液体活检生物标志物的分离方法与检测新技术
目前，依赖于有创组织活检或临床影像学的癌症诊断及分子谱分析方法存在诸多限制，这推动了液体活检领域的兴起。液体活检是指从体液样本中提取循环肿瘤细胞(CTCs）、循环游离或循环肿瘤DNA（cfDNA或ctDNA）、循环游离RNA（cfRNA）、细胞外囊泡（EVs）以及肿瘤教育血小板（TEPs）。随后，对这些组分进行分子表征，以鉴定对癌症早期发现、预后判断、疗效评估及治疗后监测至关重要的生物标志物。这些创新的生物来源展现出与其来源或相互作用原发肿瘤相似的特征，本文全面探讨了用于处理这些生物源的多样化技术与方法。
一、循环肿瘤细胞（CTCs）
癌细胞扩散到全身以及随后的一系列转移级联反应都始于最具侵袭性的肿瘤细胞（通常称为CTCs）主动释放到血流和/或淋巴管中。值得注意的是，在转移过程中，癌细胞经历上皮-间质转化（EMT），这是一个复杂的现象，其特征包括：细胞间连接破坏、穿透基底膜及邻近组织、进入静脉或淋巴管形成CTCs、在外周循环系统中持续存在，以及随后在继发部位的外渗和增殖过程。EMT支持上皮性肿瘤细胞的迁移，并被认为在促进转移中起着关键作用。此外，在正常组织中，失去与细胞外基质的粘附会触发锚定依赖性细胞死亡，这一过程被称为“失巢凋亡”（anoikis）。相比之下，已对失巢凋亡产生抵抗力的肿瘤细胞/CTCs则能在脱离原发部位后存活，并通过循环和淋巴系统到达远处部位。一旦进入循环，CTCs会承受新环境中固有的各种应激，特别是免疫系统应激，大量研究致力于了解CTCs能够逃避免疫系统监视的免疫抑制机制。此外，癌细胞可以与其他细胞结合，形成有助于其在血流中存活的微栓子。目前已描述了多种细胞结合机制，包括CTC簇：通过增强细胞存活和减少凋亡，表现出更高的转移潜能；与具有反应性的血小板合作，充当抵御免疫系统攻击的盾牌或伪装；并与白细胞（主要是中性粒细胞）聚集在一起，这可能会促进细胞周期的进展，从而更有效地形成转移灶。对CTC的计数和分析为肿瘤的分子特征提供了宝贵的见解，并有助于识别启动转移的细胞。血液中CTC的数量、特定生物标志物（如癌症干细胞标志物）的表达与远处转移的发展之间存在直接相关性。CTC是表征和监测实体瘤的理想来源，因为它们可以进行基因组、蛋白质组、转录组和分泌组分析。尽管CTC在血流中数量稀少，但最近高科技方法的进步使单个CTC的检测和特征描述成为可能。
CTCs的富集和检测技术：由于CTCs在外周血中极其稀少，富集和检测高纯度的CTCs是一项重大挑战。CTCs在血流中的浓度极低，在大多数癌症患者中，通常每10ml血液中仅有1-10个细胞。因此，利用肿瘤细胞和血细胞之间的差异，包括细胞表面蛋白的差异表达或细胞的不同物理特性，可以实现CTCs的高效富集。要在癌症患者的临床治疗中常规使用基于CTCs的诊断方法，就必须将高通量和自动化CTCs分离技术与经过验证的下游检测方法相结合。目前已开发并验证了许多技术用于CTCs的富集、检测和分子表征，这些技术基于区分CTCs与血液中其他细胞的生物学特性（如表面蛋白/受体的表达）或物理特性（如大小、变形性、密度和电荷）（图1）。
基于生物学特性的CTCs富集通常采用免疫亲和方法，包括分别通过阳性选择和阴性选择来捕获CTCs或去除背景血细胞。在过去的20年中，作为上皮细胞骨架成分的角蛋白，已被确定为各类癌症患者中CTCs的检测标志物。许多CTCs检测方法采用了与美国食品药品监督管理局（FDA）批准的CellSearch®系统相似的原则，该系统多年来一直是“金标准”。在CellSearch®系统中，首先基于上皮细胞黏附分子（EpCAM）进行免疫磁珠富集CTC，然后对细胞进行荧光染色，上皮角蛋白（CK8、18和19）作为CTCs的标记物，通用白细胞抗原CD45作为排除标记物，并用核染料（DAPI）评估细胞完整性。可疑事件会使用自动化数字显微镜在照片库中列出。另一种基于免疫磁珠富集血液样本中CTC的方法是AdnaTest，该系统除了使用CelISearch®系统中的EpCAM标记的磁珠外，还包括一个检测肿瘤特异性mRNA转录本的PCR步骤。AdnaTest可以检测CTCs中的肿瘤特异性转录本变体，如EpCAM、粘蛋白1（MUC一1）、人表皮生长因子受体2（HER-2）和雄激素受体剪接变体-7（ARV7）转录本。除了使用抗体标记磁珠进行CTCs的阳性选择外，其他方法，如基于亲和力的微流控装置，也被用于在各种癌症类型中选择CTCs。像“CTC-Chip”这样的装置设计有数千个抗体标记的微柱，用于从血液样本中捕获携带特定肿瘤抗原的CTCs。创新的“CTC-Chip”设计通过延长抗体标记微柱与CTCs的相互作用时间，增强了细胞捕获能力，从而改善了结果。EPISPOT（上皮免疫斑点法）等功能检测可检测单个CTCs，已在多种癌症类型中取得成功，包括乳腺癌、结肠癌、前列腺癌和黑色素瘤。该方法通过在持续24-48h的短期培养中评估特定蛋白质的分泌、脱落或释放情况来检测CTCs的存在。转移起始细胞（MIC）分析是另一种功能性检测方法，用于分析从血液中获得的CTCs在体内对周围基质的侵袭性，有助于对其进行表征，并提供关于肿瘤分期和亚型的见解。靶向非CTCs细胞（如白细胞和红细胞）的复染标志物也已用于富集血液样本中的CTCs，并且为此目的开发了EasySep去除试剂盒等技术。其他方法，如RosetteSep方法则结合了一个额外的密度梯度离心步骤来增强CTC的富集，阴性选择方法有其局限性，因为存在其他血液成分（如CD45阴性的内皮细胞）交叉污染的可能性，并且在大量白细胞去除步骤中丢失CTC的风险增加。
依赖生物物理特性的CTCs富集技术，通常被称为“无标记”（label-free）方法，利用CTCs的独特属性（包括其特定密度、大小、变形性和电荷）将其从血液中分离出来。人们已探索了多种技术来识别和分离CTCs，例如基于与白细胞相比的物理特性差异进行分离。例如，CellSearch®PC1系统是一种半自动化的微流控装置，可独立于表位进行操作，它基于细胞的大小和变形性，从全血中捕获并随后收集稀有细胞，包括CTCs。此外，Parsortix系统于2022年5月获得FDA批准，用于转移性乳腺癌的CTCs富集。同样，基于大小的富集微流控装置，如2D膜微过滤器（例如CelISearch®、Parsortix®和ISET®）和3D膜微过滤器(例如FaCTChecker和Resettable Cell Trap)，用于根据CTC的大小和/或变形性分离单个CTC或CTC簇（例如Cluster-Chip)。然而，尽管这些方法基于尺寸排阻原理，但当CTCs的大小与白细胞相似时，其应用存在局限性。因此，开发了使用抗EpCAM抗体标记微珠的选择性尺寸放大技术，以提高细胞回收率和纯度。CTCs与正常血细胞之间的变形性差异已被用于通过微流控通道分离CTCs。基于微流控装置的近期发展（如Celsee系统），在检测CTCs方面显示出比基于表面标志物的系统更高的灵敏度，但在检测小型CTCs方面仍存在挑战。此外，诸如ApoStream®设备等技术，通过分析表面电荷和极化性差异，已在某些癌症中证明能增强CTCs的检测和回收率。包括ScreenCell®系统在内的富集后技术，成功分离和回收单个CTC，使得通过下—代测序（NGS）技术（如lon Torrent CelISieve®系统）进行高级突变分析成为可能。
二、循环肿瘤DNA（ctDNA）
ctDNA是肿瘤细胞凋亡、坏死或主动分泌后释放到血液中（或其他生物体液）的DNA，它只占整体循环游离DNA（cfDNA）的有限部分，cfDNA在生理条件下主要来源于正常细胞。大多数cfDNA片段的长度通常在143至180bp之间，对应于核小体内部的DNA长度。这些片段在血液中的半衰期为16min至2.5h。cfDNA可在血液、尿液、脑脊液、胸腔积液和粪便等样本中检测到。对于涉及血液分析的研究，血浆通常被认为是更适合进行ctDNA分析的来源，因为血浆中来自非肿瘤细胞的cfDNA背景较低。ctDNA也可能来源于血流中破裂的CTCs，但其对总ctDNA的定量贡献尚不明确，很可能取决于癌症分期和治疗情况。1948年，Mandel和metais率先描述了血液中的核苷酸，1989年，Stroun等人首次鉴定了ctDNA。ctDNA测序可识别肿瘤突变，将其与cfDNA区分开来。研究表明，肿瘤水平的变化不仅限于数量，来自肿瘤患者血浆的ctDNA样本序列显示了致癌基因的突变。此外，血浆中的ctDNA水平会因肿瘤负荷、肿瘤分期和治疗反应等因素而波动。在精准医疗中，ctDNA的临床应用不仅限于定量分析，还包括对血浆中存在的变异进行分析。因此，ctDNA是分析癌症基因组突变以用于诊断、预后和治疗反应预测的合适生物来源。此外，由于ctDNA可以从所有转移部位释放，它不仅可能代表原发肿瘤的基因组图谱，还可能反映肿瘤内克隆异质性。
ctDNA的富集和检测技术。在ctDNA的处理/分析过程中，多种因素可能导致结果出现差异，从而影响ctDNA的临床验证。这些因素包括：采血管的选择、样本采集与血液处理之间的时间间隔（部分可通过选择合适的采血管来缓解），以及DNA提取方法和样本储存的决策。血浆样本应在采集后6h内进行处理，以避免白细胞溶解，否则可能增加非肿瘤来源cfDNA的含量。存在多种提取cfDNA的方法，包括离心法、免疫磁珠法、基于硅胶柱的富集法、聚合物介导的富集法、酚一氯仿提取法和真空抽提法。然而，这些方法需要进一步的标准化和统一。方法的选择取决于所需的DNA纯度和自动化水平。鉴于目前的DNA提取方法无法区分ctDNA和cfDNA，因此在提取DNA后检测ctDNA中的基因组变异至关重要。分析ctDNA主要有两种方法，一种是靶向分析方法：专注于分析与特定肿瘤类型相关的基因组区域内的特定基因重排或突变；另一种是非靶向分析方法：全面分析和监测肿瘤基因组，揭示核苷酸改变、拷贝数畸变、染色体变化等信息，而无需依赖先前的分子变异数据。
检测技术的进步，如微滴式数字PCR（ddPCR）和大规模平行测序（MPS）（包括下一代测序、数字聚合酶链式反应、实时荧光定量PCR、质谱分析和超甲基化分析），如今在识别生物样本（包括体液流出物）中癌症特异性遗传和表观遗传变化方面提供了前所未有的灵敏度和准确性。这些技术所提供的超高精确度在最近利用ctDNA管理癌症患者方面取得的重大进展中发挥了关键作用。具体技术的选择取决于多种因素，例如待分析基因的数量、样本中ctDNA的含量、遗传或基因组改变的性质以及成本考量。ddPCR涉及将样本DNA(包含目标DNA和背景DNA)分割成大量独立的微滴或分区。随后，在每个微滴内对目标序列进行终点PCR扩增，并通过计数(使用荧光探针)来量化阳性微滴和阴性微滴的相对比例，这种方法允许对目标样本进行相对定量。2003年，Vogelstein等人描述了一种新版本的技术“BEAMing”（磁珠、乳化、扩增和磁性），该技术使用水性微液滴、磁珠检测和计数遗传变异。BEAMing已成功用于液体活检。然而，它需要复杂的实验过程，限制了其在临床的广泛应用。
与基于MPS的方法相比，ddPCR实验灵敏度更高、设置更简单、处理速度更快，而且不需要复杂的信息支持。不过，ddPCR需要事先了解基因或表观遗传学的变化。通常，ddPCR使用单个肿瘤特异性突变或从先前基因组分析中获得的有限基因组合（panel）。相比之下，MPS提供了广泛的多重检测能力，理论上能够识别新的遗传或表观遗传修饰。然而，MPS耗时较长并且需要强大的信息学支持。全基因组测序（WGS）或全外显子组测序（WES）策略适用于拷贝数畸变、点突变和其他遗传异常，但在ctDNA分析中，这些策略往往导致测序覆盖率低，灵敏度降低。使用癌症特异性基因panels的靶向MPS，其初始分析灵敏度大约为2%，但通过采用高灵敏度和优化的流程已得到提升。如安全测序系统、标记扩增子深度测序等创新技术，以及碱基位置错误率分析和基于深度测序的癌症个性化分析等减少错误的策略，有效地将检测阈值降至0.01%以下。
三、循环游离RNA（cfRNA）
cfRNA是指存在于血液等体液中，且未包裹在细胞复合物内的RNA分子。cfRNA由多种细胞类型（包括癌细胞和非癌细胞）释放。对cfRNA的分析不仅仅局限于评估特定基因的表达丰度；它还考虑了其他因素，例如致病性可变剪接或RNA编辑，这些变化仅在转录组中可检测到，而在基因组中则无法发现。鉴于这些考量，近年来对cfRNA的关注度已逐渐超过ctDNA。cfRNA被包裹在细胞外膜囊泡内或形成核糖核蛋白复合物，这保护其免受核酸酶活性的降解。cfRNA片段以多种形式从不同的体液中获得，例如血清、血浆、尿液、胆汁和脑脊液。此外，cfRNA表现出对RNase降解的抵抗能力，从而在体液中保持其稳定性。这种稳定性使得cfRNA成为基于液体活检诊断方法的有前景的候选者。cfRNA包含多种RNA类型，包括微小RNA（miRNA）、转运RNA（tRNA）、piwi相互作用RNA（piRNA）、长链非编码RNA（IncRNA）、核小RNA（snRNA）、核仁小RNA(snoRNA)和Y RNA，它们源自不同的细胞和组织。由于miRNA在血液中的稳定性增强，cfRNA领域的大量研究都集中在miRNA上，将其作为血液循环中潜在的疾病生物标志物。然而，人们对探索长链RNA（>200nt）(包括mRNA和IncRNA）的兴趣与日俱增。作为信号分子，它们参与细胞通讯并可能发挥调控作用，影响肿瘤微环境并影响肿瘤的进展和侵袭。
cfRNA的富集和检测技术。从血液样本中获得的cfRNA近似反映了特定时刻个体的转录组状态。因此，cfRNA的处理和分析涉及多种可能导致结果差异的因素，包括采血管的选择、样本采集与血液处理之间的时间间隔（部分可通过选择合适的采血管来缓解）、以及关于RNA分离方法和样本储存的决策。从生物体液中提取RNA的主要方法是使用专门为血浆和/或血清定制的RNA提取试剂盒。从血浆中分离RNA时的一个重要问题是DNA污染的风险，因为大多数cfRNA分离试剂盒会同时回收体液中存在的一部分游离DNA。然而，可以采用多种技术来减轻这些偏差，包括：保持提取试剂盒选择的一致性、使用外参（spike-ins）评估RNA提取效率、检查RNA质量欠佳的样本、以及采取措施消除DNA污染。鉴于输入RNA的数量和质量显著影响下游流程，对于血液来源RNA的最佳定量方法尚未达成共识。迄今为止，对于低RNA浓度的样本，评估cfRNA质量和数量最常用的方法是基于分光光度法，例如Qubit和Agilent 生物分析仪系统。为了定量cfRNA，主要采用了三种方法评估RNA转录本:i)实时定量反转录(qRT-PCR)；ii)微阵列平台； iii) NGS(见图1)。
四、肿瘤相关的细胞外囊泡（EVs）
EVs被定义为细胞自然释放的颗粒，由脂质双分子层包裹，不具备复制能力。EVs的生物发生是一个复杂且受调控的过程，其亚型(主要是外泌体、微囊泡和凋亡小体)之间存在差异。外泌体起源于内体途径，多泡体(MVBs)在与质膜融合时将其腔内囊泡释放为外泌体；微囊泡也称为胞外体，由质膜直接向外出芽形成;凋亡小体则是在程序性细胞死亡(凋亡)过程中释放的较大囊泡。根据其来源不同，它们的生物学功能也不同。外泌体是一类直径为30~150nm的EVs，在建立转移前微环境和影响癌细胞器官趋向性中发挥作用。根据其大小和来源，它们展现出不同的生理和病理功能。这些囊泡含有蛋白质、脂质和核酸(DNA和RNA)等生物活性分子，这些分子反映了来源细胞的生理状态。这种组成使它们成为预测治疗结果和预后的潜在候选者，也能通过特定的细胞-细胞相互作用将治疗药物递送至病变细胞。例如，癌细胞释放的EVs通过促进血管生成、免疫逃逸和转移来推动肿瘤进展。于EVs参与多种细胞功能，包括免疫反应调节、细胞信号传导和疾病进展，人们对理解EVs生物学的兴趣日益浓厚，同时对开发先进的EVs富集和检测技术的需求也在增长。
EVs富集与检测技术。随着人们对EVs兴趣的持续增长，对准确且灵敏的富集和检测技术的需求也在增加（见图1）。超速离心法，尤其是密度梯度超速离心法，是分离高纯度EV的最常用方法之一。然而，这种方法在检验医学中并不容易使用，因为它往往耗时且产量低。基于大小的EV分离方法包括：（1）超滤法：使用具有预定截留分子量的膜过滤器，但存在因施加力而导致囊泡破裂或变形的风险，影响下游分析；（2）尺寸排阻色谱法（SEC）；可有效用于EVs分离，它能去除高丰度蛋白质，通常需要使用多样化色谱柱进行多次分离操作，该方法利用聚合物在色谱柱中形成多孔固定相，通过重力流或液相色谱系统实现不同大小颗粒的差异洗脱；（3）场流分离技术（FFF）；样本被引入分离室后，抛物线流推动其沿分离室长度方向流动，同时，使用交叉流分离样本中的颗粒，较大的颗粒被推向分离室壁附近（此处抛物线流较慢），因此，较大的颗粒在较小的颗粒之后洗脱出来，而较小的颗粒保持在抛物线流中心，洗脱较早。此外，基于免疫亲和捕获的技术依赖于抗体的使用，根据特定抗原的表达来捕获EV，抗体可附着在板、磁珠和微流控设备上。具有高灵敏度的高通量液滴数字酶联免疫吸附试验（ELISA）将液滴生成、处理和分析并行化，实现了比典型微流控技术高出100多倍的通量（约2000万个液滴/分钟）。为此，已开发出几种商用EVs分离试剂盒，这些试剂盒包括用于EV纯化的分离前和分离后步骤，可去除脂蛋白和聚合物材料等非EV污染物。流式细胞术是另一种高通量技术，可同时分析单个EV的多种物理和化学特性，从而确定EV的表面标记、大小和复杂性，这使其成为临床应用和生物标记物发现的重要工具。表征与定量方法：为了表征和定量分离出的EVs，会使用电子显微镜、纳米颗粒追踪分析（NTA）、蛋白质印迹、蛋白质组学以及RT-PCR和NGS等分子方法。尽管EV分离和富集技术发展迅速，但这些技术在各种临床应用方面仍面临挑战。样本预处理、分离效率、标准化、EV异质性，以及最重要的EVs货物（cargo）的产量等问题，给该领域的研究人员带来了重大挑战。细胞外囊泡检测技术的选择取决于具体的研究目标、生物样本的性质以及所需的细节水平。
五、肿瘤教育血小板（TEPs）
血小板在止血、血栓形成、免疫、炎症和转移中扮演着核心角色。血小板与癌细胞之间的相互作用具有多种促癌效应，包括促进肿瘤生长、诱导EMT、维持癌细胞存活、促进癌细胞粘附和滞留、转移前微环境建立及促进转移。血小板主要在骨髓、肺部甚至血流中由其祖细包巨核细胞形成。尽管血小板缺乏细胞核，但其从巨核细胞遗传而来的转录组会被翻译成蛋白质，并分布在不同的血小板颗粒中。在多种刺激存在时，血小板颗粒被保留在血小板内，而其激活则会触发颗粒内容物的胞吐作用。利用先进的测序技术，已在血小板中鉴定出多种RNA家族，如未剪接的前体RNA（pre-RNA）、mRNA、miR、rRNA，以及用于pre一RNA加工的功能性剪接体。在其生命周期中，血小板通过受体直接与癌细胞相互作用或通过信号分子间接作用，这种相互作用导致血小板活化，释放出多种分子，这些分子可提供促肿瘤转移的微环境，并可能诱导EMT。血小板-癌细胞的直接相互作用以及血小板来源的转化生长因子β（TGFβ）介导的接触依赖性信号传导可激活NF-κB通路，导致癌细胞获得间质特征并增加转移潜能。Jiang等人证实，转移性癌症患者体内存在血小板包裹的CTCs。引入“血小板教育肿瘤”(PET）的概念表明，血小板可通过直接接触、内化或通过EVs等不同机制，高效地转移脂质、蛋白质和RNA，从而影响癌细胞。
最近，我们使用永生化CTC细胞系证明，它与CTC条件培养基孵育会诱导血小板聚集和活化。这支持了CTC与血小板之间的相互作用在血流循环中维持CTC完整性方面发挥作用的假说。Best等人的研究强调了血小板在液体活检中的临床应用价值。该研究对健康个体和癌症患者的血小板RNA谱进行了机器学习，开发出了用于泛癌诊断、确定肿瘤位置以及识别驱动疾病的致癌性改变的分类算法。最近，在一个更大的队列研究中，在三分之二的样本中以99%的特异性检测到癌症的存在，这凸显了TEP衍生的RNApanels作为当前血液癌症筛查方法补充的潜在特性。除了转录组学，血小板蛋白质组学也显示早期患者与健康样本之间存在显著差异。
TEPs富集与检测技术。血小板的分离很容易，但在处理过程中防止其活化非常重要，因为这会影响其分子和形态特征。因此，要获得完整的血小板，应避免使用强大的机械力或生化作用力。然而，必须优化快速有效的技术，从少量血液中分离血小板。应使用1.2mm静脉插管小心抽取血液，以减少采血过程中血小板的活化。由于不同药物会影响血小板功能，因此准确记录患者接受的每一项治疗至关重要。TEPs可在采血后48h内进行分离，从而为分子检测提供高质量的RNA。NGS技术彻底改变了TEPs的基因组分析，允许对包括编码和非编码转录本在内的RNA进行全面分析。对TEPs进行全转录组测序能够识别肿瘤来源的信号特征，从而深入了解原始肿瘤的分子图谱。评估血小板对各种刺激的反应性至关重要，功能性检测（如聚集试验和流式细胞术）在揭示分子变化的功能意义方面发挥着关键作用。通过对血小板蛋白质组成进行深入定量分析，可对结构和功能通路进行比较评估。这也有助于更好地理解与止血和血栓形成相关的生理和病理生理过程。将转录组学、代谢组学和生物信息学等多学科方法与蛋白质组学技术的最新进展相结合，将有助于理解血小板的分子机制。因此，在各种环境条件下对血小板蛋白质组进行彻底检查，可能有助于阐明血小板在疾病中或血小板高反应性相关的复杂功能机制，并为抗血小板药物提供新的靶点。
编译节选自: Cell Adh Migr. 2024 Sep 1;18(1):1–26.
