BRCA1启动子甲基化在卵巢癌中的临床意义及基于片段分析的新型诊断方法
【摘要】同源重组修复缺陷(HRD)检测,如MyChoice CDx,是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂的伴随诊断。BRCA1启动子高甲基化是HRD的主要原因之一,可能与较差的预后相关。本研究旨在开发一种简单、准确的方法来检测BRCA1启动子高甲基化,并阐明此类病例的特征。采用亚硫酸氢盐测序(BIS-seq)分析高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)样本中的BRCA1启动子甲基化。我们开发了一种新型的BRCA1甲基化检测方法，即BRCA1甲基化片段分析(BRCA1-FAM),该方法结合了限制性内切酶消化与片段分析技术。该检测的准确性通过与BIS-seq结果的比较进行评估,评估了BRCA1启动子高甲基化与预后的关系,并研究了其与BRCA1表达和杂合性缺失的关联。在分析的病例中,BRCA1突变和启动子甲基化相互排斥,在初次肿瘤细胞减灭术(PDS)病例中甲基化发生率为28.9%(22/76)。BRCA1-FAM检测BRCA1启动子高甲基化的灵敏度(91.3%)和特异性(100%)均较高,与BIS-seq相当。BRCA1启动子高甲基化病例的无进展生存期(PFS)显著更差(log-rank检验,p=0.048)。在这些病例中,86.4%显示BRCA1免疫组化染色异常,与其他组相比，BRCA1杂合性缺失的频率较低。BRCA1启动子高甲基化与不良预后相关,强调了其在HRD分层中的重要性。BRCA1-FAM是一种简单且高度准确地评估BRCA1启动子甲基化的方法,该方法可能有助于提高卵巢癌个性化治疗的精准度。
【关键词】BRCA1；DNA片段化；DNA甲基化；同源重组修复缺陷；卵巢癌
同源重组修复缺陷(HRD)是指细胞无法通过同源重组修复途径准确修复DNA双链断裂。众所周知，约半数高级别浆液性[卵巢癌(HGSOC)卵巢癌最常见的组织学亚型]表现出HRD HRD肿瘤对聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂特别敏感，这些抑制剂显著改善了HGSOC的预后。因此，确定PARP抑制剂治疗的适用性需要进行HRD检测。乳腺癌易感基因(BRCA)1/2在同源重组修复中起关键作用，BRCA1/2的致病性突变以及BRCA1启动子的DNA甲基化是HRD的关键原因。此外，HRD最常见的原因是胚系或体细胞BRCA1/2突变，占HGS0C的20%。HRD的第二大常见原因是BRCA1启动子区域的DNA甲基化，尽管不同研究的报告发生频率有所差异，但据估计，美国和欧洲约10%的HGS0C病例存在BRCA1基因启动子高甲基化，与同源重组修复通路相关的其他基因突变也可能导致HRD。BRCA1启动子甲基化通常与其他HRD机制相互排斥(如BRCA1或BRCA2的胚系或体细胞突变)。在HRD肿瘤中，BRCA1致病性突变与总生存期(0S)延长相关，而BRCA1甲基化的预后意义仍存在争议。与体细胞BRCA1突变不同，BRCA1启动子甲基化更容易发生逆转，铂类药物治疗后甲基化丢失可导致早期复发或对PARP抑制剂产生耐药性。因此，除了单纯确认HRD状态外，识别HRD的具体原因对于优化临床结局至关重要。尽管亚硫酸氢盐测序(BIS-seq)和甲基化芯片是检测DNA甲基化的两种主要方法，但因复杂性和高成本方面存在局限性。因此，建立一种临床适用的甲基化检测方法来识别预后不良的BRCA1甲基化病例至关重要。本研究旨在阐明甲基化的肿瘤特征，并建立一种结合甲基化敏感限制性内切酶消化和片段分析的简单准确的甲基化检测方法。
一、材料与方法
1. 患者选择：回顾性纳入2015年3月至2022年4月在东京大学附属医院接受初次肿瘤细胞减灭术(PDS）作为初始治疗的FIGOI-IV期HGSOC患者。收集新鲜冷冻肿瘤组织和临床资料，通过病历对预后结局进行随访，截至2023年11月。队列A（n=70）接受BRCA1启动子BIS-seq和BRCA1-FAM；队列B（n=76）接受BRCA1-FAM；队列C（n=58）接受BRCA1-FAM，并通过基因检测（MyChoice CDx，BRACAnalysis CDx，TodaiOncoPanel）确认BRCA1突变状态。
2. 临床样本处理：切除后立即将组织分装，液氮速冻，-80℃保存。所有操作均按照本机构审查委员会批准（编号G0683），所有患者签署知情同意书。
3. 基因组DNA提取：使用商业化试剂盒（QIAampDNA Mini Kit）提取基因组DNA。使用荧光定量法( Qubit dsDNA BR Assay Kit )测定DNA浓度。
4. BRCA1启动子BIS-seq：使用商业化试剂盒(EpiTect Bisulfite Kit)对基因组DNA进行亚硫酸盐转化，用特异性引物扩增目标区域（Chr17：43,125,277-43,125,553），扩增产物在MiSeq平台上进行高通量测序，以确定每个胞嘧啶残基的甲基化等位基因比例。
5.BRCA1-FAM：设计了两组引物，用于特异性扩增位于甲基化敏感性限制性内切酶HinP1I识别序列内的CpG位点。这些位点—CpG#1（Chr17：43,125,305–43,125,306),CpG #6(43,125,377–43,125,378）和CpG#9（43,125,411–43,125,412）—是基于BIS-seq分析选择的。检测CpG#1的引物定义为Run 1，检测CpG#6和CpG#9的引物定义为Run 2。Run 1（CpG #1）：基因组DNA分别进行Sac单酶切、Sacl+HinP1|双酶切，酶切后PCR扩增，两份PCR产物等量混合，使用3730xI DNA分析仪进行荧光标记片段的片段分析，测量每个片段的荧光强度一HinP1酶切IC（内参扩增子）、HinP1未酶切IC、HinP1I酶切Me（甲基化扩增子）和HinP1未酶切Me，计算HinP1I酶切IC与HinP1I未酶切IC比值，并乘以HinP1I未酶切Me，最后，将该结果除以HinP1酶切Me的值来计算甲基化率。Run 2（CpG #6 & #9）：基因组DNA进行HinP1I酶切，酶切反应和PCR扩增同上进行，计算HinP1酶切IC和HinP1I酶切Me的荧光强度，通过计算Me峰高/IC峰高比值确定甲基化率。
6. 甲基化特异性多重连接依赖性探针扩增(MS-MLPA)：采用MS-MLPA评估BRCA1的甲基化和杂合性缺失(LOH)，使用MS-MLPA探针组(MRC-Holland)进行实验操作，并按照制造商的说明分析结果。按标准流程进行，DNA变性、探针杂交，然后将样本分为两组，一组用于拷贝数分析，另一组加HinP1I用于甲基化分析。PCR扩增后使用3730xI DNA分析仪对进行分析，并使用配套软件(Coffalyser.Net)进行数据分析。
7. 全外显子组测序(WES)：根据样本情况采用两种建库方法之—(Twist Library EF Kit或内部流程)。
8. 免疫组织化学（IHC）：将福尔马林固定、石蜡包埋的组织块切成4μm厚切片。标准流程进行抗原修复、封闭、抗体孵育（4℃过夜）、显色、苏木精复染，脱水并封片。根据显示染色的肿瘤细胞核百分比评估BRCA1 IHC染色模式，三名评估者独立评估样本，存在分歧时通过共识讨论达成最终决定。保留为>10%的肿瘤细胞核染色，丢失为<5%，不确定为5%-10%或缺乏有效对照。保留正常、丢失和不确定染色模式的结果。
9. 统计分析：使用Easy R（EZR）和DeLong方法计算曲线下面积（AUCs），AUC的95%置信区间（Cl）由EZR自动计算。Kaplan-Meier生存分析，并计算双侧95%Cl，使用log-rank test比较生存曲线并评估组间生存率的差异，统计学显著性设定为p<0.05。
二、结果
1. 约三分之一HGSOC中观察到BRCA1启动子区域的DNA高甲基化：使用队列A的样本进行BIS-Seq。通过BIS-seq计算每个胞嘧啶残基的甲基化水平，将平均甲基化水平大于0.1定义为存在BRCA1甲基化（见图1A），使用BIS-seq检测的甲基化率为32.9%（23/70）。
2. 利用片段分析建立一种简单准确的BRCA1甲基化评估方法：对于BRCA1-FAM，基于BIS-seq分析的序列，设计了两组包含限制性内切酶识别位点（CpG#1，CpG#6和CpG #9)的引物。引物Run1设计用于检测位点CpG #1，引物Run 2设计用于检测位点CpG#6和CpG#9。在甲基化病例中，可以识别到Me峰，如图1B左侧图所示，而在非甲基化病例中，未检测到Me峰，如图1B右侧图所示。对于Run 1和Run 2，FAM计算的甲基化率与BIS-seq计算的甲基化率均呈现强相关性( Run 1: R²=0.89, p < 0.001 ;Run 2: R²=0.79, p < 0.001 )（见图1C）。基于与BIS-seq结果的一致性，计算了每组引物检测甲基化的临界值（cut-off）。相应的AUC分别为0.99(95% CI： 0.98-1.00 ) 和1.00(95% CI：0.99-1.00)，临界值分别为17.3%和1.79%。使用队列A的样本比较了BRCA1-FAM与BIS-seq的准确性，Run1相对于BIS-seq的灵敏度和特异性分别为91.3%和100%，而Run2的灵敏度和特异性分别为95.7%和97.9%。通过结合两组引物，BRCA1-FAM相对于BIS-seq的灵敏度、特异性、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）分别为91.3%、100%、100%和95.9%（见图1D）。因此，如果两组引物的结果均超过临界值，则样本被归类为甲基化。使用BRCA1-FAM检测的甲基化率为30.0%（21/70）。所有在BIS-seq中平均甲基化水平低于0.1的样本均被判定为非甲基化，而高于0.3的样本则被归类为甲基化（见图1E）。我们随后比较了BRCA1-FAM与之前建立的方法MS-MLPA（可同时评估基因甲基化模式和拷贝数变化）在检测BRCA1 DNA甲基化方面的准确性。对队列A中可分析的69例样本进行了MS-MLPA分析，BIS-seq与MS-MLPA之间的一致性率为89.9%，而BIS-seq与FAM之间的一致性率为97.1%，表明FAM比MS-MLPA更准确。
3. BRCA1甲基化的患者预后不良：在接受BRCA1-FAM分析的76例病例（队列B）中，28.9%（22/76）存在甲基化，71.1%（54/76）为非甲基化（图2A）。对52例肿瘤和血液样本进行了BRCA1基因检测，其中17例显示BRCA1致病性突变，22例BRCA1甲基化患者均未检测到BRCA1突变。为了评估BRCA1甲基化对预后的影响，将队列C（包含58例接受了BRCA1-FAM检测并具有BRCA1突变信息的病例）分为三组：BRCA1突变组、BRCA1甲基化组以及两者均阴性组。比较这些组之间的无进展生存期（PFS）（图2B）和总生存期(0S）（图2C）。组间PFS存在显著差异(log-rank检验，p=0.048)。BRCA1突变组的中位PFS为43.6个月，BRCA1甲基化组为18.2个月，两者均阴性组为43个月。BRCA1突变组的中位0S为73.1个月，BRCA1甲基化组为48.6个月，两者均阴性组尚未达到。生存分析表明，BRCA1甲基化组患者的预后比BRCA1突变组患者更差。
4. BRCA1表达模式与预后无关:IHC是检测HGS0C中BRCA1蛋白表达丢失的有效方法。使用识别BRCA1 N末端区域的抗BRCA1小鼠单克隆抗体MS110，根据肿瘤细胞核的染色率评估BRCA1 IHC染色模式。“正常”模式表示染色保留，而“异常”模式包括染色丢失或不确定(图3A)。基于队列C的评估，尽管无统计学意义，但甲基化组中不确定病例的比例(22.7%,5/22)高于突变组(11.8%,2/17)。在BRCA1甲基化病例中，86.4%(19/22)存在异常IHC模式，而BRCA1突变病例中该比例为70.6%(12/17)（图3B)。异常IHC模式的PPV为79.5%，总体正确分类率达77.6%。在16例具有详细BRCA1变异信息的病例中，11例表现为异常IHC模式，5例显示正常模式。图3C总结了BRCA1突变位点、IHC结果与抗体表位区域。与既往研究一致，基于突变类型和位点预期的染色模式并非完全匹配，且突变位置与IHC染色模式间未观察到相关性。最后，比较BRCA1IHC模式正常与异常的病例，其PFS和0S均未显示显著差异(图3D)。
5. BRCA1等位基因拷贝数失衡的频率因BRCA1状态而异：LOH对BRCA1功能的完全丧失至关重要，在携带BRCA1胚系突变的HGS0C中发生率超过90%，然而，其在BRCA1甲基化中的作用尚不明确。MS-MLPA通过拷贝数变化检测LOH，无法识别拷贝中性LOH，后者占HGSOC病例的40%。尽管存在检测40%L0H的局限性，我们仍评估了BRCA1基因组/表观基因组状态与BRCA1拷贝数失衡之间的关系。总体而言，BRCA1等位基因的拷贝数失衡在69例HGS0C病例中发现20例（29.0%）（图4A），对预后无影响（图4B）。35.3%的突变病例、10%的甲基化病例和28.6%的双阴性病例存在BRCA1等位基因拷贝数失衡，提示BRCA1甲基化可独立于拷贝数失衡引起HRD。值得注意的是，在无BRCA1突变或甲基化的患者中也观察到了BRCA1等位基因的拷贝数失衡（图4C）。
三、讨论
本研究旨在开发一种简单准确的检测方法并阐明BRCA1甲基化的临床意义。我们成功建立了一种基于片段分析的简便、精确的BRCA1-FAM检测方法。此外，我们再次证实BRCA1突变与BRCA1甲基化相互排斥，并且存在BRCA1甲基化的患者比存在BRCA1突变的患者预后显著更差。BRCA1启动子区域的DNA甲基化在HRD肿瘤的预后分层中起着至关重要的作用。据报道，它在癌症的最早期阶段就已存在，并直接抑制BRCA1表达。DNA甲基化是一种化学性质稳定的表观遗传修饰，可在细胞分裂过程中准确传递和维持。然而，与BRCA1突变相比，BRCA1甲基化更有可能通过去甲基化逆转，从而有可能恢复BRCA1功能。这种恢复可能影响HRD状态并导致药物耐药性。与先前报道一致，我们发现BRCA1甲基化患者预后较差。此外，我们在日本人群中观察到BRCA1甲基化的高发生率。在JG0G-TR2队列中具有HRD特征的患者中，35%的病例存在BRCA1甲基化，这一频率与我们的研究结果相当。在乳腺癌中，据报道BRCA1甲基化在亚洲人中比在白种人中更常见，卵巢癌中可能也存在同样的趋势。亚洲人因BRCA1甲基化导致癌症发生的频率较高，加上相关的不良预后，凸显了迫切需要一种准确且易于操作的方法来评估BRCA1甲基化以指导治疗计划。
检测BRCA1甲基化的方法多种多样，包括甲基化敏感性限制性内切酶消化、甲基化特异性聚合酶链反应、MS-MLPA、BIS-seq以及甲基化芯片。然而，BRCA1甲基化的频率存在显著差异。这种差异被认为是由于评估的BRCA1甲基化区域缺乏一致性以及所采用的评估方法不同所致。BRCA1启动子内最重要区域是靠近外显子la的CpG岛。从外显子1附近EcoRI位点到Sacl位点(Chr17:43,125,365-43,125,595)的关键调控区域是BRCA1基因表达的重要调节因子。随着该区域甲基化的进展，基因表达受到抑制，导致BRCA1功能下降。在本研究中，采用BIS-seq技术对BRCA1基因从-189位点至外显子1(Chr17:43,125,277–43,125,553)的区域进行了分析。 BRCA1启动子区域内的不同CpG位点参与多种调控机制。因此，分析多个位点而非单个位点可更准确地检测甲基化变化并提高诊断准确性。在本研究中，我们成功建立了一种高度准确的分析方法，使用针对该序列内三个CpG位点的两种引物。BRCA1-FAM不需要亚硫酸氢盐转化，操作简便、成本低廉且准确性高，有望成为临床应用的有力候选方法。此外，通过引物的进一步优化，未来有望建立使用液体样本的实时BRCA1甲基化评估方法。
除了BRCA1的基因突变和甲基化外，我们还通过免疫组化技术对BRCA1进行了评估，并评估了其对HGSOC患者预后的影响。然而，BRCA1免疫组化结果与HGSOC患者的预后无关。在组织免疫组化中，BRCA1的表达水平在肿瘤的不同区域可能存在差异，仅观察特定切片或区域可能难以全面了解整体情况。组织免疫组化是一种半定量方法，依赖于主观评估，这可能影响结果的可重复性。
因此，考虑到免疫组化的局限性，同时评估BRCA1突变和BRCA1甲基化至关重要。这种方法能更准确地理解BRCA1的基因组和表观基因组变化，有助于更好地预测患者预后并检测潜在的肿瘤变化，如去甲基化。我们证实，采用多维度方法准确检测BRCA1甲基化对评估HGSOC患者预后至关重要。此外，为实现临床应用，我们建立了一种简化的BRCA1甲基化评估方法，称为BRCA1-FAM。引入BRCA1甲基化检测有望为HRD肿瘤的预后分层和药物选择作出贡献。
编译节选自：Cancer Sci. 2025 Apr 9;116(7):1996-2007.
