甲状旁腺激素检测的标准化与分析中值得注意的问题
甲状旁腺素(PTH)测定对于钙代谢相关疾病的研究以及慢性肾脏病-矿物质和骨代谢紊乱(CKD-MBD)患者的随访具有重要意义。遗憾的是，PTH的生物活性形式[即(1-84)PTH]与许多片段和翻译后修饰形式一起在血液中循环，这降低了免疫测定的特异性。第2代或第3代PTH检测方法缺乏标准化，可能导致错误解读和不良临床后果。PTH的参考范围并不总是正确地确定，多肽的稳定性也是一个值得关注的问题。幸运的是，在过去的几年里，已经开发了使用质谱法(高分辨率或三重四极杆)与液相色谱相结合的新技术，这将有助于不同分析方法的标准化。事实上，PTH检测标准化是IFCC骨代谢委员会的任务之一，这种标准化将使结果的解读更加一致，并将促进旨在建立正确参考范围的研究。
一、甲状旁腺激素基本概述
1.甲状旁腺激素的作用：血清钙、磷浓度的调节依赖于甲状旁腺激素（parathormone，PTH）、骨化三醇[1,25(0H)₂-维生素D]及成纤维细胞生长因子23（FGF23）。PTH主要通过与1型PTH/PTHrP受体(PTH1R，一种G蛋白偶联受体）相互作用而影响肾脏和骨骼，PTH与受体结合后，通过激活蛋白激酶A和C传递信号，此过程依赖于PTH肽链最前端的N端氨基酸序列。在肾脏中，PTH可增加1,25（0H)₂-维生素D的合成，刺激远端肾小管对钙的重吸收。PTH通过诱导近端肾小管顶端钠依赖性共转运体Npt2a的内吞作用，减少磷酸盐的重吸收。在骨骼中，PTH通过位于成骨细胞表面的受体发挥作用。该受体的激活刺激核因子κB受体活化因子配体(RANK-L)的产生[与白细胞介素-1及1,25(0H)₂维生素D协同作用]，同时抑制破骨细胞前体细胞表面RANK受体抑制剂骨保护素(osteoprotegerin）的表达。RANK受体的激活促使破骨细胞前体细胞转化为活性破骨细胞，引发骨吸收并释放钙（及磷酸盐）。此外，PTH通过促进成骨细胞的募集、增殖与分化并减少其凋亡来促进骨形成。基于此机制，药理学中采用每日注射PTH或其类似物(特立帕肽、阿巴洛肽）刺激骨形成，来治疗骨质疏松症。
2. PTH及其片段的合成和代谢：人类PTH基因位于11号染色体的短臂上。甲状旁腺主细胞中合成一种含有115个氨基酸的PTH多肽前体激素（前甲状旁腺激素原，pre-pro PTH），经历了两次连续的蛋白水解裂解，产生PTH，这是腺体储存和分泌激素的主要形式。pre-pro PTH在合成后1min内切除N端25个氨基酸，生成含90个氨基酸的中间前体甲状旁腺激素原（proPTH），在15min内，pro-PTH被运送到高尔基体，经第二次裂解（移除末端6个氨基酸）形成活性PTH（84个氨基酸，9.5kDa）。连续裂解的目的和机制尚不清楚，然而，阻止pre-proPTH裂解的突变可能导致甲状旁腺功能减退，这表明信号肽序列对PTH的正常活性非常重要。
低细胞外钙刺激血液中(1-84)PTH的释放，PTH一旦分泌，其半衰期为2-4min，经肝脏代谢后由肾脏清除，然后释放片段进入血液循环。当钙敏感受体(CaSR)饱和时，甲状旁腺内发生PTH降解。然而，当循环Ca²+水平升高激活CaSR时，甲状旁腺细胞会释放细胞内钙，从而抑制(1-84)PTH分泌进入循环。并加速NH2末端PTH肽蛋白水解，生成大量C端片段[半衰期长于(1–84)PTH]，在慢性肾病(CKD)患者血液中积累。Kritmetapak等人最近利用液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)，对CKD患者血液中的八种不同的PTH片段(28-84、34-77、34-84、37-77、37-84、38-77、38-84和45-84)进行了定性和定量分析。发现当肾小球滤过率(GFR)降至17–23mL/min/1.73m²时，循环PTH片段浓度显著升高。此外，他们还证实了他们最初的发现，即通常认为的“代表性N端截断片段”(7-84)PTH未在CKD或血液透析患者血浆中被检出。我们使用最近开发的LC/MS-MS方法也证实了这一观察结果。
早期的实验数据表明，PTH片段可能具有某种生物效应，并试图解释在CKD患者中经常观察到的“PTH抵抗”。使用Kritmetapak的LC-HRMS技术，这些早期研究中使用的片段均未得到鉴定（或其浓度低于该方法的定量限值）。在另一项最新研究中，Kritmetapak等人发现，通过LC-HRMS鉴定的PTH片段可调节（1-84）PTH在小鼠成骨细胞中的作用。事实上，当与(1-84)PTH一起给药时，这些片段可以刺激或抑制(1-84)PTH的生物活性。如果这些观察结果具有重大意义，则值得进一步研究。
二、分析前注意事项
本刊曾发表多篇开创性论文，强调分析前阶段在检验医学中的关键作用。事实上，分析前阶段对于PTH结果的正确解读至关重要。PTH检测可采用EDTA血浆或血清样本。在《临床化学与检验医学》发表的一篇重要研究中，我们研究了使用一种样本比使用另一种样本的优势。简而言之，使用EDTA抗凝管可显著缩短样本预处理时间，这对术中PTH实时监测尤为重要。此外，EDTA能抑制凝血相关干扰，并通过螯合二价阳离子阻断循环蛋白酶的活性。不过，抗凝剂或纤维蛋白原的存在可能干扰部分检测方法，且无法同步测定钙（PTH结果解读的必要指标）或（骨）碱性磷酸酶，因此需额外采集血清分离凝胶管以完成全面生化分析。关于EDTA管与血清分离凝胶管中PTH的稳定性，虽已有大量文献及系统综述，但结论尚存矛盾。究其原因，不同研究设计存在显著差异，例如：储存温度、样本类型、患者或健康受试者、“基线时间点”定义、储存时间以及样本是否离心处理等。“稳定性”的概念也存在争议，因为可以使用不同的临界值来确定样本中的PTH是否稳定。部分研究采用纯统计学方法（如Wilcoxon检验或多因素方差分析），另一些研究则采用10%或20%的任意临界值，基于IS05725-6分析测定系数或根据WH0的分析变异系数和生物变异系数。在本刊发表的一篇获奖论文中，EDTA血浆中PTH的稳定性优于血清分离凝胶管，但仅限样本在常温（25℃）下长时间（18h）未处理的情况（如外院送检延迟时），其他条件下EDTA与血清样本的PTH稳定性无显著差异。目前极少研究精准评估PTH在-20℃或-80℃的长期稳定性，且现有实验方案差异较大，导致结果难以统一。血清或血浆中的PTH在-20℃或-80℃下似乎可稳定保存至少1年。
三、其他分析前变量
1. 采样部位：对于血液透析患者的随访监测，采样部位的选择尤为关键。此类患者的样本通常通过中心静脉导管或动静脉瘘采集，但外周与中心采样部位的结果可能存在显著差异。为此，IFCC PTH工作组在本刊发表的观点文件中建议，为确保个体内及个体间比较的可靠性，PTH检测样本应始终从同一部位采集。
2. 采样时间：PTH分泌呈双峰节律，夜间达峰值，清晨为低谷，午后再次出现高峰，但其昼夜节律存在显著的个体差异。尽管现有文献关于饮食（尤其是高钙食物）对PTH水平的影响结论不一，但IFCC工作组仍推荐将采血时间控制在10:00-15:00之间。鉴于目前尚无明确证据证明食物摄入对PTH浓度无影响，我们认为要求空腹采血是合理的，特别是在骨质疏松患者随访中需同步检测β-CTX时。对于血液透析患者，应始终在同一时间采集样本，但不要求空腹。近期一项针对美国9.5万例血液透析患者的研究显示，PTH(及磷）浓度在接近中午时最低，傍晚最高，这一规律可为临床治疗方案的制定或调整提供参考。
3. 生物变异：PTH以持续性基础分泌为主，同时伴随约3次/小时的小幅度脉冲式分泌（约占总量
25%）。这种分泌模式导致显著的个体内变异，在结果解读时应加以考虑（详见下文）。根据生物变异数据库，PTH的个体内和个体间变异均值分别为15.7%与23.5%。该结果与血液透析患者（13.8%）及EuBIVAS研究（15.2%）中观察到的结果非常相似。
4. 季节性差异：PTH浓度随季节波动（夏季低、冬季高)，可能与25(0H)-维生素D水平变化相关。夏季时，青春期男性PTH水平下降25%，原发性甲状旁腺功能亢进症患者下降11%（均p<0.0001）。值得注意的是，接受维生素D补充的患者不再表现此类季节性差异。这一发现对于确定PTH参考范围至关重要（见下文）。事实上，根据无症状原发性甲状旁腺功能亢进症治疗指南的建议，应在维生素D水平充足的受试者中确定PTH参考范围。
四、分析中注意事项
1. 用于测定PTH的免疫测定：1963年Berson与Yalow首次报道PTH放射免疫测定法（RIA）。20世纪70年代初，人们开始使用这种免疫测定法，即现在所说的第一代测定法。采用了一种针对C端的抗PTH抗体和125Ι标记肽（多源于牛源），但因C端片段干扰(尤其在血液透析患者中）导致结果偏差显著。1987年，Nichols Diagnostics开发的Allegro免疫放射测定法（IRMA）取代初代方法。第二代试剂盒使用包被于塑料微珠的抗（39-84）PTH片段的捕获抗体以及抗(13-24）片段的1²5Ι标记抗体。双抗体夹心设计有效减少C端及中间段片段干扰，这种“第二代”检测试剂盒和随后的试剂盒被认为只能检测全长（1-84)PTH。后续市场涌现多种类似方法（IRMA或全自动化学发光法），不同试剂盒抗体结合位点存在差异，其中一些检测方法针对激素近端（13-24）片段的N端抗原表位，而另一些是全段PTH检测（iPTH），针对远端（26-32）片段的抗原表位。遗憾的是，人们很快发现第二代PTH检测方法存在局限性。多项研究指出其可能高估CKD患者继发性甲状旁腺功能亢进程度，部分患者尽管表现出低骨转换的组织学特征但iPTH升高。1998年Lepage等证实，多种iPTH检测法都能识别出一种不同于（1-84）PTH的PTH片段，其在HPLC中与合成（7-84）PTH片段共洗脱〔该组分后被称作非（1–84）PTH或引申为（7-84）PTH，但后续研究证实其不存在于人体循环，见前文]。1999年Scantibodies实验室推出首个第三代PTH检测法，这种IRMA被称为整段PTH（wPTH）或生物活性PTH（Bi-PTH），该方法检测抗体特异性结合N端（1-4）片段，由此排除非（1-84）PTH片段检测，通过计算iPTH与wPTH的差值，可定量非（1-84）PTH水平。
2. 高级方法和PTH测定的标准化：当前PTH检测尚未实现标准化，不同检测方法的结果差异导致分析方法间变异显著。为此，IFCC于2010年成立PTH标准化工作组，工作组于2017年发布加强PTH测量的观点和优先事项。根据（1-84）PTH回收的结果，如果所有PTH方法都根据相同材料进行校准，方法间的一致性显然会提高。因此，工作组建议使用同一国际公认标准品，如WH0 PTH IS 95/646。该标准品由重组人（1-84）PTH构成（100μg安瓿）。但因缺乏SI国际单位制的完整溯源性且未评估测量不确定度，尚无法强制推行。目前尚无PTH候选参考测量程序，已报道的两种LC-MS/MS方法存在灵敏度不足且重现性未经验证。尽管近期开发的HRMS-MS方法可同步检测1-84 PTH及其片段，但其对1-84 PTH的灵敏度有限，且未作为候选参考方法进行验证。最新研究中，Farré-Segura等开发了一种无需胰酶消化或免疫纯化的1-84PTH定量LCMS-MS方法，该方法具备候选参考方法的核心特征，对提高免疫测定的标准化具有重要意义。
3.新的PTH形式-翻译后修饰：(1)氨基-PTH: 在甲状旁腺癌和罕见的严重原发性甲状旁腺功能亢进病例中，一种丝氨酸(17位点)磷酸化修饰的(1-84)PTH会过度分泌，导致检测结果出现(第3代/第2代）PTH比值倒置。这种形式称为氨基-PTH，与第3代PTH试剂盒中使用的抗体发生交叉反应，但与第2代试剂盒中使用的抗体不发生交叉反应。正常人群的循环PTH中约有10%是氨基-PTH。因此，（第3代/第2代）PTH比值应始终<1，因第2代试剂盒检出的"非(1–84)大片段"在循环PTH中占比高于氨基-PTH。该比值倒置现象已被提议作为甲状旁腺癌新型诊断工具，研究证实，甚至在血钙升高前，比值倒置即可预测癌症复发风险。(2)氧化型PTH:科学争议的终结?PTH分子含两个蛋氨酸(第8、18位)，自20世纪80年代多项研究证实，氧化型PTH(oxPTH)无生物学活性，其与PTH受体的结合亲和力降低，与受体结合后不能产生cAMP；在平滑肌细胞中丧失生物效应，不能刺激新生骨细胞碱性磷酸酶活性，且在多种动物模型中均无法调节钙磷代谢。鉴于血液透析患者存在严重氧化应激，Hocher等提出假说，PTH等肽链可能被氧化而丧失受体结合能力。由于常规免疫法同时识别氧化型（ox）与非氧化型（n-OX）PTH，研究者采用抗人oxPTH抗体包被凝胶分离两种形式（Immunodiagnostik AG），分离后仅n-oxPTH可被免疫法定量。其研究发现：n-0xPTH最高三分位组的血液透析患者生存率显著高于最低三分位组。后来，基于iPTH和oxPTH之间的相关性，Hocher等人假设，iPTH的总浓度更多地反映了氧化应激，而不是肽的生物活性。事实上，他们发现在稳定的肾移植受者中，仅n-oxPTH（而非oxPTH或总iPTH）与移植肾功能丧失相关，因此只应对n-oxPTH进行量化。这促使研究者呼吁使用仅能识别n-0xPTH的第4代PTH（免疫）检测法。然而，在CKD患者人群中，其他研究发现第2代PTH检测与心血管事件、CKD进展和死亡率的关联比n-0xPTH更密切。对肾衰竭患者骨转换评估，n-oxPTH相比总PTH未提供额外价值。值得注意的是，Kritmetapak等采用自建HR-MS/MS法在CKD队列中未检出oxPTH。我们实验室开发的LCMS/MS方法具有极高的灵敏度和特异性，即使在血液透析患者的样本中，也无法检测到任何oxPTH的踪迹，这使人们对任何氧化形式的存在以及Hocher等人的研究结果产生了怀疑。
五、分析后的考虑因素
1. 生物变异：生物变异（BV）数据对确定分析性能规范（APS）和计算参考变化值（RCV）（即两次连续检测结果间具有生物学意义的最小变异百分比）至关重要。欧洲生物学变异研究工作组发现：个体内BV估计值存在性别差异，男性：13.0%（12.1-14.2%），女性：15.2%（14.3-16.3%）；个体间估计值则相当，男性：26.8%（21.4-35.1%），绝经前女性：27.8%(22.7-36.1%）。基于此，工作组建议PTH检测方法的APS标准为，CV≤6.5%，bias≤7.5%。关于RCV，研究者建议，PTH降低≥26.7%，PTH升高≥36.5%视为有生物学意义。这些发现具有重要的临床和分析意义。从临床角度来看，RCV36.5%的表明，如果患者或受试者
PTH结果之间的差异小于36.5%，那么这两个结果之间就没有明显的生物学变化。如果受试者之前的PTH值为50ng/L（第2代PTH检测法的上限参考范围），如果他的PTH浓度变化>18ng/L，即PTH值>68ng/L，方具生物学意义。同样，对于基线PTH为300ng/L的血液透析患者，如果PTH超过约110ng/（>为410ng/L），则认为PTH变化显著。这也是KDIG0指南坚持考虑PTH变化趋势而非单次检测值的原因之一。
2. 参考区间：确立准确参考区间的关键在于参考人群的选择，为建立精准的PTH参考值，原发性或继发性甲状旁腺功能亢进症患者理应从参考人群中排除。这引出一个核心问题：在招募参考人群确定正常PTH水平时，应采纳何种纳入/排除标准？该人群的排除标准需涵盖所有可能导致PTH浓度升高或降低的病理状态。低血清25-羟维生素D[25（0H)D]浓度在普通人群中高度普遍，因此在表面健康的参考人群中也必然存在。排除维生素D缺乏受试者以建立血清PTH参考值似乎是合乎逻辑的，最新的两份无症状PHPT诊断和管理指南也强烈建议这样做。多项研究证实：从参考人群中排除低血清25(0H)D浓度受试者，可使血清PTH正常上限降低20-35%（具体降幅因检测方法而异）。除25(0H)D水平外，肾功能也是确立PTH参考值的重要考量因素。当估算肾小球滤过率（eGFR）<60mL/min/1.73m²时，PTH水平呈上升趋势。建立参考范围时必须检测肌酐以计算eGFR，因部分表面健康受试者（尤其>60岁人群）可能存在未被识别的肾功能减退。年龄、BMI、膳食钙摄入及种族等其他参数也可能影响PTH参考范围。未来需进一步研究是否应根据这些参数对PTH参考值进行分层。
KDIG0指南建议将血液透析患者血清PTH水平维持在参考范围上限（URL）的2-9倍。因此，确立正确的PTH正常范围上限至关重要。我们在240名健康受试者[男女各120名，25(0H)D>30ng/mL，肌酐、钙、磷均正常]中对10种PTH检测方法建立了参考区间。与厂商建议的参考范围相比，我们的URL一直较低。使用我们的URL（而非厂商建议值）对149例血液透析患者按KDIG0目标范围分类时有明显改善。
六、结论
在临床实践中，PTH检测至关重要。作为最早开发的免疫检测项目之一，肽类研究技术的进步持续推动其发展。近年来质谱法的突破性进展必将推动检测方法标准化、肽链翻译后修饰机制的解析和循环片段潜在作用的深化。《临床化学与检验医学》期刊对PTH检测优化发挥了关键作用，尤其针对实验室错误最主要来源分析前阶段提供了核心建议与规范。
编译节选自： Clin Chem Lab Med 2023; 61(5): 946–953
