化学发光法对原发性醛固酮增多症患者诊断准确性的评估
【摘要】原发性醛固酮增多症(PA)是内分泌性动脉高血压最常见的原因，推荐的病例筛查检测方法是基于放射免疫分析法(RIA)的醛固酮/肾素比值(ARR)或基于化学发光免疫分析法(CLIA)的醛固酮/直接肾素比值(ADRR)。本研究旨在评估CLIA测定醛固酮和肾素的可靠性以及ADRR的诊断性能。我们对转诊到一家检验医学中心的1110例患者进行了前瞻性队列研究，患者分别接受了使用CLIA测定醛固酮和直接肾素浓度(DRC)，以及使用RIA测定醛固酮和血浆肾素活性(PRA),1110例患者中,640例最终确诊为高血压，其中90例被诊断为PA。总体而言，两种方法测得的醛固酮浓度具有高度显著的相关性(R=0.945，p<0.001)，而DRC/PRA的相关性较弱但仍具显著性(R=0.422,p<0.001)。在高血压患者中，针对PA病例，ADRR和ARR的受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)分别显示为: 0.928 (95%置信区间0.904–0.954)和0.943 (95%置信区间0.920– 0.966)，两者具有可比性且无显著差异。ADRR临界值(cut-off) 为25(ng/L)/(mIU/L)时准确性最高，其灵敏度为91%，特异性为85%。与传统的RIA方法相比，采用CLIA测定醛固酮和DRC是诊断PA的一种可靠方法。
【关键词】原发性醛固酮增多症;醛固酮;直接肾素;血浆肾素活性;化学发光法;放射免疫分析法
原发性醛固酮增多症(PA)是动脉性高血压最常见的内分泌病因。它与原发性高血压(EH)患者相比，醛固酮过量与脑血管及心血管风险增加相关。事实上，研究证据表明，相较于EH患者，PA患者发生缺血性卒中、心律失常、冠状动脉疾病、代谢综合征、糖尿病和慢性肾脏病的风险更高。为了启动适当的治疗并逆转高醛固酮症带来的过度风险，正确且及时地诊断PA至关重要。根据最新的PA指南，高达50%的高血压患者应接受PA筛查。确实，在高血压患者中存在几个PA高概率的亚组，例如患有2-3级高血压或难治性高血压的患者、自发性或利尿剂诱发的低钾血症患者、肾上腺意外瘤患者、心房颤动或早发性高血压患者。目前认为最可靠的筛查指标是血清/血浆醛固酮浓度(AC)与肾素水平的比值。然而，许多干扰因素，如药物治疗或血钾水平，可能干扰生化指标的测量。此外，测量醛固酮和肾素存在不同的实验室方法，例如化学发光免疫分析法(CLIA)和放射免疫分析法(RIA)。鉴于检测条件、干扰药物的重要性以及不同测量方法间缺乏标准化，临床实践指南推荐了不同的ARR临界值(cut-off)可供采用。
传统上，RIA一直是用于测量AC和血浆肾素活性(PRA)的常规检测方法，且具有很高的灵敏度。然而，RIA是一种手工操作且耗时的检测方法，并会产生需要妥善处理的放射性废物。RIA测量的是醛固酮和PRA，PRA的计算依据是血浆样本中血管紧张素原在单位时间内生成血管紧张素I的量。近几十年来，由于多项优势，CLIA已在许多中心迅速取代了其他检测方法，其优势在于:CLIA可以在自动化平台上直接测量AC和直接肾素浓度(DRC)；血浆样本处理更简便；并且是一种比RIA更省时、更具成本效益的方法。使用RIA进行筛查检测的是AC与PRA比值(ARR，醛固酮/肾素比值），而使用CLIA检测的AC与DRC比值(ADRR，醛固酮/直接肾素比值)。最近，液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)也被用于测量AC，该技术被认为是最准确的方法，然而，即使使用该技术，也观察到较高的变异性。此外，该方法成本高昂，仅在相对较少的实验室中使用。
已有数项研究证实，如果在标准化条件下进行检测，ARR和ADRR均可靠且可重复。近年来，CLIA已在许多实验室普及，并优先于RIA使用。文献中有许多研究在相对较小的患者队列中分析了这些激素检测方法的准确性和可重复性，但得出的结果存在不一致的现象。本研究的目的是在一家三级转诊中心的大型前瞻性队列患者中比较使用CLIA和RIA测量醛固酮浓度和PRA/DRC的差异，并比较ADRR和ARR作为PA筛查指标的诊断准确性。
一、研究对象方法
1.患者选择：本研究共分析了1110例患者组成的队列。这些患者于2020年11月至2021年5月期间在都灵大学检验医学部前瞻性招募。纳入研究的每例患者均接受了至少一次醛固酮和/或肾素测量。所有生化测量均在都灵大学检验医学部进行。其中，929例患者同时接受了RIA和CLIA的醛固酮检测，918例患者检测了PRA，920例患者检测了DRC。1110例患者中，640例最终确诊为EH或PA。所有获得最终诊断（PA或EH）的患者，均按照PA国际临床实践指南的建议，在停用干扰药物后接受了筛查和确诊试验。其余患者的数据仅用于评估变量间的相关性，不用于诊断准确性分析。这些患者在筛查前已停用干扰降压药物至少3周（β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素受体阻滞剂）或4周（利尿剂）。存在高血压风险的患者接受钙通道阻滞剂或α受体阻滞剂治疗。筛查试验阳性的判定标准为：ARR≥300ng/L/ ( ng · mL−¹ · h⁻¹)或ADRR≥20（ng/L）/（mIU/L）且醛固酮浓度≥100ng/L。疑似PA诊断的病例，根据内分泌学会指南的建议进行确诊/排除试验和亚型诊断。确诊PA的患者根据国际指南，通过肾上腺CT和肾上腺静脉采血（AVS）进行亚型诊断。所有参与研究的受试者均签署了知情同意书。
2. 生化检测：根据实验室操作规程采集血样：患者在早晨采血，采血前需保持站立至少2h，然后在静脉穿刺前静坐至少15min。血样在室温下离心（3000rpm，15min），并在室温下处理，随后血浆立即在-80℃冷冻保存。用于醛固酮检测的样本采集于血清分离管中，在室温下离心（3000rpm，15min）并处理，随后血清立即在-80℃冷冻保存。分析前，样本需快速复温至室温，然后根据制造商说明进行适当处理。用于PRA和DRC检测的样本同时解冻并分析。使用血管紧张素|放射免疫分析试剂盒，按照制造商说明测量PRA。将每份样本分装两份，一份在4℃孵育，另一份在37℃孵育，然后检测血管紧张素I。PRA的计算方法是：根据孵育时间，用37℃孵育样本测得的血管紧张素|值减去4℃孵育样本测得的值。批内和批间精密度测试显示的CV分别≤11.3%和≤20.9%。分析灵敏度为0.1ng· mL⁻¹· h⁻¹。低于分析灵敏度的样本在孵育18h后重新检测。采用全自动分析仪CLIA，RIA进行测量。患者是前瞻性招募的，RIA和CLIA样本的处理方式相同，因此两种方法之间不存在（由于样本处理造成的）差异。
3. 统计学分析方法：使用IBM SPSS Statistics25和GraphPad PRISM9进行统计。变量分布通过Kolmogorov-Smirnov检验进行评估：正态分布变量(年龄）以均值（m）±标准差（SD）表示，非正态分布变量（PRA、DRC、醛固酮和ARR）以中位数和四分位数间距表示，并通过Mann-Whitney检验进行分析。PRA和DRC也根据以下公式按Z分数标准化（归一化）后报告：Z=（X-m）/（SD）。分类变量（性别）以绝对数和百分比表示。RIA和CLIA测量值之间的相关性通过Pearson’s R检验和线性回归曲线或二次回归曲线分析进行评估。使用Bland-Altman图评估患者内部的变异性（RIA与CLIA测量对比），并检测系统/比例误差或幅度依赖性偏差。采用受试者工作特征（ROC）曲线评价ARR的诊断准确性（RIA法测定醛固酮和PRA与CLIA法测定醛固酮和DRC）。采用Youden指数确定准确性最高的临界值。以p<0.05为差异有统计学意义。
二、研究结果
1. 人群特征：研究纳入了一个总数为1110例的前瞻性队列患者，这些转诊患者进行肾素和/或醛固酮检测，其临床和生化特征总结于表1。该队列的平均年龄为52岁，男性（48.3%）和女性（51.7%）患者比例均衡。1110例患者中，有640例可获得最终诊断，其中，550例（85.9%）最终诊断为EH，90例（14.1%）诊断为PA。在PA患者中，24例（26.7%）被诊断为醛固酮瘤（APA），34例（37.7%）被诊断为双侧肾上腺增生型PA（BiPA），32例(35.6%）患者的亚型诊断未确定。
2. RIA与CLIA测量醛固酮浓度的比较：在队列中，通过CLIA测得的AC中位数为124ng/L，而通过RIA测得的AC中位数为111ng/L（p<0.01）（图1A）。在总样本中（n=929），RIA与CLIA测得的AC之间具有高度显著的相关性[R=0.945（95% Cl 0.938-0.952）；p<0.001]（图1B）。如果仅考虑AC≥100ng/L的样本（n=519），相关性为R=0.942（p<0.001)；而对于AC<100ng/L的样本（n=410），相关性为R=0.656(p<0.001)。根据Bland-Altman分析，在总样本中（n=929），CLIA与RIA测得的绝对AC平均差为2.2（±2.15）ng/L（图1C）。当仅考虑AC≥100ng/L的患者时，平均差呈现负向趋势（-4.9±3.45ng/L），如果仅考虑AC<100ng/L的患者，平均差为13.0(±1.26）ng/L（图1C）。总体而言，CLIA测得的AC平均高估了2.3%，对于AC值≥100ng/L的情况，CLIA低估了4.5%，特别是在AC>186ng/L（IV四分位数）的样本中，RIA测得的数值更高，对于AC值<100ng/L的情况，与RIA相比，CLIA高估了12.7%。
3. PRA与DRC的比较：在我们的队列中，DRC的中位数为13.5[4.5；33.0]mIU/L，而PRA的中位数为0.78 [ 0.27; 2.06 ] ng • mL− • h− ( p < 0.01 ) ( 图2A）。在总样本中（n=918），通过化CLIA测得的DRC与通过RIA测得的PRA之间存在显著相关性R=0.423(95%Cl 0.369-0.475）；p<0.001]（图2 B）。如果仅考虑PRA≥1ng•mL-¹· h⁻¹的样本（n=394），则相关性更高（R=0.668；p<0.001），而对于PRA< 1ng·mL-¹· h⁻1的样本（n=524），则无相关性（R=0.026；p=0.558）。因此，在PRA < 1ng·mL−¹ · h−1的范围内，回归线趋于水平。为此，我们在图2B中添加了一条二次拟合线，以表达PRA与DRC之间的非线性相关性。回归线方程和二次回归方程报告在图2的图例中，通过Z分数标准化后对PRA与DRC进行的相关性分析也证实了相同结果。如Z分数的Bland-AItman图示所示，与PRA相比，DRC平均高估了5.8%（图2C）。
4. 诊断准确性：在高血压患者中，我们选择了通过CLIA或RIA测得AC>100ng/L的患者，并计算了ADRR和ARR。用于阳性PA筛查的临界值为：ADRR≥20（ng/L）/(mlU/L）和ARR≥300ng/L/(ng·mL-1 ·h⁻¹)。为评估两种不同检测方法的诊断准确性，使用了ROC曲线（图3）。对于PA和EH患者，CLIA法和RIA法的曲线下面积（AUC）无显著差异，其值分别为0.928（95%CI0.904-0.954）和0.943（95%Cl0.920-0.966）（图3 A）。根据Youden指数，对于PA诊断，ADRR在临界值为25（ng/L）/(mlU/L）时达到最高准确性，其灵敏度为91.1%，特异性为85.3%。对于ARR，在临界值为436ng/L/(ng·mL-1· h⁻¹）时达到最高准确性，其灵敏度为89.7%，特异性为87.1%。如果我们考虑亚型诊断为单侧PA（UPA）或双侧PA（BiPA）的患者，CLIA法和RIA法的AUC均无显著差异，显示出相当的诊断准确性（图3B，C）。
三、讨论与分析
在本研究中，我们旨在评估一个大型前瞻性队列(1110例转诊至三级医学检验中心的患者)中，CLIA和RIA测得的醛固酮和肾素结果的相关性，以及两种方法各自的诊断准确性。我们观察到，与文献报道一致，在总样本中，CLIA法与RIA法测得的AC具有非常好的相关性。在AC处于正常高值范围的样本中，相关性很高。然而，在AC的低值端(<100ng/L)，相关性较弱，但仍有统计学意义。
当使用CLIA法测量时，AC总体平均高估了2.3%，对于低醛固酮水平(<100ng/L)，观察到明显的平均偏差为12.7%，这一现象与其他研究者的观察结果一致，相比之下，对于高醛固酮水平，我们观察到CLIA法低估了醛固酮浓度。在<100ng/L范围内AC相关性较弱，这可能对盐水输注确诊试验结果的解读构成问题，因为推荐的AC临界值就包含在此范围内。我们此前曾观察到，在接受确诊试验的患者中，CLIA法与RIA法之间具有85%的高度一致性。所有结果不一致的患者均表现出轻度自主性醛固酮分泌表型，其水平处于PA与低肾素性原发性高血压的重叠区域。其他研究也证实了CLIA法在中国高血压患者人群确诊试验中的准确性。
有些作者建议在确诊试验后使用LC-MS/MS测量AC。然而，LC-MS/MS方法普及度低，需要特定的样本处理和专业的实验室人员，并且更耗时、成本更高。此外，在AC低值范围内，CLIA与RIA之间的差异相对较小，并且已有研究提出采用更高的确诊试验临界值来解决此问题。具体而言，采用78ng/L的临界值时，特异性达到87%，且没有漏诊任何单侧PA患者，同时灵敏度为86%。而采用62ng/L的临界值可提供95%的灵敏度，特异性为80%。
由于醛固酮/肾素比值(ARR)在数学上高度依赖于肾素值，当存在极低肾素水平时，即使血浆醛固酮浓度较低，也可能导致ARR升高。因此，这解释了我们将最低AC设定为>100ng/儿L的选择。需要指出的是，选择最低AC为100ng/L可能会漏诊一些病情极轻的PA患者。正因如此，一些学者认为坐位盐水输注试验(SST)中阳性筛查的最低AC值以及盐水抑制试验阳性的临界值应为60ng/L。根据我们的经验，在我们中心未观察到ARR升高且AC在60至100ng/L之间的单侧PA患者。因此，最坏的情况是，我们可能仅漏诊少数双侧PA患者。然而，我们评估了使用CLIA和RIA检测AC在60-100ng/L之间且ARR升高的患者数量。仅观察到1例通过CLIA测得的AC>60ng/L(为98ng/L)，以及3例通过RIA测得的AC在60一100ng/L之间(分别为76、89和93ng/L)，这些患者对ROC曲线的影响可忽略不计。
在我们的队列中，DRC与PRA的测量结果总体相关性较差，在更深层次上，正如预期的那样，在PRA<1ng•mL⁻¹•h⁻1时，我们未能证明CLIA与RIA之间存在显著相关性。一个可能的原因是RIA灵敏度相对较低。在低值水平下DRC与PRA之间的差异也可能部分归因于循环中前肾素(肾素原，pro-renin)在CLIA法中的交叉反应，其浓度比活性酶高10-100倍。已有研究证明，在实验中将一定量的外源性前肾素添加到样本中会导致CLIA法测得的DRC成比例增加。因此，在肾素浓度的低值范围内，前肾素的干扰可能更大。个体间血管紧张素原水平的不同是另一个可能的混杂因素，它会影响PRA的测量，并可能降低CLIA与RIA之间的相关性。此外，冷激活(cryoactivation)是导致检测中PRA和DRC被高估的另一个潜在原因，它会导致前肾素在储存温度介于-5℃至+4℃时转化为肾素，甚至在-20℃储存的样本中也会发生(近期有报道)。在我们的研究中，谨慎避免了可能引起冷激活的温度。另一方面，PRA≥1ng•mL-¹•h⁻1的样本显示出与DRC测量更好的相关性。尽管存在这些局限，ADRR在检测PA方面显示出与ARR相当的准确性，因此，CLIA可以可靠地用于高血压患者的PA筛查。
内分泌学会国际指南推荐使用CLIA测量计算的ADRR和RIA测量计算的ARR来检测PA患者。既往研究比较了ADRR和ARR的诊断性能，并证明了其具有相似的诊断准确性，或显示ADRR具有优越性。在本研究中，我们证明了通过CLIA法测量的ADRR在检测PA患者和单侧PA(UPA）患者方面均具有良好的准确性。在我们的队列中，我们观察到当ADRR临界值为25（ng/L）/(mlU/L）时准确度最高（灵敏度91%，特异性85%）。鉴于PA病例的检出需要高灵敏度，我们建议ADRR临界值设定在20–25（ng/L）/(mIU/L）之间。Li等人曾建议ADRR临界值为29.3（ng/L）/(mlU/L），但该值显示出较低的灵敏度（80%）。而Manolopoulou等人则提出了—个11.2(ng/L)/( mlU/L）的临界值，虽然灵敏度高，但他们采用的是不同的CLIA方法。在我们的队列中并使用我们的CLIA方法，该临界值的特异性过低。鉴于我们研究证明的结果可应用于一般性的PA筛查，但在真实的临床实践中，对于某些情况（通常是临床高风险患者，尤其当无法完全停用干扰药物时），ARR可能无法提供充分信息，此时还需要结合专家医生对醛固酮和肾素水平的个体化解读。本文提供的相关性方程可能有助于RIA和CLIA方法之间的结果比较。
四、局限性
本研究的主要局限性在于最终诊断为PA的患者比例相对较低(14%)，其中诊断为UPA的患者比例更低(4%)。尽管如此，PA患者数量较少是由于本研究在一个单一医学检验中心的真实日常实践中，招募了一个大型(n=1110)未经筛选的患者队列。因此，我们人群中较低的选择偏倚支持了研究结果的普适性和可重复性。本研究纳入的部分患者未能获得明确诊断(PA或EH)。整个队列的醛固酮和PRA/DRC测量数据已被纳入相关性分析，但只有获得最终诊断(PA或EH)的患者数据才用于诊断准确性分析。
在PA诊断流程中，我们采用了ARR临界值≥300ng/L/(ng•mL⁻¹•h⁻¹)，且最低醛固酮水平≥100ng/L，这是依据内分泌学会指南的推荐，也是许多国际中心普遍接受的标准。然而，需要指出的是，这些临界值可能会漏诊一些自主性醛固酮分泌程度极轻的PA患者。确诊试验的醛固酮水平临界值尚未标准化，不同中心之间存在差异。在我们中心，对于坐位SST，我们考虑的醛固酮临界值为60ng/L。这一方面可能对最终诊断产生影响。在PA患者中，有32例受试者未能明确亚型诊断，被归类为亚型未定。
另一个局限性是我们未将CLIA法和RIA法测得的AC与LC-MS/MS的结果进行比较。LC-MS/MS被认为是测量醛固酮最可靠的方法，但其在不同实验室间已显示出相当大的变异性，并且该方法目前尚未获得FDA的批准。此外，该技术成本高昂且普及度不高，因此目前大多数实验室使用的是基于CLIA法的醛固酮测量。再者，LC-MS/MS是醛固酮的一种有效测量方法，但无法用于肾素测量。最后，由于我们队列中肾功能不全的患者数量相对较少，无法评估ADRR和ARR在这类受试者中的诊断准确性。
五、结论
总之，我们的研究在大型患者队列中证实并表明：基于CLIA测定的DRC和醛固酮浓度计算的ADRR，在PA病例检出方面，与基于经典RIA经验证的ARR相比，具有相当的诊断性能。我们证明了CLIA法与RIA法测得的AC之间，以及DRC与PRA之间具有良好的相关性。低醛固酮水平(<100ng/L)的样本尽管相关性低于AC较高的患者，但仍显示可接受的相关性。我们证实了在低肾素值范围内，DRC与PRA0之间缺乏相关性。研究结果对于高血压患者中PA病例的检出具有重要的临床意义。
编译节选自: Int J Mol Sci. 2024 Aug 2; 25(15): 8453.
