确定后，根据“灰区”的大小，综合平衡考虑假阳性和假阴性率的情况下确定Cut-off值。这种Cut-off值确定方法，较之单纯从阴性人群考虑要较为全面一些，并且对测定的“灰区”有一个估计，不会出现将“灰区”全部纳入阴性的情况。
确定CUT-off值的方法四：在测定大量正常人和大量阳性血清样本的同时，测定转化型血清（从阴性转变为阳性过程中的系列血清）样本，取假阳性和假阴性发生率最低，且能区别抗原转化至抗体出现点的吸光度值作为阳性判断值：该方法与上述（3）的区别是增加了转化型血清样本的测定，使得阳性判断值的确定，能最佳地将阳性与阴性样本区别开来。这种Cut-off值确定方法应该说是目前最佳的模式，但由于转化型血清样本非常昂贵且难以得到，因此应用起来有一定难度（本回答内容引自李金明教授课件）。
姜玉章主任：Cut off一般用s/co表示，为临界值，是定性判断检测结果的标准。Cut off的设置因试剂厂家不同，方法不同而设置不同，试剂说明书都会有cut off设置的详细说明。定性免疫质控通常包括：阴性对照、阳性对照和弱阳性（临界值）对照。由于免疫学检测物为具生物学活性的物质，实际工作中cut off值的设置应考虑灰区（gray area），个人经验依试剂说明书的cut off值±20%。
上海昆涞生物：经过与读者的沟通，这个问题可以理解为“如何建立免疫质控的质控范围”，其实这个问题较为宽泛，牵涉到的因素有方方面面，在这里由于篇幅有限，只能做一个纲领性的回答。
对于定量免疫检测项目来说，可参考由Westgard主编的CLSI C24-A3导则。在选择合适的质控品（按照ISO 15189的要求，最好是独立第三方质控品）等其它前提下，至少20天，每天测量一次质控品，获取20个质控点后计算均值和SD。在这里需要再三强调的是，实验室需要独立自主建立均值和SD，切不可依赖质控品厂家提供的赋值表。当然这里面很多细节性问题，就不再赘述。
对于ELSIA这种定性检测而言，建议可参考《Clinical Chemistry》上的文章“Quality control for qualitative assays: quantitative QC procedure designed to assure analytical quality required for an ELISA of
hepatitis B surface antigen”，以上述定量的方法建立S/CO或吸光度的均值和SD，但值得注意的是所采用的失控判断规则与定量质控规则有很大不同，完全不能套用Westgard多规则，需要以功效函数图建立实验室自己的质控规则。更多信息，建议阅读该文章。
摘自定向点金《临床实验室》杂志2014年第六期
编辑：范伟伟
