蛋白芯片技术及其在妇科肿瘤早期诊断中的应用

       妇科肿瘤早期诊断急需有意义的生物标记物,但目前能用于临床的此类标记物的敏感性和特异性尚达不到早期诊断的要求。血清蛋白组中低分子量( < 15 000 kd) 蛋白可能包含有大量生物标记物,因为在疾病过程中一系列酶解或蛋白水解切割产生了大量蛋白片段,其中大部分通过肾脏排除,因此血液中所携带的血清标记物丰度很低,常规蛋白检测技术很难发现[1 ,2 ] 。表面增强激光解析电离(SELDI) 蛋白指纹技术的出现为癌症早期生物标记物的检测提供了重要工具,目前已用于多种肿瘤的早期检测和早期诊断的研究[3～5 ] ,其敏感性和特异性均在80 %以上,其中对卵巢癌的敏感性达100 % (已获美国FDA 批准用于临床) [6 ] ,远远超过目前任何一种血清学诊断方法,可能具有广阔的临床应用前景。

1 SELDI 蛋白芯片技术的基本原理

       SELDI 蛋白指纹技术,是表面增强激光解吸电离飞行时间质谱分析( surface-enhanced laser desoption/ ionization time of flight mass spect rometry , SELDI-TOF-MS) 的俗称。所谓“蛋白指纹技术(protein fingerprinting) ”是一种形象比喻,指的是就像每个人的指纹不同于他人一样,每种疾病发生发展过程中所形成的特定蛋白质组或其降解产物也不一样,因此构成了该疾病特征性“蛋白指纹”模式。通过这种模式识别,达到疾病诊断的目的。
       识别和鉴定人类蛋白质组的技术有很多[7 ] ,例如传统的酶联免疫吸附实验( ELISA) 、双向电泳技术(2D-PAGE) 、激光捕获微切割技术(LCM) 、Western blotting 和荧光差异凝胶电泳(DIGE) 等,这些技术在蛋白质检测中起到了不同作用,为基础研究和临床诊断提供了各种有用的指标。但是此类技术均具有某些的缺点和不足,例如需要大量标本和复杂的蛋白纯化过程。另外,有些检测还需要进行染色(如DIGE) ,有的不能将低丰度小分子量的蛋白区分开(如2D-PAGE、Western blotting) ,从而大大限制了其临床应用范围。SELDI 飞行时间质谱仪的问世为临床蛋白组学开展提供了强有力的工具,可以克服上述技术所固有的缺陷。
       飞行时间质谱仪由蛋白芯片和质谱阅读器及其分析软件组成。早期的飞行时间质谱为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI 技术) ,基质使被分析的蛋白质离子化,然后再进行质谱分析。SELDI 技术把基质改为以色谱原理设计的蛋白芯片,增强了分离能力。蛋白质与DNA 不同,前者是三维结构,制作蛋白芯片最困难的是在不损害其功能不增加背景的条件下在芯片表面通过固定某些蛋白起分离作用。鉴于传统技术很难解决这一问题,在飞行质谱的检测系统中,芯片表面经化学(阳离子、阴离子、疏水、亲水和重离子鳌合等) 或生物化学(抗体、受体、核酸等) 处理,特异性地与被测标本中蛋白结合,再通过选择性清洗,获得高分辨率的保留蛋白谱(第一次分离) 。当加入能量吸收分子后,芯片上保留蛋白形成晶体。在特异的激光照射下,晶体发生解离作用,带电分子在通过电场时加速,检测仪记录飞行时间的长短。质量越轻,相对所带电荷越多,质荷比(M/ Z) 越小,飞行时间越短,被最先地检测到。信号由高速的模拟数字转化器转换并记录下来,被测定蛋白质以一系列峰值的形式呈现。这些特异性波峰即构成了该疾病特有的指纹图谱。SELDI 蛋白指纹图谱中横轴表示蛋白类型,而纵轴蛋白质的强度和丰度。单个蛋白在图谱上的位置取决于飞行时间。
       因此,SELDI 蛋白指纹技术在吸收传统质谱技术的基础上,克服了常规蛋白检测技术的一些缺点,增加了特异性蛋白芯片阅读系统和生物信息学分析软件,能快速处理、分析大量信息,至少具有以下特点: (1) 待测样本来源广,不需要特殊处理,可以直接点样检测,如血清、尿、组织液等; (2) 检测样本用量小且范围广(0. 5～400 μl) 、敏感性高( < 1 fmole) ; (3) 小型实验或高通量检测可自由选择,一次可测8 、16 、96 或192 个样品,可满足临床检测、普查或大样本筛查之需要; (4) 可检测蛋白质分子量范围大(0～500 kd) ; (5) 应用范围广,如肿瘤的早期诊断、疗效监测、复发早期预警及患者预后评估、发病机制的探讨、药物毒理学研究和毒物检测、蛋白质纯化及功能鉴定、抗原、抗体、受体、配体、底物等检测、DNA、RNA 及蛋白质调控研究、蛋白质甲基化、磷酸化、糖基化研究等; (6) 检测快速,可重复性较好; (7) 检测敏感性和特异性较高,对常见肿瘤的诊断达80 %～90 %以上,目前其他方法所无法比拟的。因此,SELDI 蛋白指纹技术在肿瘤等疾病的早期诊断研究中具有广阔的应用前景。

2 SELDI 蛋白芯片技术在妇科肿瘤早期诊断中的应用

       卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌和滋养细胞肿瘤是女性生殖系统最常见的肿瘤,特别是卵巢癌,其临床症状隐匿,缺乏有效的早期诊断方法,超过70 %的患者就诊时已是临床晚期,导致死亡率居妇科肿瘤之首。在临床上,妇科肿瘤标志物少且特异性不强,直接影响到此类患者的早期发现和早期治疗。蛋白质组学技术的出现为妇科肿瘤早期诊断提供了一个很好的技术平台,而且已经取得了令人振奋的结果。
       2.1 卵巢癌　CA125 是目前卵巢癌血清学诊断最常用的肿瘤标记物,但该抗原多在晚期肿瘤患者中才能检测出来,而Ⅰ期患者阳性率仅在50 %左右。美国癌症研究所等单位应用SELDI 技术对50 例卵巢癌、66 例非恶性肿瘤患者和63 例正常人血清进行检测,发现该技术对卵巢癌的诊断敏感性达100 %、特异性95 %、阳性预测值94 %[6 ] 。提示SELDI 技术可用于卵巢癌的早期诊断,进而大大改善了患者5 年存活率。在此基础上,Zhang 等收集了美国4 所肿瘤研究所的503 份血清样本,进行盲筛和交叉验证,从中发现了3 种对早期卵巢癌有意义的生物标记物并进行了纯化鉴定,它们分别为载脂蛋白A、剪切型甲状腺素转运蛋白和α-胰蛋白酶间抑制物重链H4的一个剪切片段。使用这3 种标记物与CA125 联合进行免疫酶联检测敏感性高达95 % ,优于单用CA125 (65 %) ;特异性为97 % ,高于CA125 (52 %) 。Woong-Shick 等[8 ] 在卵巢癌患者血清中检测到的9 种差异蛋白,通过CM-琼脂糖凝胶进行纯化,并对N-端氨基酸序列进行测序。结果发现,卵巢癌患者血清中最显著差异蛋白峰为15. 1 kd 和15. 8 kd ,相当于血红蛋白α亚单位( Hbα) 和β亚单位( Hbβ ) 。两者在正常人与卵巢癌患者之间差异显著,籍此可进行卵巢癌的筛查,但其在卵巢癌发病学意义有待于进一步探讨。国内余捷凯等[12 ] 也发现SELDI 血清蛋白质谱与人工神经网络模型结合,对卵巢癌诊断具有更高的敏感性和特异性,有扩大样本进行临床深入的应用性研究的必要性。
       2.2 宫颈癌　SELDI 技术具有蛋白样品需求量少的特点,因而特别适用于显微切割获取的组织样本。Wong 等[4 ] 收集了35 例浸润性子宫颈癌和27 例年龄匹配的正常人宫颈活检标本,通过显微切割技术获得纯化癌细胞或宫颈上皮细胞并制备组织匀浆,进行蛋白组学模式分析;利用在宫颈癌和正常宫颈中差异表达的7 种蛋白(均为下调) ,建立分类记分系统。应用该系统对于宫颈癌诊断的敏感性为87 % ,特异性100 % ,阳性预测值为100 % ,而阴性预测值为86 %。如果该方法能用于子宫颈脱落细胞学标本,将对宫颈癌的早期预警和早期诊断特别有价值。
       2.3 子宫内膜癌　子宫内膜癌是女性常见的恶性肿瘤,其发生率仅次于乳腺癌、肺癌和大肠癌。对于该肿瘤检测尚无血清学指标,而对子宫内膜癌复发的监测亦仅仅是依赖临床症状和影像学发现。而且,子宫内膜癌的早期筛查也缺乏有效的手段。Yang 等[10 ]用SELDI 技术解决了这一难题,在子宫内膜癌患者血清中筛查到多种肿瘤标记物,其中较为特异的一种是chaperonin 10 ,该蛋白是经弱阳离子交换层析技术鉴定的,并得到Western blot 和免疫组化染色证实。初步研究表明,chaperonin 10 过表达对于该肿瘤的早期诊断具有重要意义。日本学者Yoshizaki 等[11 ] 通过对19 例子宫内膜癌和20 例正常子宫内膜对比研究,发现了两种与子宫内膜癌发生发展相关的蛋白( EC1 和EC2) ,两者的等电点分别为pH 5.0 和pH 7.0 ,前者在子宫内膜癌中表达增强,后者减弱。该作者认为,这两种蛋白可能是子宫内膜癌早期诊断的标记物。
       2.4 妊娠滋养细胞肿瘤　Batorfi 等[12 ] 联合应用显微切割技术和SELDI 蛋白质芯片技术,比较了9 例完全型水泡状胎块和10 例相应孕期正常胎盘滋养细胞的蛋白表达差异,结果发现3 条分子量分别为11.3 kd、13. 8 kd 和14. 0 kd 的金属结合多肽在葡萄胎中的表达明显低于正常胎盘。因此,作者认为SELDI 技术可以将水泡状胎块和正常胚胎完全区分开来,这些差异蛋白的进一步鉴定将有助于揭示妊娠滋养细胞肿瘤发病的分子机制。

3 SELDI 蛋白芯片技术存在问题及发展前景

       SELDI 技术除在妇科肿瘤早期诊断中的用途外,在其他妇科疾病的诊断、疗效检测、发病机制探讨、新药发现和药理学研究以及基础理论研究等方面亦有广泛应用。但是,应当指出目前全世界SELDI 飞行时间质谱仪实验室在质控血清建立及仪器标准化状态、自动化应用等方面存在着不统一的标准,因此,对于SELDI 发现的生物标记物在用于临床诊断及其干预治疗之前,必须进行严格的多中心和三期临床质控验证,以最大可能地排除实验技术的因素所产生的检测误差,进一步提高诊断特异性和预警可靠性。
       Ciphergen 公司的高分辨率SELDI 质谱,或称杂合四极飞行时间质谱仪(QSTAR-TOF-MS) 业已投入使用,其分辨率至少可提高50 倍以上,可将低分辨SELDI-TOP-MS 检测的宽而顿挫的蛋白波峰分开,使每次实验所产生的信息量大大增加。为小分子量肿瘤标记物的检测提供了更灵敏的工具,因而也对生物信息学分析软件的研发提出了更高的要求。但高分辨率QSTAR 质谱仍不能解决测出蛋白质的直接定性,还需要进行常规的蛋白纯化和鉴定。另外,所获得的蛋白指纹不一定能够直接研发血清免疫检测方法,因为离子的幅度不能直接反映相应标记物的浓度。如果该标记物是一种大蛋白的裂解片段,制备只识别这种裂解片段、而不识别原完整蛋白的抗体是很困难的。可以制备多克隆抗体以结合裂解片段(肿瘤标记物) 和完整蛋白,然后再质谱洗脱分离和分析鉴定。
       总之,大量的研究已经证明以质谱为基础的蛋白指纹模式诊断有可能成为一种优于抗体为基础的免疫检测技术。目前的质谱平台敏感性是在10^-15 范围,随着新技术的发展其敏感性会进一步提高。很明显,多种生物标记物组成的诊断模式比单一的标记物包含有更高水平的甄别信息,特别是对于那些异质性明显的广大患者群体更为适合。随着SELDI 技术不断被大家接受,多家大规模参考实验室已经启动了常规临床诊断应用的探讨协作研究计划,相信该技术将在妇科肿瘤早期发现中起到越来越大的作用。

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                                                                编辑：范伟伟