两例儿童25-羟基维生素D假性升高的案例
【摘要】背景:维生素D中毒在儿童人群中较为罕见，已有文献报道，采用免疫分析法检测维生素D代谢物时，25-羟基维生素D的假性升高是该方法面临的主要挑战。方法:本文报告两例25-羟基维生素D假性升高的儿童案例，该错误结果导致患儿接受了不必要的进一步检测。研究还发现，使用全自动化学发光免疫分析仪检测25-羟基维生素D时,当日检测结果存在显著波动(差异)。所有样本均经两次离心处理,并通过金标准方法液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)进行结果验证。结果:在样本检测前增加离心步骤可消除25-羟基维生素D检测值的波动现象，患者样本已通过不同厂商设备及LC-MS/MS法进行复测验证，对样本实施二次离心处理后，25-羟基维生素D检测值的波动问题得到有效解决。结论:临床医生与临床实验室专家要注重协作的重要性，以避免因实验室检测值差异导致不必要的检查及患者伤害。
【关键词】25-羟基维生素D;免疫分析法;液相色谱-串联质谱法;维生素D检测
维生素D缺乏症仍是全球性的健康挑战，它在钙与骨代谢中发挥重要且关键的作用，同时研究报道其还参与众多其他生理功能，维生素D缺乏症与癌症及自身免疫性疾病风险增加相关。据了解，如妊娠、肥胖、高龄、吸收不良（如慢性炎症性肠病）及皮肤色素沉着等其他危险因素会加剧其缺乏。基于上述原因，对维生素D代谢物的检测需求显著增加。由于25-羟基维生素D₂[25（0H)D₂]和25-羟基维生素D₃[25(0H)D₃]在血浆中的半衰期较长，它们成为最常检测的代谢物。本文报告两例儿科无症状患者维生素D检测值假性升高的案例。
一、 案例报告
1. 案例1：患儿10岁男，诊断为伴中央颞区棘波的儿童良性癫痫(BECTS)、注意力缺陷多动障碍(ADHD)和轻度间歇性哮喘(无并发症)，于2022年2月来院进行常规随访。其日常用药包括哌甲酯、氯巴占、地西泮、西替利嗪、布地奈德、氟替卡松和褪黑素软糖。医生要求外部实验室进行免疫分析法检测总25-羟基维生素D[25(0H)D]及全套代谢项目。患者25(0H)D浓度报告为>150ng/mL(375nmol/L）(X公司)，其余结果无异常。医生要求患者停止服用维生素D补充剂并减少乳制品摄入。除了钙、磷酸盐和甲状旁腺激素外，实验室还对单独样本进行2次总25(0H)D的免疫测定。结果显示25(0H)D浓度仍>150ng/mL(375nmol/L）(X公司），其他分析指标未见异常。患者转诊至专科治疗，接受进一步内分泌及肾脏系统全面检查，结果均未见异常。最终，其内分泌科医生同时采集两份血清样本，分别送至两家实验室：我们实验室及原外部检测实验室。我们报告25(0H)D为46.9ng/mL（117.3nmol/L），而外部实验室结果仍为>150ng/mL（375nmol/L），内分泌科医生向我们化学实验室咨询关于结果差异的建议。我们实验室检测的样本于数日后经液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）验证，结果为37ng/mL(136.9nmol/L)
2. 案例2:在对25(0H)D检测值不一致的调查期间，发现了另一例疑似假性维生素D过多症的病例。一名患有高γ-谷氨酰转移酶(GGT)婴儿胆汁淤积症的8周龄男童在入院后到胃肠病科就诊。血清25(0H)D为>150ng/mL(375nmol/L）(X公司)。由于可能出现维生素D中毒，内分泌医生指示他的护理人员停止补充维生素D，直至另行通知。临床化学小组联系了医生，告知他们结果可能不准确。建议医生提交样本，通过免疫测定和LC-MS/MS检测25(0H)D。从这些样本中，我们实验室报告的免疫检测值为52ng/mL(130nmol/L)，LC-MS/MS值为59ng/L(147.5nmol/L)。
二、讨论与结论
尽管同位素稀释液相色谱-串联质谱法(IDLC-MS/MS)是分析参考方法，但免疫分析法因其可在自动化分析仪上运行且易于整合至常规实验室工作流程，而被临床实验室广泛使用。大多数免疫分析法可检测样本中总25(0H)D含量，但对维生素D及其代谢物、差向异构体的检测特异性存在差异，可能导致结果的高估或低估。此外，免疫分析法无法区分维生素D的不同形式，且易受交叉反应及干扰影响。
首例患者是在我们实验室进行维生素D稳定性验证过程中引起临床化学小组关注的。在稳定性验证中，评估了血清样本中25(0H)D的稳定性，发现部分样本在存储前后的检测值存在差异，表现为存储后25(0H)D浓度下降。若偏差超过CAP总允许误差±5ng/mL(12.5nmol/L)，则判定为显著差异。我们进一步回顾了2个月期间(2022年6月-8月)179例剩余患者样本中25(0H)D的稳定性。评估对象包括在2-6℃条件下存储<5天的样本(85例)及当日实验室处理的新鲜样本(94例)，其中95%的样本为血浆，5%为血清。使用经NISTSRM 2972标准化的A公司维生素D检测试剂进行25(0H)D测定，该方法的分析测量范围(AMR)为3.4-155.9ng/mL。观察到的差异与其他变量（如样本采集和处理间隔时间、采血管类型、采集科室、患者的临床病史和维生素D补充剂)之间没有相关性。在6天的评估周期内，有差异结果百分比范围为11%-43%。随后，我们在分析前以1000 RCF(3300 RPM)额外离心3min。这—干预措施似乎消除了可能的干扰因素，因为25(OH)D浓度在离心后24h内保持稳定且未发生显著变化(图1)。
随机抽取3例样本送外部实验室用LC-MS/MS进行25(0H)D定量确认。A公司分析仪检测的初始25(0H)D浓度为44.2-66.7ng/mL（110.5-116.8nmol/L），但进一步离心后的复测值较低20.3-30.5ng/mL（50.8-76.3nmol/L）。使用LC-MS/MS对样本进行重新分析，以确认25（0H）D水平。我们在A公司另一个分析系统（分析仪2）上确认了这些值，以排除对我们的分析/仪器可能存在的干扰。
儿童维生素D中毒极为罕见，且关于该人群维生素D水平假性升高的文献报道极少。Hernandez等人的既往研究发现，使用A公司改良版维生素D检测试剂分析肝素锂抗凝血浆样本时，25(OH)D检测值存在假性升高现象，作者认为这种假性升高源于运输过程中血浆样本中的微粒重悬。然而，本研究中我们观察到少数血清样本的维生素D检测值存在差异。值得注意的是，目前关于X公司分析仪化学发光法维生素D检测潜在干扰的数据有限，因此我们无法将该方法与市售其他检测方法进行比较。由于两种方法检测结果差异显著，样本完整性干扰因素在这两例患者中已被排除。目前尚不清楚为何样本离心可消除25(0H)D浓度波动的问题，但残留纤维蛋白可能引发某种形式的干扰。然而，这无法完全解释为何仅部分样本(<50%)出现此类波动，既往研究将维生素D在血清及血浆样本中的稳定性描述为“坚如磐石”，认为其在多种储存条件下可保持数年无显著降解。我们最初的离心参数是以1000 RCF(3300 RPM)离心样本3min，就像我们在A公司分析仪上其他检测项目的处理一致，离心后直接上机检测。针对检测值差异问题，我们优化流程为：初次离心后批量保存样本，并于第二班次检测前再次离心。由于此改进有效解决了问题，我们推测观察到的波动可能与新配方试剂的版本变更及微粒干扰有关。
补充维生素D对婴儿尤为重要。美国儿科学会强烈建议婴儿每日摄入400IU维生素D，以预防营养性佝偻病。胆汁淤积症患儿因脂溶性维生素吸收障碍易出现维生素D缺乏，因此25(0H)D浓度的准确性对该儿科患者群体至关重要。同样，ADHD患者较健康人群更易出现维生素D缺乏，此类患者常首选哌甲酯治疗，研究表明，补充维生素D作为哌甲酯的辅助治疗可改善ADHD症状。本研究的局限性在于，因样本量不足，无法通过重悬样本和复测来进一步验证稳定性以排除纤维蛋白原的干扰，尽管在少数血清样本中也观察到检测值波动。
这一偶然发现强调了临床医生与临床实验室专家持续协作的重要性，以避免因实验室检测值差异导致不必要的检查及患者伤害。虽然目前尚无法明确解释这一现象，但我们的观察提示：采用免疫分析法检测25(0H)D时，样本在分析前可能需要第二次离心步骤，建议其他临床实验室对25(0H)D检测的免疫分析平台进行稳定性评估。
编译节选自：J Clin Lab Anal. 2023 Aug 1; 37(13-14): e24950
