液体活检：为癌症研究开辟新途径

         癌症是一个紧迫的全球性健康问题，它是最常见的致死原因之一，且其全球发病率正在持续上升。癌症的影响波及患者的生活质量，给患者、其家庭以及医疗保健系统带来巨大的生理、心理和经济负担。尽管旨在阐明癌症病理生理学的研究广泛开展，癌症管理也取得了显著进展，但大多数转移性癌症仍无法治愈，其5年生存率低于25%。此外，癌症常在晚期才被诊断出来，此时治疗往往效果有限，随着癌症的进展，肿瘤趋于多样化，显著影响其对治疗的反应。虽然治疗可以消除显性易感的癌细胞，但一小部分韧性细胞可能会持续存在并继续增殖。在过去的10年里，精准医学在肿瘤学研究中取得了突破性进展，该方法围绕对每位患者的肿瘤进行测序，并提供个体化的诊疗见解。诊断肿瘤和进行分子分型的传统金标准是组织活检。然而，这种方法面临一系列挑战，包括其有创（侵入）性及相关的并发症（如出血、损伤、感染、疼痛）、组织获取受限，以及与样本充分性相关的问题（如样本量不足和样本质量欠佳）。

         癌症诊断主要依赖组织活检，其仅能捕获整个肿瘤团块的部分信息，往往无法全面反映疾病的复杂性。再者，对于已发生转移的肿瘤，其在空间和时间上扩散并持续适应治疗，因此需要进行多次活检才能全面了解肿瘤的行为。同样，为了监测肿瘤反应和复发，在治疗期间通过有创操作持续获取活检样本，这对肿瘤特征分析构成了重大挑战。液体活检作为一种新型诊断概念被提出，克服了上述局限性，并提供了多种临床应用前景。“液体活检”这一术语由Alix-Panabières和Pantel于2010年提出，用以描述循环肿瘤细胞（CTCs）。随后，该术语已扩展至涵盖其他循环生物标志物，如循环肿瘤DNA（ctDNA）、循环游离RNA（cfRNA）、细胞外囊泡（EVs）和肿瘤教育血小板(TEPs）（图1）。液体活检在诊断中具有更高的灵敏度，且能在整个治疗过程中以便捷、无创的方式轻松实现重复采样。液体活检的用途不仅限于镜像组织活检，它是一种潜在的工具，能够揭示传统组织检测无法提供的关于患者癌症的独特且至关重要的信息。此外，液体活检在早期识别肿瘤方面的应用也是研究的重点。

         总之，这些肿瘤衍生成分（TDs）可以提供重要的纵向信息和数据，帮助病理学家对原发性和转移性肿瘤进行更精确的诊断。目前，PubMed上以“液体活检”为关键词检索出了10,000多篇论文，涉及几乎所有类型的癌症。因此，本文结合文献研究，重点阐述了这些分离组分在多种癌症类型的识别、预后判断及治疗中的应用。

一、液体活检的临床应用

         可重复获取的无创（非侵入性）血液样本用于：(i）预测M0期患者的复发或晚期癌症患者的转移进展；（ii）对患者进行分期和治疗分层；（iii）监测治疗效果、区分早期应答者与非应答者、追踪肿瘤演变以及识别耐药机制；（iv）微小残留病（MRD）的早期检测。

         1. 预后指标：评估患者治疗期间或治疗后发生不良结局的风险，对于确定是否适合进行更激进的治疗以及监测频率至关重要，对ctDNA/cfDNA和CTCs均进行了预后评估。

         (1）CTCs的预后价值：CTCs作为治疗反应和预后生物标志物的临床意义已被广泛研究。特别是在晚期乳腺癌或前列腺癌患者中，在全身性治疗背景下对CTCs进行连续计数，可提供早期且可靠的预后信息。De Bono等证明，CTCs计数是比血清前列腺特异性抗原（PSA）水平降低50%更优的治疗反应指标。此外，Heller等人利用包含6,081例转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）患者的五项随机试验数据发现，基线时未检测到CTCs以及基线时≥5个CTCs在治疗2周后转变为≤4个CTCs，对预测总生存期（OS）具有最强的判别能力。因此，CTCs已被提议作为评估mCRPC患者OS的临床试验中的替代终点。对于乳腺癌，一项大型多中心预后研究表明，连续CTCs计数在早期检测治疗失败方面优于传统的血清蛋白标志物（CA-15-3，CEA）。然而，在SW0G 0500干预性试验（NCT00382018）中，对于治疗21天后CTCs持续增加的转移性乳腺癌(MBC)患者，根据CTCs驱动选择治疗方式转换至替代性细胞毒性治疗并未延长OS。但在最近的STIC-CTC试验（NCT01710605）中，采取了相反的策略（即根据低CTCs计数识别可能不需要积极治疗的患者），该试验表明，CTCs计数是HR+/HER2-转移性乳腺癌患者在选择一线化疗还是内分泌治疗方面可靠的生物标志物，CTCs在该领域的临床有效性首次得到确立。通过对来自九个欧洲NSCLC CTC中心患者的汇总分析，评估了CTCs计数在转移性非小细胞肺癌（NSCLC）中的预后潜力。这些结果证实CTCs计数与较短的无进展生存期(PFS）和OS相关。此外，在晚期NSCLC患者接受一个周期化疗后，基于CTCs的监测显示，CTCs>5个的患者预后比<5个的患者更差。CTCs数量可受治疗干预的调节，较低的CTCs计数与更好的临床结局相关。

         (2）ctDNA的预后价值：ctDNA脱落定量分析可为多种肿瘤类型的晚期癌症患者提供强有力的预后信息。为了确定ctDNA百分比是否与临床结局相关，Schwaederle等人评估了168例不同癌症患者的ctDNA水平。当患者至少有一个基因改变且ctDNA>5%时，其0S和PFS显著更差。不同的泛癌分析证实，存在ctDNA时临床结局更短。Vu等人发现，较高的ctDNA改变总数与较差的0S存在独立的负相关性。比较ctDNA和组织DNA，在组织和ctDNA中具有相似TP53突变的患者，其生存期显著短于具有不同突变或无突变的患者。Ikeda等人利用ctDNA研究了一系列肿瘤类型中的间质-上皮转化（MET）改变，发现MET改变与显著更短的转移或复发时间以及更低的0S相关。Patel等人在一项针对胰腺癌患者的研究中也报告，较高的ctDNA总百分比是生存期更差的预测因素。Baumgartner等人在评估腹膜癌患者术前ctDNA时发现，无论组织学分级如何，ctDNA水平高的患者术后PFS更短。在接受或完成新辅助化疗的三阴性乳腺癌患者中检测到ctDNA时，其无病生存期（DFS）显著降短，ctDNA的存在可在术前预测OS和DFS。在一组局部晚期直肠癌患者中，无论是否进行辅助化疗以及是否有病理完全反应的证据，术后ctDNA的存在都表明疾病复发。Anandappa等人针对未接受辅助化疗的术后Ⅱ-ⅡI期患者的研究发现，ctDNA阳性与较高的复发率之间存在显著关联。

         2. 患者分层治疗：在转移性实体瘤中建立可行的改变对于实施精准医学治疗方法至关重要。传统上通过肿瘤组织活检的分子谱获得这些信息，而ctDNA/cfDNA和CTCs正在成为该领域有价值的替代方案。

         (1)CTCs在分层治疗中的应用：CTCs在识别接受激素治疗的患者中发挥作用。最近，SW0GS1216试验中一项针对转移性激素敏感性前列腺癌(mHSPC)患者的研究表明，在临床协变量调整后，与≥5个CTCs的患者相比，无CTCs的患者达到完全生化缓解的可能性显著较高，并且疾病进展和死亡风险显著更低。这表明基线CTCs计数是mHSPC患者在治疗开始时区分良好与不良治疗反应以及0S的有价值预后标志物。Magbanua等人开发了一种新型潜在混合模型，用于对化疗期间具有相似CTCs变化轨迹模式的患者进行分层。该方法揭示了预后不良患者的不同预后亚组，提示更有针对性的治疗可能获益。这种预后分类方法可用于完善基于CTCs的风险分层策略，并指导未来针对MBC患者的前瞻性临床试验。

         越来越多的证据表明，乳腺癌患者中CTCs的HER2或ER状态可能与其对应的原发肿瘤不同。此外，CTCs的HER2或ER状态可能随时间变化，特别是在疾病复发或进展期间。目前正在进行临床试验，以研究原发肿瘤为HER2-，但CTCs为HER2+的患者是否能从HER2靶向治疗中获益(如拉帕替尼或曲妥珠单抗)。为了预测HR+MBC患者对内分泌治疗的耐药性，Paoletti等人使用CellSearch®系统开发了一个多参数CTC内分泌治疗指数(CTC-ETI)。CTC-ETI整合了CTCs计数和对四个标志物（ER、BCL2、HER2和Ki67）在CTCs上表达的评估。CTC-ETI的临床相关性正在一项进行中的临床试验(NCT01701050)中进行评估。在转移性结直肠癌(mCRC)的一线治疗中，化疗方案FOLFOXIRI联合贝伐珠单抗比FOLFOX/FOLFIRI联合贝伐珠单抗更有效。然而，由于对毒性的担忧和缺乏预测性生物标志物，其应用并不广泛。分析CTCs计数作为患者选择生物标志物的作用显示，在基线CTCs计数≥3的患者中，一线FOLFOXIRI-贝伐珠单抗相比FOLFOX-贝伐珠单抗显著改善了PFS。因此，CTCs计数可能有助于选择适合强化一线治疗的患者。

         (2）ctDNA/cfDNA在治疗分层中的应用：cfDNA分析允许对肿瘤进行全面的基因组分析。通过识别特定的基因改变，如点突变、拷贝数变异和重排，临床医生可以深入了解肿瘤的分子特征。这些信息对于选择与个体基因组谱相匹配的靶向治疗至关重要。美国食品药品监督管理局（FDA）已批准了几种基于血液来源ctDNA的伴随诊断检测，其中包括可识别非小细胞肺癌EGFR突变的CobaseGFR突变检测V2，以及可识别乳腺癌PIK3CA突变的Therascreen PIK3CA RGQ PCR试剂盒。此外，FDA已批准FoundationOne Liquid CDx和Guardant360 CDx（两者均基于ctDNA的NGS）作为多种靶向治疗的伴随诊断和一般分子谱分析。这些诊断检测可能影响患者的治疗决策或使其有资格参加临床试验。许多研究探索了额外的ctDNA检测以寻找可成药性突变。其中一种难以治疗的疾病是原发灶不明肿瘤(CUP)，这些患者通常使用以紫杉类和/或铂类为基础的经验性化疗方案，总体效果不佳。Kato等利用ctDNANGS评估了442例CUP患者，发现80%显示ctDNA异常，66%存在≥1个特征性改变，几乎所有（>99%）都表现出潜在可靶向的突变。在后续的一项研究中，同一研究小组使用cfDNANGS panel检测了1931例CUP患者，在有临床可及数据的患者亚组中，药物与分子改变匹配度高的患者相比匹配度低的患者，临床获益率显著提高，表明了其临床实用性。ctDNA/cfDNA也可用于识别其他癌症类型中可能具有可干预（可采取治疗措施)突变。在一项针对62例转移性乳腺癌患者的研究中，Shatsky等发现68%的患者至少存在一种潜在的可干预突变。在妇科恶性肿瘤中，Charo等发现基于ctDNA检测到的突变进行的个性化治疗，其生存率显著优于非匹配治疗。在一组结直肠癌患者队列中，Choi等人发现76%的患者至少存在一个可干预突变。所有特征性的改变都可能是FDA批准的药物或临床试验中的实验性药物的潜在靶点。0kamura等人表明，在121例接受系统治疗的胆道恶性肿瘤患者中，76%至少存在一种ctDNA改变，其中80例患者接受了治疗，与接受非匹配方案的患者相比，那些通过ctDNA和/或组织DNA基因组分析接受分子匹配疗法的患者，其PFS显著延长，疾病控制率更高。

         3. 监测治疗反应和耐药机制：CTCs和cfDNA/ctDNA可作为反映肿瘤对治疗干预反应的动态生物标志物。监测治疗过程中的变化为临床医生提供了关于特定疗法疗效的宝贵信息。这种实时反馈能够及时调整治疗计划，优化患者治疗，并可能避免无效治疗带来的不必要副作用。除了CTCs数量，CTCs的分子表型也具有很强的预后价值。例如，晚期NSCLC患者CTCs中的程序性死亡配体-1（PD-L1）表达与不良预后相关。CTCs中PD-L1和Ki67的差异表达可能为接受帕博利珠单抗治疗的晚期NSCLC患者提供额外的预测信息。早期治疗期间PD-L1低表达亚群的变化与疾病控制(数量减少)和对免疫治疗的耐药性相关。

         雄激素受体（AR）是前列腺癌的关键靶点，当前许多针对mCRPC的疗法都靶向AR信号通路。正如Antonarakis等人首次证明的，雄激素受体剪接变异体7(AR-V7）经常出现在mCRPC患者的CTCs中，它预测了对恩扎卢胺和阿比特龙（两种药物均阻断AR通路）的治疗耐药性。在最近一项多中心前瞻性盲法研究中，Armstrong等人发现，治疗前存在CTCs AR-V7(+)与更差的PFS和OS独立相关，也与阿比特龙或恩扎卢胺治疗期间确认的PSA应答概率更低相关，这些发现表明CTCsAR-V7状态具有预后相关性。此外，在乳腺癌中，存在全长AR阳性CTCs和CTCs AR-V7(+)与治疗失败相关，提示AR抑制在原发性乳腺癌中可能无效。铂类耐药是卵巢癌临床实践中最为人熟知的挑战之一。卵巢癌CTCs的分子分析表明其对铂类治疗存在耐药性。虽然原发肿瘤中ERCC1蛋白的免疫组化未能预测铂类耐药，但在卵巢癌初诊时，ERCC1(+)CTCs确实能预测铂类耐药。一项包含8项研究，1,184例患者的荟萃分析显示，ERCC1(+) CTCs患者的OS和DFS显著短于ERCC1(-) CTCs患者。

         治疗过程中cfDNA水平和基因谱的变化为治疗反应提供了实时洞察。监测新突变或新改变的出现，可对正在进行的治疗可能产生的耐药性提供早期预警。EGFR突变一直是ctDNA液体活检的重点关注对象，因为这些突变决定了EGFR靶向治疗在NSCLC患者中的疗效。例如，对EGFR酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼和吉非替尼的敏感性取决于是否存在激活突变，如EGFRL858R突变或外显子19缺失，而EGFRT790M突变则与对这些药物的耐药性相关。Ortiz-Cuaran等人对接受BRAF靶向治疗的BRAF突变NSCLC患者进行了连续ctDNA检测。该研究发现，相对于早期可检测到ctDNA突变水平的患者，ctDNA突变清除的患者具有更长的PFS和OS。这些结果表明，早期ctDNA检测可能提示治疗反应，而持续监测BRAFctDNA水平可能是一个临床有用的肿瘤反应标志物，类似于在EGFR突变NSCLC患者中的观察结果。

         在另一项针对PAL0MA-3研究（n=195）患者血浆ctDNA的分析中，0’Leary等人表明，治疗期间经常发生克隆演变（进化），反映了既往内分泌治疗后进展的乳腺癌中存在显著的亚克隆复杂性，且在接受帕博西尼联合氟维司群或安慰剂联合氟维司群治疗后，PIK3CA和ESR1基因（特别是ESR1 Y537S）出现了新的驱动突变。在去势抵抗性前列腺癌（CRPC）患者的CTCs中检测到了AR基因突变。其中许多突变也在肿瘤标本中检测到，并与雄激素剥夺治疗耐药相关。类似的信息也可通过前列腺癌患者的ctDNA谱分析获得。KRAS突变对抗EGFR抗体疗法在结直肠癌（CRC）患者中的疗效有不利影响。在EGFR抑制期间的连续ctDNA分析显示，由于靶向治疗施加的选择压力，KRAS和NRAS突变可能迅速出现。有趣的是，有研究提出，KRAS突变亚克隆的“涌现群体”在停用抗EGFR治疗后数量会下降，这提示了一种基于ctDNA分析遗传数据的“周期性治疗”策略，其特点是顺序性地停药和重新引入EGFR抑制剂。

         4. 微小残留病变（MRD）的早期检测：在初次治疗后，检测残留病灶对于预测疾病复发的可能性至关重要。CTCs和ctDNA提供了检测微小残留病（MRD）的手段，帮助临床医生识别复发风险更高的患者，这些信息可指导关于治疗持续时间、是否需要额外治疗或治疗后监测强度等的决策，从而改善治疗结果并提高总生存率。

         (1）基于CTCs的MRD检测：基于基因表达、DNA甲基化和DNA突变分析的CTCs表征，结合CTCs计数和表型分析，可在临床可检测的转移性疾病出现前数年识别MRD。值得注意的是，在非转移性三阴性乳腺癌患者新辅助化疗前后检测前列腺特异性膜抗原（PSMA）阳性的CTCs，对于识别高复发风险患者显示出临床意义。在早期NSCLC中，TRACERx研究使用CelISearch®系统检测了肺静脉血样本（手术期间采集）中的CTCs计数。这些CTCs代表了导致肿瘤复发的亚克隆，并且在调整了肿瘤分期的多变量分析中，它们仍是复发的独立预测因子。对手术期间采集的肺静脉血样本中分离出的单个CTC进行基因组分析显示，其突变谱与10个月后检测到的转移灶的突变谱相似度高于原发肿瘤突变谱的相似度。此外，淋巴结和远处肿瘤复发的风险也增加了。治疗前较高的CTCs计数以及治疗后CTCs持续存在与靶向治疗部位外复发风险增加显著相关。在非转移性CRC患者中，Van Dalum等使用CelISearch®平台前瞻性监测了初次诊断后中位5.1年的CTCs变化。他们发现，手术后和辅助治疗开始前存在CTCs并不影响临床结局。术后2-3年CTCs检测提示预后不良。因此，CTCs检测可能提示CRC复发和MRD的长期持续存在。Wang等人表明，早期CRC患者术后检测到CTCs的复发风险显著更高，因此无复发生存率降低。在早期CRC中，术前CTCs计数≥4的患者复发风险显著高于CTCs计数<4的患者。此外，他们指出，如果术后CTCs计数在2-6个月期间连续3个或更多时间点保持≥4，则无论患者的临床风险状态和术前CTCs水平如何，复发率均达到100%。

         (2)基于ctDNA的MRD检测：2015年，Garcia-Murillas等人就ctDNA检测在高危早期乳腺癌患者MRD监测中的应用提出了初步见解。该研究对55例患者术后血液样本进行了分析，检测其中是否存在与原发肿瘤相关的体细胞突变，并发现ctDNA的检测结果与转移性复发风险增加相关。在一项针对早期三阴性乳腺癌(TNBC）患者的Ⅱ期多中心随机临床试验的二次分析中，研究将接受新辅助化疗后仍存在残留病灶的患者随机分为两组：一组接受新辅助化疗后基于基因组定向治疗，另一组接受医生选择的治疗方案。Radovich等人研究了早期TNBC患者在新辅助化疗后ctDNA和CTCs的独立存在是否与复发和临床结局相关。在196例女性患者中，ctDNA检测与较差的远处无病生存期（DDFS）和无病生存期（DFS）显著相关。此外，ctDNA和CTCs的同时存在提供了额外信息，从而增强了敏感性和判别能力。ctDNA和CTCs均呈阳性的患者，其DDFS显著差于两者均阴性的患者。

         在II-III期CRC中，术后3周的ctDNA MRD状态是比其他已确立的临床病理风险因素更好的复发指标。此外，在根治性手术或辅助治疗后ctDNAMRD持续存在的患者与通过辅助治疗ctDNAMRD得到清除的患者之间，临床结果存在明显差异，这凸显了ctDNA MRD作为慢性疾病指标的重要性。在早期NSCLC中，Gale等观察到ctDNA的鉴定比临床检测出原发肿瘤复发的时间早212.5天（中位数）。在经历原发肿瘤临床复发的患者中，28人中有18人（64.3%）在治疗后检测到ctDNA。在治疗结束后2周至4个月的关键期内检测到ctDNA的患者占17%，这与较短的无复发生存期（RFS）相关。此外，接受辅助治疗的MRD阳性患者的RFS优于未接受辅助治疗者，而接受辅助治疗的MRD阴性患者的RFS则低于未接受辅助治疗的患者。

二、液体活检在癌症免疫治疗中的诊断与监测及预后

          免疫肿瘤学，包括检查点抑制剂代表了该领域的最新突破，是目前对抗多种癌症（如转移性黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、NSCLC、小细胞肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌等）的重要进展，这些进展归因于新型免疫疗法的不断发展和临床试验的相应拓展。液体活检因其简单、无创、特异度高、可克服时空异质性等优点，在肿瘤诊断和预后判断方面的临床应用日益重要。下文讨论了各种液体活检生物标志物（CTCs、ctDNA、cfRNA、EVs和血小板）在癌症免疫治疗的诊断、监测和预后中的应用。

         1. CTCs：CTCs作为免疫治疗生物标志物具有显著潜力，这得益于其在疾病进展过程中数量的逐步增加。在CTCs中发现PD-L1表达，引发了人们对其在免疫检查点抑制剂治疗框架内相关性的探索兴趣。此外，对接受免疫检查点抑制剂治疗的个体进行CTCs定量和定性评估表明，分析治疗前后CTCs可为预测OS和治疗反应提供预后价值。在恶性黑色素瘤中，对CTCs的定性检查显示，治疗前PD-L1阳性的CTCs可预测对抗PD-1免疫检查点抑制剂的反应性。此外，在肺癌中，NSCLC中CTCs中PD-L1的表达已被报道为0S缩短的潜在指标。另一项研究揭示了CTCs PD-L1阳性患者的不良预后，指出纳武利尤单抗治疗后PD-L1阳性CTCs的持续存在与0S缩短相关。尽管免疫检查点抑制剂在乳腺癌中的研究尚未深入，但Mazel等人的研究显示，68%的乳腺癌CTCs中存在PD-L1。此外，Schott等人发现CTCs PD-L1阳性存在于疾病早期和转移期，并报告了一例成功应用纳武利尤单抗和伊匹木单抗治疗后导致CTCs PD-L1阳性减少的病例。目前正在研究将CTCs作为免疫治疗生物标志物用于各种恶性肿瘤，包括前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、头颈部鳞状细胞癌和肝细胞癌。例如，在肝细胞癌中，CTCs PD-L1阳性的存在预示着较差的OS，但也预示着对纳武利尤单抗治疗的积极反应。

         2. ctDNA：除CTCs外，cfDNA更具体地说是ctDNA，是液体活检最重要的来源。因此，研究人员致力于将cfDNA应用于免疫肿瘤学领域。例如，在Cabel等人的研究中，首次免疫治疗注射后，观察到ctDNA水平变化与肿瘤大小变化之间存在显著相关性。此外，Leprieur等人对接受纳武利尤单抗治疗的晚期NSCLC患者的研究揭示，低ctDNA水平与纳武利尤单抗的长期获益相关。Goldberg等人观察到cfDNA水平的降低可作为治疗成功的早期指标和生存期延长的预测因子。值得注意的是，血液中cfDNA的含量也可用于监测接受免疫治疗的NSCLC患者。因此，基于ctDNA的液体活检在选择晚期NSCLC的治疗方案中日益流行，有助于识别治疗药物靶点及检测免疫治疗生物标志物，如血液肿瘤突变负荷（bTMB）和血液微卫星不稳定性（bMSl）。与此同时，在黑色素瘤中，Ashida等人研究了ctDNA与抗PD-1免疫治疗的相关性，发现在5例患者中有3例应答者在治疗2-4周后ctDNA水平下降，而在2例无应答者中则保持升高。尽管ctDNA是评估免疫治疗疗效的独特工具，但解决其在灵敏度、定量和标准化方面的局限性至关重要。目前正在进行的小样本量ctDNA免疫临床试验尚未得出明确结论。前瞻性免疫学临床试验诚邀患有不同恶性肿瘤、处于不同临床分期、携带多种基因突变的参与者参与，预计ctDNA检测不久将成为评估免疫治疗疗效的标准方法。

         3. cfRNA：在cfRNA中，微小RNA（miRNA）在免疫治疗背景下具有作为生物标志物和治疗靶点的双重潜力。例如，在肺癌中，观察到循环miRNA表达的下调与免疫治疗反应之间存在相关性。此外，Peng等人证明NSCLC患者表现出独特的血浆外泌体miRNA谱，其中hsa-miR-320d、hsa-miR-320c和hsa-miR-320b被鉴定为预测免疫治疗疗效的潜在生物标志物。另外，治疗诱导的T细胞抑制因子hsa-miR-125b-5p的下调可能增强T细胞功能，从而促进积极的免疫治疗反应。然而，鉴于当前研究的样本量有限且采用的方法学多样，现有的关于miRNA的数据尚不足以就其预测免疫治疗反应和生存期的潜在作用得出有意义的结论。

         4. EVs：除了在肿瘤进展以及肿瘤与免疫系统相互作用中发挥重要作用外，EVs因其可能预测免疫治疗反应的能力而日益受到关注。Zitvogel等人于20世纪90年代末首次证实了EVs的免疫治疗潜力。他们发现来源于树突状细胞的EVs不仅在体外激发T淋巴细胞的特异性细胞毒活性，而且在体内也表现出抑制肿瘤生长的能力。此外，不同的研究小组已探究了EVs表达的生物标志物在确定哪些患者将从免疫治疗中获益方面的重要性。例如，根据Miguel-Pérez等人的研究，EVs PD-L1阳性可用作接受免疫治疗的NSCLC患者的预后生物标志物。在一项包含33例患者的回顾性队列和另一项包含39例患者的前瞻性独立队列中，观察到无应答患者的EVs PD-L1水平高于有应答患者，并且EVs PD-L1是与PFS和0S降低相关的独立生物标志物。值得注意的是，相比之下，常用作为生物标志物的组织PD-L1表达水平，并未显示出对持久应答或生存期的预测价值。这强调了EVs PD-L1在分层筛选可能从免疫检查点抑制剂中获得持久获益的晚期NSCLC患者方面的潜力。此外，EVs可能作为癌细胞逃避免疫监视的通道，从而导致免疫治疗失败。目前认为，肿瘤EVs通过暴露触发免疫检查点应答的抑制性配体来促进淋巴细胞活化。为了将EVs整合到临床实践中，许多正在进行的临床试验正在评估其与其他抗癌治疗联合时对免疫治疗的影响。例如，NCT03985696临床试验旨在通过分析从弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞分离的外泌体中CD20和PD-L1的水平，研究外泌体对免疫治疗反应的相关性。在前瞻性纵向队列研究ALCINA2（NCT-04025541）中，纳入了60例接受免疫治疗的肺癌患者（基线+3次随访）。实际上，启动ALICINA2临床试验是为了凸显我们前期的概念验证研究，该研究聚焦于不同液体活检生物标志物（CTCs、PD-L1+CTCs、sEVs、PD-L1+sEVs和ctDNA）单独或组合使用的预后价值，研究对象为无论接受何种癌症治疗、何种亚型和分期的NSCLC患者队列，目的是确定它们的组合是否能提供更精确的预后信息。

         此外，利用EVs作为癌症免疫治疗中的生物载体最近已成为一个新兴的研究领域。通过生物技术方法修饰的EVs可以包裹特定的内容物，如治疗分子或诊断标志物，并被设计用于靶向特定的细胞或组织。例如，装载在EVs中的免疫检查点抑制剂，包括靶向PD-1、PD-L1和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）的抗体，可以刺激免疫反应，从而实现癌细胞的靶向清除。

         5. 血小板：除了血小板计数和癌症相关血栓形成的重要性外，揭示肿瘤教育血小板（TEPs）的特征及其相关因子可推动免疫治疗的发展。例如，有研究报道，接受化疗的NSCLC患者的静脉血栓栓塞发生率高于接受免疫检查点抑制剂治疗的患者。此外，在接受免疫检查点抑制剂治疗的转移性患者中，发生血小板减少症和低血小板计数与0S改善相关，而未发生血小板减少症的患者则不然。癌细胞诱导血小板颗粒和EVs的释放，以促进其在血流中的存活。反过来，通过抑制T淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞，以及促使巨噬细胞极化为M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），血小板特征被重编程，从而削弱抗肿瘤免疫力。转化生长因子一β(TGF-β是血小板来源的、在肿瘤微环境中促进免疫抑制的关键细胞因子，它能降低自然杀伤细胞2族成员D（NKG2D）受体的表达并抑制其抗肿瘤反应性。最近的一项研究表明，利用经过工程改造的血小板来递送免疫疗法药物，能够有效清除手术中未被清除的癌细胞，并抑制其形成新肿瘤的能力。在涉及手术切除黑色素瘤和乳腺癌肿瘤的体内模型实验中，与接受正常血小板或仅接受检查点抑制剂治疗的小鼠相比，接受工程改造血小板治疗的小鼠显示出肿瘤再生和转移的减少，生存时间更长。他们的发现显示了血小板作为靶向药物载体的潜力，因为这些微小的细胞碎片会在手术创面处聚集，因此，它们有可能与血流中循环的转移性癌细胞相互作用。此外，当血小板在伤口部位被激活时，它们会释放化学物质，增强局部免疫反应，从而促进伤口愈合。另一项近期研究强调了血小板及其衍生物对血栓形成的应答能力，可增强局部免疫检查点抑制剂和化疗药物的积累。

         此外，Rachidi等人报道，靶向血小板增强了过继性T细胞疗法在多种小鼠癌症模型中的有效性，研究结果表明，血小板来源的TGFβ显著削弱了T细胞（CD4+和CD8+T细胞）的功能，这主要是通过表达TGFβ对接受体-糖蛋白A重复序列优势蛋白（GARP）实现的。这些结果表明，将血小板抑制剂与免疫治疗联用，可作为癌症治疗的一种补充策略。研究表明，血小板PD-L1反映了肿瘤内PD-L1表达的总体情况，并能预测NSCLC患者对免疫治疗的反应。事实上，血小板与肺癌细胞相互作用，PD-L1蛋白以纤连蛋白1、整合素α5β1和GPIbα依赖的方式从肿瘤细胞转移至血小板。研究发现NSCLC患者的血小板表达PD-L1，且血小板PD-L1具有抑制CD4+和CD8+T细胞的能力，这证实了它们在肿瘤免疫逃逸中的重要作用，并克服了肿瘤内异质性PD-L1表达在组织学定量上的局限性。

三、讨论

         实时液体活检在推进癌症管理中发挥着关键作用。CTCs、ctDNA、cfRNA、EVs和TEPs提供了互补性见解，表明它们有望在不久的将来被整合到临床实践中，然而，将其应用于临床常规仍面临若干挑战。使用这些生物标志物的一个主要限制是其灵敏度低。这是由于血液和其他体液中的CTCs、ctDNA和EVs含量低。血小板虽然含量丰富，但由于其大小和密度与EVs相似，可能会干扰EVs的分离。此外，液体活检缺乏质量控制方法和标准化技术。所有液体活检生物标志物在样本采集、处理、加工和储存过程中都可能发生降解，导致内容物的丢失或改变。这些组分的稳定性对于准确分析至关重要。其他分析物，如白细胞、游离DNA、脂蛋白和蛋白质聚集体，也可能污染液体活检生物标志物的分析。确保分离程序的特异性对于减少污染、提高液体活检检测的可靠性至关重要。因此，就最优既定方法达成共识并实施质量控制，对于确保结果的可重复性和可靠性至关重要。

         此外，CTCs、EVs和血小板在其内容物（包括蛋白质、核酸和脂质）方面表现出异质性。这种异质性使得结果解读复杂化，并迫切需要开发能够捕捉这种多样性的技术。开发经济高效的方法和流程对于液体活检的广泛采用也至关重要。为克服这些障碍，需要在分离策略、分析方法和质量控制规范方面进行多学科合作（multidisciplinary cooperation）与持续创新。如果这些挑战得以解决，液体活检生物标志物作为癌症诊断、预后和治疗监测有用资源的潜力将得到提升。此外，整合多种生物标志物的数据可能会催生一个索引数或算法，从而提高肿瘤分子谱分析的准确性。需要重点强调的是，液体活检不应被视为通过组织活检进行组织病理学诊断的替代品，相反，它们应被视为诊断和特征描述的补充工具，为肿瘤管理提供创新方法。例如，CTCs可能有助于识别新的治疗靶点，以阻止转移起始细胞，而EVs可作为特定组织或肿瘤靶向治疗的递送载体。这些生物来源的存在和生物学功能不仅限于癌症，也为多种应用开辟了途径，这些应用未必直接与疾病或人类福祉相关。“液体活检”的概念预计将成为肿瘤学家和医生不可或缺的工具，这标志着未来癌症管理将发生变革性转变。

编译节选自: Cell Adh Migr. 2024 Sep 1;18(1):1–26.