临床实验室中定量液相色谱串联质谱LDT的监管与验证
【摘要】串联质谱法是临床实验室的重要分析工具，但内部开发并验证的检测方法[实验室自建检测方法(或实验室自建检验项目),LDTs]需特殊考量。2022年末，随着验证准确前沿体外诊断试验开发(VALID)法案未获美国国会通过,美国对LDTs的监管前景突然生变。该法案本拟修改食品药品监督管理局(FDA)的职能，以加强对LDT提供商的监管。在此修订后的背景下，本文综述了定量质谱LDTs验证的优化策略，并提出了除增加FDA授权外，实现统一最佳实践的其他途径。文中讨论了定量质谱LDTs高质量验证面临的常见挑战、物流障碍以及减轻其负担的建议。
【关键词】液相色谱-串联质谱;方法验证;实验室诊断
本文深入探讨了“传统”实验室自建检测项目(LDTs）领域中一个狭窄的细分领域。我们描述了基础设施方面的差距，并列举了在开发和验证传统定量液相色谱串联质谱实验室自建检测项目（QntLCMS-LDT）过程中的常见问题（以及建议的解决方案）。本文提出了新的概念，旨在支持检验医学界，并提升高质量QntLCMS-LDT方法开发与验证的可行性。需要说明的是，在检测方法应用于患者检测后，对每批次（系列）样本进行的持续验证，以及方法修改后对使用中方法的重新验证，是与此相关的重要议题，但不在本文讨论范围之内。团队基于在社区医院、学术医学中心、区域卫生组织、CR0和参考实验室等不同场所累积的15-24年QntLCMS-LDT验证实践经验，展开本主题的论述。我们还曾在培训项目以及MSACL/AACC研讨会上，向检验医学科学家、病理住院医师、临床化学研究员和实验室主任讲授过QntLCMS-LDT入门知识。我们的认知虽不可避免地基于经验，但代表了QntLCMS-LDT验证实践中较为合理的交叉采样（cross-sampling）。我们持有支持加强监管的观点，认为对QntLCMS-LDT验证和审批增加适当的要求是合理的。方法开发与方法验证将同步进行，因为我们视二者为密不可分的环节。
一、QntLCMS-LDT是必需的吗？
任何临床实验室检测的首要目标都是帮助诊断并正确治疗送检样本的患者，因此，实验室检测的准确性至关重要。卓越的准确性是液相色谱串联质谱(LC-MS/MS）成为临床实验室关键设备的原因之一。众所周知，使用免疫分析法（IA）测量低浓度睾酮结果不准确，而采用LC-MS/MS则可获得优异的准确性。在慢性肾病患者中，使用IA测量的醛固酮水平可能被高估达两倍，而LC-MS/MS测量则未见此现象。甲状腺球蛋白（Tg）作为甲状腺癌生物标志物，当存在自身抗体时，IA会错误地低估其水平，这在监测癌症复发时是一个重大问题，而LC-MS/MS Tg检测方法可以解决此问题。临床LC-MS/MS方法揭示了IA存在的问题，这些问题曾导致结果解读的误导，并促使制造商改进了检测方法。此外，LC-MS/MS检测方法能够快速开发并在合理的时间范围内完成多种化合物的验证。对于小众或新型化合物或检测量较低的化合物，可能尚无经FDA批准的商业化检测可用。在此类情况下，LC-MS/MS已被用于开发那些因检测量小而对诊断公司（体外诊断制造商）无利润，但具有临床价值的检测项目，例如抗真菌药物或抗凝治疗的治疗药物监测(TDM)，或癌症治疗药物（如白消安）的监测。
尽管LC-MS/MS相较于更传统的基于IA的实验室技术具有优势，但要实施临床LC-MS/MS检测，LDT是必不可少的。LC-MS/MS平台的制造商通常不提供经FDA批准的检测项目，他们可能提供信息和材料，如液相色谱（LC）和串联质谱（MS/MS）参数起点、试剂、校准品和质控品，但这些仅限于少量检测项目。此外，制造商通常无法获取天然基质的临床患者样本，其提供的（配套）方法通常使用简化基质开发，而这种基质不含真实患者样本中存在的内源性干扰，因此，对于大多数LC-MS/MS检测而言，方法开发工作仍需在实验室内部完成。这包括定义、优化和验证市售或自配试剂、校准品、质控品、提取流程、LC和MS/MS参数。个别实验室与制造商合作开发的方法可能由供应商作为应用或技术说明发布，然而，这些发布的方法通常无法直接使用，其建议的参数必须针对运行该检测的特定仪器配置进行验证或重新开发。
二、稳健QntLCMS方法开发和验证的实践建议
开发LC-MS/MS检测方法是一个确定并优化样本前处理、色谱和质谱参数的关键阶段，这是一项需要时间和耐心的经验性工作。在方法开发过程中遇到的挫折和失败应被视为学习机会，其最终目标是改进检测方法。在实验室资源与最优方法参数之间进行权衡取舍可能是必要的。实验室人员配备和可用设备可能意味着某些样本前处理程序不可行，而方法的其他方面(如液相色谱)可能需要更多关注，以减轻因采用较简单的样本前处理而可能固有的稳健性不足。必须从一开始就考虑实验室的局限性，以避免浪费时间和资源去追求长期不可行的方法参数。LC-MS/MS的高度复杂性虽然具有挑战性，但作为一种医学实验室技术，它提供了强大的分析价值。在修改样本前处理、色谱、质谱和信息技术（IT）功能方面存在多种选择，这意味着几乎总有替代方案可用于克服方法问题并增强稳健性。
方法开发应包括对基质效应的彻底研究，一些拥有CMS认可资质的机构要求对QntLCMS-LDT进行基质效应测试，但CLIA’88无此要求。QntLCMS-LDT方法的一个已知风险是基质效应导致特定样本的不准确超出可接受范围。由于MS/MS离子源中电离过程的特性，样本基质可能抑制或增强分析物的电离。虽然不可能完全消除基质效应，但应充分理解并在可行范围内加以减轻。理想情况下，应在患者样本之间最小化并标准化基质效应。通常，这是通过样本前处理（其去除基质的能力各异）和添加稳定同位素标记（SIL）内标来实现的。恰当使用SI儿L通常（但非总是）能补偿由基质效应引起的电离变异。应在方法开发期间进行彻底的基质效应评估，以便在开始方法验证之前就能采取缓解措施（例如，改变样本前处理程序、使用SIL）。指南文件描述了两种基质效应实验类型：定量的（加标回收类实验）和定性的（柱后T型接口灌注实验）。柱后灌注实验比定量基质效应实验工作量小，但CLIA'88或CAP法规并未要求这样做。在方法开发过程中，它是比较样本前处理技术和液相色谱梯度以降低离子抑制风险的重要工具。为定性数据（基质效应的时间范围）制定可接受标准比定量数据（基质效应的大小）更困难。如果科学家对该技术掌握不够熟练或时间不足，在方法开发期间可省略此实验。然而，更广泛地应用此实验及相关法规语言，可能有助于开发出更稳健的QntLCMS-LDT方法。
分析前变量不容忽视。临床实验室使用种类繁多的样本采集管。根据分析物的不同，采血管类型可能影响分析结果。样本的处理和储存条件也应进行评估。例如，用于测定血浆肾素活性的样本必须用EDTA管在低温下采集，立即离心，血浆需即刻冷冻，以防止血管紧张素I转化为血管紧张素II。实验室经常接收来自其他地方已处理的样本，因此可能需要制定程序来确认采血管类型。凝胶分离采血管的干扰是QntLCMS-LDT类固醇检测中的已知问题，应加以研究，并在SOP中定义可接受的样本类型标准。了解合适的样本类型、分析前稳定性和样本储存要求，将指导方法学比较、基质效应研究、稳定性实验和空白基质实验选择合适的样本。在方法开发期间应进行预验证测试，以估计不精密度并评估准确性。应监测预验证标志(Pre-validationflags)，并解决任何问题以改进流程。方法验证是一项重大任务，忽视预验证标志可能导致验证失败。用于方法验证和常规患者分析的物料和供应品应在开发和预验证阶段进行盘点和订购，尤其是在当前供应链面临挑战的情况下。如有可能，测试来自多个供应商的耗材(如采血管、样本瓶、96孔板、溶剂、移液器吸头)是有益的(如图1所示)。
方法开发的目标是创建一个稳健的方法，该方法能够成功通过验证并能在常规使用中问题最少。在本综述及下表中，我们强调了方法开发与验证过程中的关键点和实际挑战，这些在现有的QntLCMS-LDT方法验证文献中有更深入的讨论。此过程高度经验性，通常涉及反复调整。我们建议，方法开发至少应包括以下预验证测试：彻底的基质效应评估、不精密度估计、准确性评估。
三、成功验证QntLCMS-LDT方法的人员策略
尽管在过去的15-20年间，临床LC-MS/MS的使用日益普及，但QntLCMS-LDT方法开发实践仍是一项专业技术，并未纳入医学实验室科学家（MLS）的典型培训中。进行常规患者检测的MLS通常在不同的实验室“操作台”之间轮换，可能很少接触QntLCMS-LDT。实验室可能会聘用专门从事QntLCMS-LDT检测开发和验证的科学家。但是，由单个人员进行的验证并不能真实反映患者的日常检测情况，因为可能会有多个MLS轮流在QntLCMS-LDT操作台上工作。正如其他地方所讨论的那样，样本制备通常涉及多个手动步骤，这也是不同日期和不同工作人员之间差异的来源。对QntLCMS-LDT不精密度和偏倚进行可靠验证时，应包括由多个MLS进行的样本制备，这些MLS将在实验室主任批准该方法后执行患者检测（表1）。
四、影响QntLCMS-LDT开发和验证的基础设施差距
本文提出三个议题供检验医学界考量，以促进QntLCMS-LDT技术验证的更统一和更稳健。一个共同的主线是QntLCMS-LDT提供者之间的协作，以实现这些目标。2015年，分子病理学协会发布了一项关于现代化CLIA’88对LDT监管的提案，重点关注分子检测。其建议包括对高风险和中风险LDT进行引入前外部评审，并指示CMS规定LDT分析性能和临床有效性的最低标准水平。我们建议对QntLCMS-LDT采用类似理念。
1. 对QntLCMS-LDT方法开发培训与认证的需求：截至本文发表时，对于从事医学实验室QntLCMS-LDT方法开发的科学家，除了适用于通才型MLS或实验室主任的联邦和州要求外，尚无特定的学位、培训、经验或许可证的前提要求。如前所述，QntLCMS-LDT方法开发实践高度复杂，但与常规LC-MS/MS操作不同，它很少被纳入MLS培训项目。被授权评审或批准LDT验证的实验室检查员和主任，不一定接受过QntLCMS-LDT验证技术细节的培训。在非医学实验室（如制药公司、CR0或临床研究实验室）学习如何进行QntLCMS-LDT方法开发可能更容易，因为可能有更多仪器和导师可用，并且通常没有医学实验室的执业许可限制。然而，通过非医学培训途径培养的科学家，可能没有资格在需要许可才能实现该功能的医学实验室开发方法。
(1）定义QntLCMS-LDT方法开发的知识库：我们主张美国检验医学界为执行QntLCMS-LDT方法开发和管理验证的人员定义课程和能力标准。认可使用该技术的实验室的检查员，以及批准方法验证和SOP的主管、主任和外部评审员，应具备更有限的、针对特定任务的能力要求。提供此专业培训的教学资源。还有一个附加的要求，必须接受实操培训。仅靠理论培训是不够的，用于此技术的仪器需要更精心地维护以保持最佳运行状态，且方法开发/验证比许多其他医学实验室技术更复杂。供应商对QntLCMS-LDT提供支持和培训，但仪器供应商可能无权代表医学实验室客户进行方法开发。
(2）促进实践方法开发培训：a）具有成功QntLCMS-LDT实施经验的医学实验室，可为首次完成QntLCMS-LDT方法开发理论培训（线上或线下）的科学家和医生提供强化的、短期的实践培训。由具有QntLCMS-LDT方法开发经验的检验医学科学家进行指导是培训质量保证的关键。b）具有QntLCMS-LDT专业知识的医学实验室的科学家可以前往各地，为启动QntLCMS-LDT服务提供短期的现场培训和方法开发支持。c）提供上述任一种培训的障碍包括资金、仪器使用权限受限以及开发课程、培训文件和医学实验室要求的能力评估等耗时任务。汇集此类材料并提供在线访问权限，将是标准化和扩展医学实验室QntLCMS-LDT方法开发实践培训的第一步。
(3)QntLCMS-LDT工作流自动化经验、可用性与培训：一旦克服了初步方法开发、验证和操作人员培训的障碍，扩展医学实验室QntLCMS-LDT服务的主要障碍是样本前处理、仪器操作和工作量较大的数据审查所需的高强度人工劳动。来自多个供应商的解决方案可用于实现以下模块的自动化：液体处理（ALH）、基于介质的样本制备、LC流动相自动多路复用、LC色谱柱切换和MS/MS检测模式切换、基于规则的数据分析以及自动审核。尽管成本是一个因素，但主要限制在于知识差距和人员短缺导致无法实施和验证这些选项。潜在的解决方案包括：a）界定并推广最适合医学实验室模块化半自动化LDT的LC-MS/MS及相关仪器配置模板。b）倡导LC-MS/MS、ALH和中间件供应商共同推广针对模块化半自动化QntLCMS-LDT的样本处理全流程工作流方案。此类资源可协助医学实验室明智地采购和实施其初始QntLCMS-LDT系统，使其包含合适的自动化模块，而无需在样本量增加后再费力地筹措升级资金。c）在QntLCMS-LDT线上和实操培训中纳入ALH编程基础、最佳实践及其验证。d）在QntLCMS-LDT在线和实践培训中纳入仪器连接（接口）和数据传输的基础知识。e）启动医学实验室、IT和供应商利益相关者之间的合作，以标准化LC-MSMS、ALH、中间件和LIS平台之间的信息传输。
(4)更多培训—然后认证：下一步自然是为有实践培训或经验的QntLCMS-LDT方法开发科学家提供自愿性考试认证。任何迈向认证的进展都必须将医学实验室中现有合格QntLCMS-LDT方法开发科学家群体纳入其中。另一个选项是为已具备其他应用市场（如制药、CR0、环境和食品检测）QntLCMS-LDT方法开发专业知识的科学家，提供医学实验室亚专业培训和认证的加速路径。理想情况下，这种自愿QntLCMS-LDT方法开发认证将首先惠及求职者。随后可通过ASCP和/或其他实体进行QntLCMS-LDT专业认证，最终获得执业许可。提供付费QntLCMS-LDT方法开发和验证服务的顾问应接受与内部人员相同的认证要求。在通才型MLS严重短缺的今天，建议进行额外的、资源密集型的培训具有挑战性，但是，拓展医学实验室QntLCMS-LDT专业知识的时机永远不会自动出现。
2. 验证实验和验证审查的可变范围：CLIA’88法规将方法验证的许多细节（例如用于精密度、准确性、基质效应和方法学比较验证的样本数量、浓度以及验证测试持续时间）交由实验室主任自行决定。我们作为培训者的观察表明，QntLCMS-LDT的验证实践在各实验室间差异巨大。如果负责审查验证的实验室主任或主管既不具备QntLCMS-LDT方法开发经验也没有指定的专家，这种差异性也就不足为奇了。如前所述，基质效应实验并非CLIA’88所强制要求，在这种监管模糊性的情况下，某些QntLCMS-LDT方法更有可能存在验证不充分的问题，从而给患者安全带来更大风险。
(1)加强验证标准：建立更详细的标准具有其合理性，旨在促进实施不受机构差异影响的统一验证实践。目标是在所有类型的QntLCMS-LDT医学实验室提供者（包括学术性和非学术性医院实验室、诊所以及参考实验室变体）中实现统一且高质量的验证。至少，所有用于患者诊疗的QntLCMS-LDT都必须进行CAP指南中概述的基质效应测试和验收标准。为方法学比较和准确性研究所需患者样本数量设定最低要求，为精密度、准确性和患者样本比较测试规定必须执行的最短天数，并要求对显著偏离既定规范的可接受标准提供基于临床的合理性说明，这些措施都有助于防止最严重的验证不足情况。用医学实验室QntLCMS-LDT方法开发和验证培训领域的领军人物Russell Grant博士的话来说，验证越少，风险越大，结果被纠正的可能性越大，需要对方法进行修改和再验证的可能性也越大。
(2）促进样本和数据管理的模块化半自动化：为QntLCMS-LDT实施模块化自动化解决方案需要额外的投入以及在ALH、LC、MS/MS和IT领域的专业知识。提高QntLCMS-LDT的自动化水平能带来长期的财务回报，但目前缺乏监管激励。尽管众所周知，如下所列的复杂、重复的手动实验室流程相比自动化具有更高的出错风险，但情况依然如此：（1）试剂的手工配制和追踪（样本制备材料、流动相、LC色谱柱）；（2）样本制备过程中的手动移液和容器转移；（3）仪器上样时手动样本识别和放置；(4)手动替代基于规则的检查和跟踪LC-MSMS校准和数据分析中的元数据（例如离子比，峰面积，保留时间）；（5）仪器、中间件和LIS之间分析前和分析后数据的传输；（6）强调尽量减少试剂成本而不是人工成本。
监管激励措施，如降低费用、简化文件要求以及加快验证审查速度，可以促进QntLCMS-LDT方法自动化的提升。最新版本的VALIDAct包含了一项技术认证流程，为那些分析范围与先前FDA批准的代表性测试相同的LDT提供了一条获得FDA批准状态的途径，无需为每个后续测试进行FDA审查。
(3）QntLCMS-LDT方法验证的外部审核：对于所有美国LDT检测项目而言，一个可以理解的患者安全问题是，目前并不要求对方法验证进行外部审查，而外部审查被认为比内部审查更加客观。VALIDAct的最新版本有关于资格认证和使用外部审核员的规定，以满足法案生效后预计会增加的FDA工作量。另一种方案是在QntLCMS-LDT医学实验室内部建立一个非FDA的基础架构，由该领域的评审员进行验证的外部审批。此类基础架构可包括一个用于提交、审查、批准和存档的在线验证文件数据库。AMP在2015年关于加强CLIA LDT监管的文件曾建议建立类似资源，旨在为医生、患者以及监管机构和LDT提供者提供LDT信息。我们的构想并非一个统计软件应用程序，而是存在于每个医学实验室中的实体验证文件夹的虚拟版本。其目标不是要求特定的计算软件或文件格式，而是简化不同格式文件的上传和审查、便于录入人口统计学信息、进行标准验证，并为实验室检查员和匿名评审员提供安全的访问权限。如同本文提出的其他措施一样，我们支持最初提供激励措施鼓励自愿遵守，然后由认证机构逐步引入外部验证批准的要求。
3.缺乏用于比较测试的赋值患者样本：QntLCMS一LDTs之所以常被采用，往往是因为针对该检测的临床目的，尚无其他方法具备足够的选择性、灵敏度和周转时间。此类新型或特殊标志物的检测工作量在单个医疗中心通常较小，这意味着任何单一的医院、诊所或规模较小的参考实验室，通常难以获取适用于QntLCMS-LDT方法开发和验证的、具有赋值信息的患者样本。若仅使用变异度极小的少量天然基质样本进行开发和验证，可能导致建立的方法可靠性不足。创建虚拟样本库：在QntLCMS-LDT提供者之间非正式地共享去标识化的、存档的剩余患者样本用于验证是常见做法。那么，开发一个虚拟登记系统是否可行？该系统旨在汇集医学实验室愿意现场存储并共享的去标识化、经QntLCMS-LDT赋值的患者样本信息。这样一个汇集各类实验室QntLCMS-LDT提供者的协作数据库，能够以更低的成本增加获取更大规模验证样本的机会，并最终促进实验室间的一致化。然而，合规性(需满足HIPAA和机构审查委员会[IRB]对样本去标识化及剩余样本质量保证使用的要求）、激励参与和公平使用的创新解决方案，以及运营资金，都是重大的障碍。除了愿意捐赠样本等分试样以创建此类资源的医学实验室外，至少还需要一个赞助组织、一个管理机构和IT开发资金。
五、总结
检验医学界专家的合作是提高QntLCMS-LDT可靠性的最有力资源。当FDA批准的自动化检测方法可用时，使用率越来越高的新型检测方法可能会从QntLCMS-LDT转移到自动化程度更高的平台上，从而提高检测通量。因此，对下一个需求迫切的特殊检测项目进行QntLCMS-LDT验证可能是一项持续的任务，这为创新和建设更强大的验证基础设施提供了额外的依据。从读者的角度来看，这些想法似乎显而易见、不必要或不切实际，我们的建议在范围和影响力上不尽相同，但类似的观点在1947-48年CAP首个外部质量评估项目启动以及在CLIA'88法规实施时，肯定也曾普遍存在。我们鼓励QntLCMS-LDT群体以创新和前瞻性的思维来应对加强监管和验证标准的要求，而非消极抵制。抵御不当外部监管的最有效方式，是展示全面、自我施加的质量措施。
注：缩写：AACC：美国临床化学协会；AMP：分子病理学协会；CAP：美国病理学家协会；CLIA’88：1988年临床实验室改进修正案CLSI：临床实验室标准协会；CMS:医疗保险和医疗补助服务中心；CoA：分析证书；FDA：食品药品监督管理局；FFDCA：联邦食品、药品和化妆品法案；GC-MS：气相色谱-质谱联用法；HELP：美国参议院卫生、教育、劳工和养老金委员会；IA：免疫分析法；IVD：体外诊断医疗器械；LC-MSMS：液相色谱-串联质谱联用法；LDT：实验室自建检测方法；MDA：医疗器械修正案；MLS：医学实验室科学家；MSACL：临床实验室质谱学与进展；QntLCMS-LDT：定量液相色谱-串联质谱联用LDT；SOP:标准操作规程；VALID:验证准确前沿体外诊断试验开发；VITAL：美国实验室验证创新测试。。
编译节选自：J Mass Spectrom Adv Clin Lab. 2023 Mar 5; 28: 82-90
后续:2025年4月1日，美国得克萨斯州东区联邦地区法院于周一裁定撤销FDA关于LDTs的最终规则。这无异于在LDT监管方面投下的重磅炸弹，直接把FDA此前逐步废除LDT自由裁量权的规定置于无效的境地。更为关键的是，本次裁决，明确了FDA是否有权力监管LDT。长久以来，FDA一直坚称其拥有这种权力，并且由于“执法自由裁量”政策，它大多没有行使这种权力，但大多数实验室行业利益相关者认为LDT超出了该机构的权力范围。对此，法院认为：联邦食品、药品和化妆品法案以及临床实验室改进法案的“文本、结构和历史”表明FDA“没有权力监管”LDT。截至6月，60天上诉期限已过，故FDA的LDT新政几乎可以肯定作废了!这一裁定，解决了一个持续数十年的争议，即FDA是否能够监管LDT，也结束了FDA在2024年5月发布的关于LDTs规则的实施。
