新型冠状病毒感染肺炎实验室生物安全与检测技术指南问与答

随着生物、医疗、卫生事业的快速发展，在生物病毒研究、临床实验室诊断、生物技术发展、遗传基因工程等领域的生物安全问题也越来越突出。新发或新认识的病原体的出现（如埃博拉、马尔堡、传染性非典型肺炎等）、传染性疾病的再度爆发（如霍乱、登革热、流感、麻疹、脑膜炎、菌痢、黄热病、鼠疫等）以及病原体的意外或人为泄露都将是二十一世纪所面临的严峻问题。尤其是9.11事件的发生，炭疽等生物恐怖事件引起的恐慌，使生物安全的问题成为各国关注的焦点。

2019年12月以来，湖北省武汉市部分医院陆续发现多例新型冠状病毒感染的肺炎患者，随着疫情的蔓延，我国其他地区及境外也相继发现此类病例。现已将该病纳入“中华人民共和国传染病防治法”规定的乙类传染病，并按甲类传染病管理。随着疾病认识的深入和诊疗经验的积累，对《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（试行第三版）》进行了修订。检验科一线工作人员的经验及医政部分督导验收实验室发现的问题，对第四版进行解读^[1]。

临床医疗一线人员提出的问题如下解答：

问题1： 我国生物安全的法律、法规主要有哪些?

解答：

（1）《中华人民共和国传染病防治法》：该法于1989年2月21日公布，同年9月1日开始施行，2004年8月28日被修订。本法规定我国流行的传染病分为甲类、乙类和丙类三种并实行分类管理，修订后的法律增加了防止传染病病原体扩散、加强病原微生物菌（毒）种的管理及加强卫生监督等有关生物安全的管理要求。

（2）《病原微生物实验室生物安全管理条例》：本条例对于中华人民共和国境内从事病原微生物的实验室及其相关实验活动的生物安全管理做了明确规定，同时，也明确了国务院卫生主管部门、国务院兽医主管部门以及其他有关部门的生物安全监督职责。该条例2004 年11 月12 日开始施行。

（3）《医疗废物管理条例》：本条例对医疗卫生机构和医疗废物集中处置单位建立健全医疗废物管理责任制、加强从事医疗废物工作的人员培训和管理、加强医疗废物的登记管理以及防止医疗废物的扩散和泄露等方面进行了明确规定，目的在于加强医疗废物的安全管理，保护环境和公众健康。该条例于2003年6月4日开始施行。

问题2：我国生物安全的标准和规范主要有哪些?

解答：

（1）中华人民共和国国家标准《实验室-生物安全通用要求》（GB19489-2004）：此标准是我们国家实验室生物安全强制执行的标准，对不同级别生物安全实验室或动物实验室的布局、设施要求、安全设备要求、个人防护、实验室生物安全标准操作规程及实验室其他安全等做了详细的描述。

（2）中华人民共和国国家标准《医学实验室-安全要求》（GB19781—2005 / ISO 15190:2003）：本标准规定了在医学实验室建立并维持安全工作环境的要求，主要包括医学实验室的管理、安全设计、实验室标准操作程序、职业性疾病及意外事故的报告、职工培训、个人责任、防护设备及医学实验室其他安全要求等，适用于目前已知的医学实验室服务领域。

（3）中华人民共和国国家标准《生物安全实验室建设技术规范》（GB50346-2004）：主要规定了生物安全实验室建筑平面、装修和结构的技术要求；实验室的基本技术指标的要求；空气调节和空气净化、给水排水、气体供应、配电、自动控制和消防设施配置的原则；施工、验收和检测的原则等，为我国生物安全实验室的改造和建设提供技术依据。

（4）中华人民共和国卫生行业标准《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》（WS233-2002）（2017年修订）：该标准主要参考了美国疾病预防控制中心/国立卫生研究院（Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, CDC/NIH）的《微生物和生物医学实验室的生物安全》（第四版）并结合国内的经验而制定。主要包括生物安全防护的基本原则、实验室的分类和分级、生物安全实验室的基本要求、三级和四级生物安全实验室的检测和验收等，是我国生物安全领域具有开拓性的行业标准，在2003年传染性非典型肺炎疫情的控制中发挥了积极的作用。

（5）中华人民共和国卫生部《人间传染的病原微生物名录》：于2006年1月11日印发并施行。名录中对已知的380种病原微生物的危害程度以及运输包装进行了分类，明确了其实验活动所需的生物安全实验室级别，可作为实验室从事相应实验活动的依据。

（6）中华人民共和国卫生部令《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（第45号）：于2005年12月28日发布，并于2006年2月1日起施行，适用于可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本的运输管理。

（7）国家环境保护总局令《病原微生物实验室生物安全环境管理办法》（第32号）：于2006年3月8日发布，并于2006年5月1日起施行。本办法适用于中华人民共和国境内的实验室及其从事实验活动的生物安全环境管理。

问题3：生物因子危害程度分几级？

解答：《实验室-生物安全通用要求》（GB19489-2004）中根据生物因子对个体和群体的危害程度将其分为4级：

（1）危害等级I（低个体危害，低群体危害）：不会导致健康工作者和动物致病的细菌、真菌、病毒和寄生虫等生物因子。

（2）危害等级Ⅱ (中等个体危害，有限群体危害)：能引起人或动物发病，但一般情况下对健康工作者、群体、家畜或环境不会引起严重危险的病原体。实验室感染不导致严重疾病，具备有效治疗和预防措施，并且传播风险有限。

（3）危害等级Ⅲ（高个体危害，低群体危害）：能引起人或动物严重疾病，或造成严重经济损失，但通常不能因偶然接触而在个体间传播，或能使用抗生素、抗寄生虫药治疗的病原体。

（4）危害等级Ⅳ (高个体危害，高群体危害)：能引起人或动物非常严重的疾病，一般不能治愈，容易直接、间接或因偶然接触在人与人、或动物与人、或人与动物、或动物与动物间传播的病原体。

问题4：我国将病原微生物分几类？

解答：我国《病原微生物实验室生物安全管理条例》中根据病原微生物的传染性、感染后对个体或者群体的危害程度，将病原微生物分为四类：

（1）第一类病原微生物（相当于危害等级Ⅳ），是指能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。

（2）第二类病原微生物（相当于危害等级Ⅲ），是指能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。

（3）第三类病原微生物（相当于危害等级Ⅱ），是指能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物。

（4）第四类病原微生物（相当于危害等级I），是指在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物。

第一类、第二类病原微生物统称为高致病性病原微生物。

问题5：微生物危险度评估需要考虑哪些因素？

解答：进行微生物危险度评估最有用的工具之一就是列出微生物的危险度等级。但对于一个特定的微生物来讲，在进行危险度评估时仅仅参考其危险度等级是远远不够的，适当时还应考虑其他一些因素，这些因素包括：

● 微生物的致病性和感染数量；

● 暴露的潜在后果；

● 自然感染途径；

● 实验室操作所致的其他感染途径（非消化道途径、空气传播、食入）；

● 微生物在环境中的稳定性；

● 所操作微生物的浓度和浓缩标本的容量；

● 适宜宿主（人或动物）的存在；

● 从动物研究和实验室感染报告或临床报告中得到的信息；

● 计划进行的实验室操作（如超声处理、气溶胶化、离心等）；

● 是否能进行有效的预防或治疗干预。

问题6：实验室防护服有要求？

解答：实验室应确保具备足够的与风险水平相应的洁净的防护服（如外衣和长罩服），可供实验室工作人员或来访者使用。符合国标19082-2009《医用一次性防护服技术要求》；欧盟医用防护服EN14126标准(其中液体阻隔等级在2级以上)，并获得欧盟CE认证；或液体致密型防护服（type3，符合EN14606标准）；喷雾致密型防护服（type4，符合EN14605标准）；防固体颗粒物防护服（type5，符合ISO13982-1&2标准）。

问题7：N95口罩有要求？

解答：符合GB19083-2010《医用防护口罩技术要求》；美国标准NIOSH认证：N95/N99+ASTM F1862 level 1/2/3（Fluid resistant CDC）美国CDC认证；欧盟标准：EN149 FFP2 或FFP3+TypeIR/IIR（Fluid resistant），不带呼吸阀；EN14683+TypeIR/IIR；日本标准：JS-T-8151:2018；澳洲标准：AS/NZS1716。

问题8：医用外科口罩有要求？

解答：符合YY0469-2011技术要求，美国标准NIOSH认证ASTM F2100-11：。Level2&3

问题9：隔离衣有要求？

解答：符合YY/T0506-2016技术要求。

问题10：防护眼镜（护目镜）有要求？

解答：符合二级以上医用护目镜，透亮，视野开阔，有弹力带佩戴（可以与近视镜兼容），物理防溅，不能有通风口。

问题11：医用一次性乳胶手套有要求？

解答：医用一次性乳胶手套GB10213-2006。

问题12：医用防护鞋套有要求？

解答：一次性使用，长筒，有隔水功能。

问题13：手消毒液有要求？

解答：速干手消毒液符合标准Q31/0114000084C049，抗菌洗手液符合标准Q31/0114000084C020。

问题14：帽子有要求？

解答：医用无纺布帽子灭菌型。

问题15：擦手纸有要求？

解答：符合标准：GB/T24455。

问题16：鞋有要求？

解答：鞋应舒适，鞋底防滑。露趾便鞋不适合作为实验室用鞋。推荐使用皮质或合成材料的不渗液体的鞋类。在从事可能出现漏出的工作时可穿一次性防水鞋套。

对实验室常规工作推荐使用符合人类工效学的舒适平底鞋。在实验室的特殊区域，包括高感染防护等级的区域，可能要求使用专用鞋（例如一次性或橡胶靴子）。在接触大量化学品、从事危险活动、日常使用刀或其他利器的组织病理区要求使用经过核准的安全鞋。

问题17：洗眼装置有要求？

解答：在存在喷溅风险而无水管可用的地方，连接于供应充足且开启方便的无菌水容器的简易喷淋型装置也是可接受的替代装置。应每周测试与水供应连接的装置以确保其功能正常并冲掉积水。

问题18：BSL-2实验室可以随便出入？

解答：

（1）在处理危险度2 级或更高危险度级别的微生物时，在实验室门上应标有国际通用的生物危害警告标志。

（2）只有经批准的人员方可进入实验室工作区域。

（3）实验室的门应保持关闭。

（4）儿童不应被批准或允许进入实验室工作区域。

（5）与实验室工作无关的动物不得带入实验室。

问题19：手套使用有注意事项？

解答：

（1）在配带前应检查是否存在漏损；

（2）戴好后完全遮住手及腕部，如适用，可覆盖实验室长罩服或外衣的袖子；

（3）在撕破、损坏或怀疑内部受污染时需重新更换手套；

（4）为工作专用，即仅在接触有潜在感染性材料时使用。在工作完成或中止后应摘掉并按照安全规范进行相应处置；

（5）在接触参考资料、电话和键盘等之前应摘掉污染的手套。

问题20：呼吸装置有注意事项？

解答：呼吸防护装备（如面具、个人呼吸器）应按照作业指导书及培训的要求使用。应安排工作场所监控、医学评价和对呼吸器使用者的监督以确保始终正确使用装备。可要求对呼吸器作个体适合性测试。呼吸器不能充分保护蓄须者。

问题21：实验区消毒活动均采用75%酒精喷雾可否？

解答：不可以，酒精燃点低，关注消防安全。

问题22：护目镜起雾怎么办？

解答：建议使用前用防雾剂喷洒晾干，或者涂一层食用油/肥皂液/碘伏晾干使用。

问题23：防护用品有效期？

解答：有。

问题24：防护用品有型号（防护服，手套）差别？

解答：有，选择适合本人操作的型号。

问题25：口罩需要做密合性实验？

解答：需要，气流会从鼻夹及口罩侧面泄露气体。

问题26：脱防护服需要手消吗？

解答：需要，摘脱防护用品每一步都进行手消。

问题27：在实验区头发和皮肤可以暴露吗？

解答：不可以，额头不能有暴露，如果护目镜和帽子之间有皮肤暴露，需要加戴面屏。建议剪短发。

问题28：穿脱隔离衣需要演练？

解答：需要，尤其是脱隔离衣。

问题29：戴手套可以替代手卫生？

解答：不可以，严格执行七步洗手法。

问题30：消毒剂浓度越高越好吗？

解答30：不是，浓度过高，防止对医务人员的二次伤害。

问题31：开展新型冠状病毒感染的肺炎实验室资质？

解答：按照国家卫生健康委员会《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第四版）》（国卫办疾控函[2020]81号），在生物安全II级实验室主要从事未经培养的感染性材料血清学检测、核酸提取、生化分析等操作。预防措施：在生物安全二级实验室（biosafety level II laboratory，BSL-2）开展，同时采用生物安全三级实验室的个人防护。

问题32：开展新型冠状病毒核酸检测的医疗机构需具备条件？

解答：在设区的市级人民政府卫生主管部门备案的生物安全二级及以上实验室(根据《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院令第424号）)；经过省级卫生主管部门审核备案的临床基因扩增检测实验室。（根据《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》（卫办医政发〔2010〕194号））。第三方检测机构在属地提交申请给医政部门，医政部门进行现场评估后，符合条件的第三方检测机构方可开展工作。

问题33：加强型BSL-2实验室是否可以放松个人防护？

解答：检测三区的压力差是否符合要求（-5至-10KPA）。压力表进行年检，结果合格。从事2019-nCoV的核酸及病原微生物培养、鉴定、药敏，应采用生物安全三级实验室的个人防护。

问题34：医疗机构及第三方检测机构无集中污水处理系统能否开展2019-nCoV的实验活动？

解答：不可以，需要专门的污水处理系统方可开展工作。

问题35：超净台及排风橱能否替代生物安全柜？

解答：不可以，建议使用A2/B2生物安全柜，HEPA进行检漏实验，年检合格。

问题36：高压灭菌器年检不合格能否开展2019-nCoV的实验活动？

解答：不可以，建议使用高压灭菌器（生物型），大容积非快开门高压灭菌器需要人员经过培训，取得特种设备上岗证。

问题37：开展2019-nCoV的实验活动，样本运送是否需要准运证？

解答：需要，新型冠状病毒毒株或其他潜在感染性材料运输应按照《可感染人类的高致性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（原卫生部令第45号）办理 。

问题38：司机1人样本运送运送标本可否？

解答：不可以，运输有专人护送，护送人员不少于两人。护送人员接受了感染性物质包装运输的生物安全培训，并在护送过程中具备相应的风险应对措施。

问题39：外送2019-nCoV标本的转运箱用乐扣盒子替代可否？

解答：不可以，采用三层包装，2019-nCoV毒株或其他潜在感染性生物材料的运输包装分类属于A类，对应的联合国编号为UN2814，包装符合国际民航组织文件Doc9284《危险品航空安全运输技术细则》的PI602分类包装要求；

环境样本属于B类，对应的联合国编号为UN3373，包装符合国际民航组织文件Doc9284《危险品航空安全运输技术细则》的PI650分类包装要求；通过其他交通工具运输的可参照以上标准包装。

问题40：院内2019-nCoV标本的转运桶用普通的小铁皮桶替代可否？

解答：不可以，采用二层包装，辅助容器是在主容器之外的结实、防水和防泄漏的第二层容器，它的作用是包装及保护主容器。多个主容器装入一个辅助容器时，必须将它们分别包裹，防止彼此接触，并在多个主容器外面衬以足够的吸收材料。相关文件（例如样品数量表格、危险性申明、信件、样品鉴定资料、发送者和接收者信息）应该放入一个防水的袋中，并贴在辅助容器的外面。

问题41：如何进行院内2019-nCoV标本的转运清洁消毒流程？

解答：采样后对采样管外表面用2000mg/L含氯消毒剂擦拭→采样管放入塑封袋→塑封袋密封后放入转运箱辅助容器（小黄桶）→拧紧小黄桶盖子→小黄桶外表面2000mg/L含氯消毒剂擦拭→将小黄桶放入转运箱→转运。

问题42：外送2019-nCoV标本必须携带样本送检表？

解答：需要，上送标本，各省（自治区、直辖市）首例检测结果阳性、疑似聚集性病例及聚集性病例的标本，上送中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所进行检测复核，并附样本送检表。

问题43：外送2019-nCoV标本主容器有要求？

解答：有要求，高致病性病原微生物在运输过程中要求采取三层包装系统，由内到外分别为主容器、辅助容器和外包装。高致病性病原微生物菌（毒）种或者样本应正确盛放在主容器内，主容器要求无菌、不透水、防泄漏。主容器可以采用玻璃、金属或塑料等材料，必须采用可靠的防漏封口，如热封、带缘的塞子或金属卷边封口。主容器外面要包裹有足够的样本吸收材料，一旦有泄漏可以将所有样本完全吸收。主容器的表面贴上标签，标明标本类别、编号、名称、样本量等信息。

问题44：外送2019-nCoV标本需要低温运输？

解答：需要，在使用冰、干冰或其他冷冻剂进行冷藏运输时，冷冻剂必须放在辅助容器和外包装之间，内部要有支撑物固定，当冰或干冰消耗以后，仍可以把辅助容器固定在原位置上。如使用冰，外包装必须不透水。如果使用干冰，外包装必须能够排放二氧化碳气体，防止压力增加造成容器破裂。在使用冷冻剂的温度下，主容器和辅助容器必须能保持良好性能，在冷冻剂消耗完以后，仍能承受运输中的温度和压力。

问题45：外送2019-nCoV标本的运输公司是否需要资质？

解答：需要。

问题46：个人防护装备没有开展2019-nCoV标本的实验活动可否？

解答：不可以。

问题47：核酸检测人员佩戴N95(带呼吸阀)可否？

解答：不可以。如果没有，在N95(带呼吸阀)外带医用外科口罩。

问题48：人员核酸检测能力较高是否需要生物安全培训？

解答：需要。

问题49：56℃、30min灭活2019-nCoV标本，水浴箱内污水需要处理？

解答：需要，每日将水浴箱内污水放出，用5500mg/L有效氯浸泡1小时后倒入实验室污水处理系统。

问题50：安全柜操作中可以污染的手套频繁出入？

解答：不可以，需要及时更换污染的手套。

问题51：2019-nCoV标本保存需要专门的冰箱？

解答：需要，设立进行2019-nCOV标本的独立的冰箱，双人双锁，检测完毕非上交CDC标本就地高压销毁。不得用于其它用途。

问题52：提取核酸等相关耗材需要评估？

解答：需要，尤其对耗材是否含有RNA酶进行评估。

问题53：56℃、30min灭活2019-nCoV标本会影响检测结果？

解答：会，会降低0.5-1个Log，需要关注弱阳性的标本判读。

问题54：2019-nCoV核酸检测需要做质控吗？

解答：需要，每批实验要带有3个阴性质控品，1个弱阳质控品。

问题55：2019-nCoV核酸检测人员需要体温监测吗？

解答：需要。

问题56：2019-nCoV检测人员在人员密集的休息区需要带口罩吗？

解答：需要。

问题57：休息区需要开窗通风吗？

解答：需要。

问题58：采集2019-nCoV标本需要病毒采样管？

 解答：需要。

 问题59：实验区能用喷雾加湿器？

 解答：不能。

 问题60：毒株和样本需要专人管理？

 解答：需要，新型冠状病毒毒株及其样本应由专人管理，准确记录毒株和样本的来源、种类、数量，编号登记，采取有效措施确保毒株和样本的安全，严防发生无用、恶意使用、被盗、被抢、丢失、泄露等事件。

问题61：RT-PCR试剂需要选择？

 解答：需要，本指南中的核酸检测方法主要针对新型冠状病毒基因组中开放读码框lab（open reading frame lab , ORF1ab）和核壳蛋白（nucleocapsid protein，N)。

问题62：标本采集种类有要求？

解答：有，每个病例必须采集急性期呼吸道标本（包括上呼吸道标本和下呼吸道标本）；重症病例优先采集下呼吸道标本（如支气管或肺泡灌洗液等）；出现眼部感染症状的病例，需采集眼结膜拭子标本；出现腹泻症状的病例，需留取便标本。可根据临床表现与采样时间间隔进行采集。其他研究材料依据设计需求采集。 

问题63：实验完毕，所有使用过的仪器需要擦拭消毒？

解答：需要，1000mg/L有效氯擦拭所有仪器及实验台面。

问题64：手工操作需要在生物安全柜内进行？

 解答：需要^[2]。

问题65：检测人员需要4小时更换？

 解答：需要。

问题66：样本保存，有要求？

解答：有，用于病毒分离和核酸检测的标本应尽快进行检测，能在24小时内检测的标本可置于4℃保存；24小时内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存（如无-70℃保存条件，则于-20℃冰箱暂存）。血清可在4℃存放3天，-20℃以下可长期保存。应设立专库或专柜单独保存标本。标本运送期间应避免反复冻融。

问题67：护理、保洁、保安、后勤人员进入实验区需要防护？

解答：需要。

问题68：开展2019-nCoV实验活动需要注意院感防控？

解答：需要，医疗机构应当严格按照《医疗机构消毒技术规范》，做好医疗器械、污染物品、物体表面、地面等的清洁与消毒；按照《医院空气净化管理规范》要求进行空气消毒。在诊疗新型冠状病毒感染的肺炎患者过程中产生的医疗废物，应根据《医疗废物处理条例》和《医疗卫生机构医疗废物管理办法》的有关规定进行处置和管理^[3]。

问题69：实验室人员健康状况异常，是否需要隔离？

解答：需要。

问题70：实验室人员从武汉等疫区返京，是否需要隔离？

解答：需要。

参考文献

[1]新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南(第四版) (2020. 2.6).

[2]阿祥仁，戴二黑，府伟灵等，2019新型冠状病毒肺炎临床实验室生物安全防护专家共识[J]，中华检验医学杂志，2020，43（00）：E001.

[3]国家卫生健康委办公厅《关于印发医疗机构内新型冠状病毒感染预防与控制技术指南（第一版）》.

收稿日期：2020-02-10