血浆microRNA特征谱作为醋酸阿比特龙 治疗转移性去势抵抗性前列腺癌伴随诊断 的临床价值
【摘要】醋酸阿比特龙(AA)是用于控制转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)患者持续性睾酮生成的药物。然而，其疗效存在个体差异，因此，需要识别能够预测和监测治疗应答情况的生物标志物。在这项试点研究中，我们探索了循环microRNAs(c-miRNAs)根据患者对AA的应答进行分层的潜力。对33例mCRPC患者在AA治疗前及治疗后3、6和9个月时采集的血浆样本进行了分析。通过使用miRNART-qPCRpanels(组合)进行候选物筛选，并采用TaqMan RT-qPCR进行验证，我们识别出有前景的miRNA特征谱。研究表明，基于miR-103a-3p和miR-378a-5p的特征谱能有效区分无应答者和应答患者，同时也能随时间推移追踪药物的疗效。此外，通过计算机模拟分析，我们识别了这两种miRNA的靶基因和转录因子，包括PTEN和HOXB13,这些基因已知在mCRPC的AA耐药中发挥作用。综上所述，本研究强调了两种c-miRNA作为mCRPC患者AA伴随诊断的潜在标志物，为mCRPC治疗的决策提供新的见解。
【关键词】循环microRNA；血浆；前列腺癌；醋酸阿比特龙；伴随诊断
前列腺癌（PCa）是男性中最常见的癌症之一，其风险因素包括年龄、肥胖、种族和家族史。诸如BRCA1，BRCA2，TP53，雄激素受体和维生素D受体，HPC1, HPC2, HPCX, CAPB, MLH1, MSH2和MSH6, CHEK2,PMS2，H0XB13，ATM以及TMPRSS2–ERG和TMPRSS2–ETV1/4融合基因等基因的遗传突变与PCa相关。PCa涵盖一系列恶性肿瘤，包括最常见的腺癌（起源于前列腺腺体和导管）、鳞状细胞癌和小细胞PCa，其中少数为神经内分泌肿瘤。PCa的典型进展始于前列腺上皮内瘤变，此时PCa仍局限于腺体内且前列腺基底层未受损。然而，高级别病变常侵犯间质，导致转移性肿瘤形成，其中PTEN缺失和MYC扩增被认为是高级别PCa和转移的关键驱动因素。目前，PCa的诊断和预后依赖于影像学方法以及前列腺特异性抗原(PSA)的生化升高和复发。虽然早期PCa通常对雄激素剥夺疗治疗敏感，但晚期可能对此治疗产生抵抗，这种现象称为去势抵抗性前列腺癌（CRPC）。转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC）的治疗格局已发生显著变化，美国和欧洲已批准多种药物用于临床治疗，这些药物在初治和既往接受过治疗的mCRPC患者中均显示出生存率的改善。在这些策略中，醋酸阿比特龙（AA）[一种细胞色素P450c17（CYP17A）抑制剂]已在mCRPC患者（包括接受过化疗的患者）中显示出疗效。AA通过抑制睾丸、肾上腺和前列腺癌组织中的睾酮生成而发挥作用。然而，其疗效在患者间存在差异，并且对其不良反应（如高血压、低钾血症、外周性水肿和肝酶升高）的担忧凸显了避免不必要治疗的重要性。因此，对改善临床决策的伴随诊断的需求日益凸显。
在过去二十年中，microRNA（miRNA）已逐渐成为多种病理状态的潜在生物标志物，涵盖从神经退行性疾病到癌症等领域，并可用于疾病预后评估及药物治疗效果预测。miRNA作为一类小分子非编码RNA，通过促进mRNA降解或抑制翻译过程在转录后水平调控基因表达。大量研究表明，miRNA对生理或病理变化敏感，使其对研究的疾病具有特异性，不仅有可能在临床症状出现之前提示疾病的存在，还能预测治疗结果和预后。它们具备理想生物标志物的许多属性，满足分析标准和临床实用性。作为核酸，miRNA相对易于定量，RT-qPCR常被视为金标准方法。在此背景下，循环miRNA(c-miRNA)因其(1)可从体液中通过微创操作获取，(2)稳定性高以及(3)对核糖核酸酶和恶劣的理化条件具有抵抗力，而成为一种有价值的来源，这些特性使得c-miRNA适用于临床应用。本研究描述了一项针对接受AA治疗的mCRPC患者队列的前瞻性试点研究，发现了能够预测和跟踪对AA治疗应答的c-miRNA特征谱的迹象。
一、材料与方法
1. 患者队列：招募了一组33例转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）患者队列，这些患者在2013年至2015年间于意大利Santa Chiara医院根据标准临床实践接受了醋酸阿比特龙（AA）治疗。所有参与研究的受试者均签署了书面知情同意书，该研究方案遵循《赫尔辛基宣言》的原则，并获得了特伦蒂诺地方卫生局伦理委员会的批准。治疗方案包括每日口服1000mg AA联合5 mg泼尼松，治疗期间，患者每月接受临床评估，包括常规评估骨髓、肾功能和肝功能以及测量PSA表达水平。每3个月或在临床提示时进行肿瘤影像学评估。治疗持续至疾病进展为止，判断遵循PCWG2指南，即出现临床（体能状态恶化）或影像学进展的证据。仅PSA升高并不中断AA给药，符合以下标准的患者被归类为AA应答者：（1）影像学改变而无PSA进展和体能状态恶化或（2）与治疗前值相比，PSA降低≥50%而无影像学进展和体能状态恶化。12例患者对AA有应答，其余21例患者对AA无应答。
2. 血浆样本处理：在签署知情同意书后，根据Santa Chiara医院的标准指南，在开始使用AA治疗前及治疗期间每3个月从患者处采集5mL血液样本，直至治疗结束。血液采集于EDTA抗凝管后，立即在4℃下以2500rpm离心15min。小心收集血浆，避免扰动白细胞层，并分装成250-500μL等份，储存于特伦蒂诺生物库（Santa Chiara医院）的-80℃冰箱中。
3. RNA提取与定量：然后取250μL的血浆样本，使用miRNeasy®血清/血浆试剂盒提取总RNA。对用于Exiqon miRNome RT-qPCR panels的18份样本，使用Qubit荧光计和Qubit RNA HS Assay Kit进行了精确的RNA定量。
4. Exiqon miRNome RT-qPCR Panels：将提取的RNA80ng与4μL的5X反应液、2μL的酶和不含核酸酶的水（总计20μL）混合，用通用型cDNA合成试剂盒(Exiqon-Qiagen）进行逆转录。
5. TaqMan RT-qPCR：采用TaqMan RT-qPCR进行单个miRNA的验证。
6. 数据分析：使用GenEX软件处理和分析ExiqonmicroRNA Ready-to-Use PCR panels的数据。剔除至少20%样本中未检测到的miRNA，Ct值≥40被视为未检测到。使用NormFinder软件选择miR-425-5p作为Exiqonpanels数据的内参基因。通过评估NR组相对于R组生成火山图的倍数变化。对于验证分析，TaqManRT-qPCR Ct值≥40被视为未检测到。TaqMan RT-qPCR数据以miR-425-5p进行标准化。
7. 计算机模拟分析：合并TargetScan、Pita和MiRanda软件的预测结果，筛选结合能≤-18kcal/mol，获取miR-103a-3p和miR-378a-5p的预测靶基因。从miRTarbase数据库（V9.0）检索已验证靶基因，使用metascape对已验证靶基因进行基因本体分析。为进行转录因子分析，研究了miR-378a-5p、miR-103a1-3p、miR-103a2-3p和PANK2基因的启动子区域[ENSG00000199047（miR-378a），ENSG00000199035(miR-103a1 ), ENSG00000199024(miR-103a2），和 ENSG00000125779（PANK2）]。搜索范围从-4900/-3900/-2900/-1900/-900至+100（转录起始位点定义为+1，由GeneXplain软件TRANSFAC 2.0根据miRbase V21自动获取）。
二、结果
1. 患者队列：患者队列中，应答者(R)和无应答者(NR)的中位年龄无统计学差异(总体=75.0±7.5岁；NR=75.0±8.55岁；R=74.5±5.0岁)。在开始AA给药前，21例NR患者中有21例(即100%)、12例R患者中有11例曾接受多西他赛治疗;22例NR患者中有11例、11例R患者中有2例曾接受恩扎卢胺治疗;21例NR患者中有8例、12例R患者中有6例曾接受卡巴他赛治疗。NR患者的中位无进展生存期(PFS)为3.9±1.0个月，而R患者为14±4.9个月。
2. 通过miRNome分析筛选候选miRNA：在筛选阶段，使用人类Exiqon qPCR panels(可评估752种miRNA)进行miRNome分析，在AA给药前(preTRT)采集了9例R患者和9例NR患者的血浆样本并进行分析(见图1)。319种miRNA因在超过20%的样本中检测不到水平而被排除分析;198种miRNA在所有样本中均存在;2种miRNA在整个NR组中均未检测到。根据Blondal等人描述的标准评估了溶血情况，表达数据以miR-425-5p为内参基因进行标准化，该内参基因由Normfinder软件确定。基于miRnomepanels的表达分析和文献回顾，选择了7种miRNA)miR-144–3p, miR–182–5p, miR–29b–3p, miR–331–5p, miR—33a-5p，miR-363-3p，miR-378a-5p)作为验证阶段的候选物，在此基础上，我们添加了通过文献回顾筛选出的miR-103a-3p。需要重点强调的是，在我们最初的miRNome分析中，miR-103a-3p并未在NR和R患者间显示出差异表达(见图1)。然而，在文献回顾中发现，miR-103a-3p在雄激素剥夺治疗和化疗期间的前列腺癌进展中作用显著，因此将其纳入更大样本量的验证中。
3.八种候选miRNA的验证分析揭示两种可预测AA在mCRPC中疗效的miRNA：在筛选阶段利用TaqManRT-qPCR在相同preTRT样本上对8种候选miRNA进行了验证(见图2)。miR-33a-5p因在4例R患者中表达水平无法检测到，且在其他患者中Ct值>37而被排除了进一步分析，这使得miR-33a-5p不适合作为稳健的生物标志物，且难以对其表达进行正确的统计分析。在RT-qPCR验证过程中，miR-103a-3p也在两组患者中显示出水平的显著差异。在候选物中，miR-144-3p、miR-182-5p、miR-331-5p、miR-363-3p和miR-378a-5p的表达模式与miRNome分析结果一致，然而，只有miR-103a-3p和miR-144-3p在两组患者间显示出显著差异。为了提高鉴别能力，我们评估了两种miRNA的联合特征谱，以确定能有效增强区分NR组和R组的单一组合。—个包含miR-103a-3p与miR-378a-5p比值的miRNA评分(miRS)在区分NR患者和R患者方面最为有效，如图3A所示(p值=0.0001)。值得注意的是，miRS作为两种miRNA表达水平的比值，不需要使用如miR-425-5p之类的内参基因进行校准。为了验证这些发现，将数据集扩展至包含另外15例患者(12例NR和3例R)，总计达到21例NR和12例R患者。如图3B,C所示，miRS证实了其区分两组患者的能力(AUC=0.81;p值：0.008)。由于该队列先前接受过涉及恩扎卢胺和卡巴他赛的其他治疗(未包括多西他赛，因为除一例患者外，所有患者均接受过此治疗），因此进行了额外的分析以排除这些药物对miRS的潜在干扰。这些结果表明，miRS有潜力作为预测mCRPC患者AA疗效的生物标志物。
4.随访样本分析提示miRS可作为AA的伴随诊断：使用miRS评估AA随时间推移的疗效，治疗后血浆样本来自同一组NR和R患者，不同时间点的样本可用性存在差异（3个月时11例R和14例NR；6个月时10例R和4例NR；9个月时7例R和0例NR）。部分样本不可用是由于患者死亡或治疗终止。如图4所示，miRS似乎能反映AA随时间推移的疗效，值得注意的是，R患者的miRS逐渐变得类似于NR患者，这可能作为现实中向AA耐药性转变的一个指标。
为减少治疗后临床分类可能带来的混杂因素影响，本研究采用基于miRS数据的无监督聚类模型对患者进行分组。该方法成功地将患者分为两个不同的组别，如图5A所示（A组和B组；p值<0.0001)，图5B描绘了Kaplan-Meier生存曲线，显示出A组（中位PFS=9个月)和B组(中位PFS=3.8个月)之间存在显著差异(p值=0.0003)。据此，将A组解读为R患者，B组解读为NR患者。值得注意的是，与临床分类相比，无监督模型将5例临床分类为NR的患者重新归类为A组(R)，将2例临床分类为R的患者重新归类为B组(NR)，该模型对治疗后样本的聚类结果与先前分析中观察到的趋势一致(图5C)。此外，为验证miRS监测AA疗效随时间变化的能力，评估了R组患者治疗前(preTRT)与治疗后3个月的miRS差异(称为“∆评分”；15个样本中有2个缺乏3个月分析数据)。图5D表明∆评分与PFS之间存在负相关，可以推测，miRS可能识别出在归类为R患者中，治疗3个月后AA应答的变化。值得注意的是，被重新归类到应答者组的5例患者(其临床分类为NR)的PFS值分别为5.5、5.5、4.7、4.6和3.8个月，均高于或等于无应答组的中位PFS(B组，3.8个月)。虽然miRS将他们归类为应答者，但可能被细分为“弱应答者”。有趣的是，这些患者中有三例(在图5D中突出显示)也显示出较高的Δ评分，且与PFS呈负相关。这提示了一种假设的临床情景:治疗3个月后的miRS可能已提示有必要为这些个体停用AA治疗。
5. miR-103a-3p和miR-378a-5p靶基因及启动子的计算机模拟分析：为了解所选miRNA的可能作用，对预测和已验证的靶基因进行了分析。值得注意的是，与前列腺癌进展、复发和治疗耐药相关的几个基因成为最相关的靶点。包括WNT2B和WNT7A（miR-103a-3p的预测靶点），DICER1、PTEN（miR-103a-3p的已验证靶点）和SP1（miR-378a-5p的已验证靶点）。对两种miRNA验证靶点的基因本体分析显示，其在细胞周期通路和p53信号通路中富集。此外，使用GeneXplain软件对miR-378a-5p和miR-103a-3p启动子区域富集的人类转录因子可能的共有结合序列进行了分析。分析了四种不同的Ensembl注释：miR-378a-5p、miR-103a1一3p、miR-103a2-3p和PANK2。miR-103a在人类基因组中以miR-103a1和miR-103a2形式存在，表达两种相同的成熟miRNA。无论是TaqMan RT-qPCR探针还是靶点预测算法都无法区分这两种相同的序列。然而，由于位于两个不同的基因组位置，转录因子分析可能会得出不同结果。另外，miR-103a2-3p位于PANK2基因的一个内含子之内，因此，PANK2的启动子也被纳入此分析。miR-103a-3p和miR-378a-5p共有结合序列富集的转录因子有ATF2、BRCA1、GMEB2、IRX2、LEF1、MAFA、SOX10、USF2、ZBTB33和H0XB13。值得注意的是，H0XB13，尤其是在miR-103a-3p启动子区域富集，先前被认为与AA治疗后的早期死亡率相关。
三、讨论
过去十年间，mCRPC治疗格局的不断演变对临床医生构成了挑战，他们必须在多种治疗方案中进行抉择。然而，鉴于所有患者最终都会对现有药物产生原发性或获得性耐药，迫切需要有效的生物标志物来识别最有可能从特定治疗中获益的个体，这一点至关重要。虽然有少数研究探索了雄激素受体变异型AR-V7、TMPRSS2-ERG融合基因和PTEN等AA疗效的生物标志物，但可靠的证据仍然有限。目前，只有FoundationOne®CDx诊断检测获得FDA批准用于指导AA治疗，特别是针对BRCA1/2突变的mCRPC患者。因此，迫切需要发现新的AA伴随诊断方法以满足临床需求。
microRNA(miRNA)因其在诊断、预后和预测药物疗效方面的潜力，已成为有前景的生物标志物候选者。miRNA参与转录后调控，在多种生物过程中发挥作用，并对生理和病理变化表现出敏感性。尽管存在技术挑战，但通过RNA测序或RT-qPCR检测miRNA相对简单，特别是在血浆、血清或尿液等生物体液中发现的循环miRNA(c-miRNA)具有显著潜力。虽然液体活检操作可能受到溶血或采样变异等混杂因素的影响，但其侵入性低于实体组织活检，这增强了循环生物标志物的临床实用性，此外，c-miRNA在生物体液中稳定，对核酸酶和环境压力具有抵抗力。虽然在mCRPC患者中，c-miRNA的表达作为预测生物标志物进行了研究，但目前针对AA疗效预测的研究有限，而且到目前为止，还没有一个研究成功地预测和监测随着时间推移的AA疗效。
在本项初步研究中，收集了33例接受AA治疗的mCRPC患者在治疗开始前以及给药后3、6和9个月的血浆样本。使用RT-qPCR分析对c-miRNA进行了全面分析，通过利用miRNome Exigon panel进行候选物分析和文献回顾，筛选出八种miRNA进行进一步研究。在验证阶段，整合了两种miRNA（miR-103a-3p和miR-378a-5p）的评分系统（miRS）脱颖而出，能够预测对AA治疗的应答并在治疗期间检测疾病进展。采用无监督聚类模型来减少临床医生分类中的混杂因素影响，根据miRS数据对应答和无应答患者进行有效分组。该模型回顾性地将5例临床评估为无应答者的患者重新归类到应答者组，值得注意的是，这些患者的PFS高于无应答者组的平均水平。这些发现表明，与依赖PSA进展和疾病进展的临床或影像学指标等参数的临床医生分类相比，miRS可能对AA疗效具有更高的敏感性。此外，在应答者组内，治疗前样本与3个月时miRS水平之间的差异（Δ评分）提示其与PFS呈负相关，表明miRS可能随时间推移追踪AA疗效，这对临床医生具有重要指导意义，有助于决定是继续还是暂停治疗。此外，在重新分类后的应答者组中，有3例患者表现出高Δ评分和低PFS，这表明miRS不仅将他们归类为应答者（其PFS高于分类的NR患者），同时也提示了在3个月后需要停止治疗。
对靶基因和启动子的生物信息学分析提供了证据，支持这两种miRNA参与了对AA治疗的原发性或获得性耐药。值得注意的是，PTEN是miR-103a-3p的已验证靶点，研究已证明PTEN缺失会对AA治疗后的预后产生负面影响。miR-103a-3p水平的改变很可能影响PTEN表达，从而增加癌症的侵袭性。同样，SP1是miR-378a-5p的已验证靶点，已被证明可正向调控AA的靶点CYP17A1的表达。可以推测，miR-378a-5p水平的改变可能破坏SP1/CYP17A1轴，从而影响AA疗效。启动子分析突出了发育基因如H0X和SOX家族基因（HOXB13和SOX10）]以及众所周知的癌症相关基因（如BRCA1）的富集转录因子结合位点，有趣的是，H0XB13在循环肿瘤细胞中高表达，并预测AA治疗后的早期死亡。同样，BRCA基因与前列腺癌的高风险和不良预后相关。尽管这项初步研究涉及的患者队列规模较小，但miRS数据表明其可能成为一种新的、目前临床环境中尚未应用的AA伴随诊断。需要进一步扩大样本量进行研究，并探讨miR-103a-3p和miR-378a-5p在mCRPC患者对AA治疗应答中的潜在分子作用机制。
编译节选自：Int J Mol Sci. 2024 May 21;25(11):5573.
