新型冠状病毒感染的免疫学指标分析

赵秀英，博士、主任医师、教授、研究生导师，清华大学附属北京清华长庚医院检验医学科主任。从事感染与免疫学研究，擅长分子生物学及免疫学诊断技术、消化系统感染性疾病的临床诊治。以第一作者或通讯作者发表论文80余篇，其中SCI文章18篇。承担局级以上项目十余项。学术任职包括中华医学会微生物与免疫分会全国委员、中国医师协会检验医师分会全国委员、北京医学会检验医学分会常委等。

2019年12月，由2019新型冠状病毒（2019 Novel Coronavirus, 2019-nCoV）感染引发的病毒性肺炎（COVID-19）在湖北省武汉市迅速蔓延，并且呈全球性流行趋势。疫情被世界卫生组织列为“国际关注的突发公共卫生事件”。2019-nCoV与2003年流行的SARS-CoV 和2012年流行的MERS-CoV均属于β-冠状病毒属。目前，该病毒已被纳入我国乙类传染病，并按照甲类传染病进行预防和控制^【1】。流行病学数据显示，2019-nCoV的传播速度很快，但致病性要弱于SARS-CoV和MERS-CoV。但是，仍有10% -20%的患者病程发展迅速，其中部分患者进展为重症肺炎或发生急性呼吸窘迫综合征等临床表现等^【2】。2019-nCoV的病毒分离、分子及蛋白结构解析已在疫情初期完成。

2019-nCoV感染患者的常规临检与生化检测包括：血常规、尿常规、C反应蛋白、凝血功能、血沉、肝肾功能、降钙素原、肌酸激酶、肌红蛋白、肌钙蛋白等。有文献报道，2019-nCoV感染引起的炎症因子风暴是导致病情迅速进展的重要因素^【3-6】。临床对确诊患者应结合病情、病程，特别是重症或危重症患者有必要进行免疫学检测：本文结合冠状病毒感染引起的肺炎的致病特点，总结2019-nCoV感染的免疫学指标，为疾病的治疗与预防提供参考。

一、冠状病毒的病原学及2019-nCoV感染机制

冠状病毒（Coronaviruses）在电子显微镜下呈日冕或皇冠状^【7】。全球第一例已知的冠状病毒是1937年自病鸡的体内分离出的禽传染性支气管炎病毒；第一例人冠状病毒在1956年于人类鼻腔分离，但遗传进化分析结果显示，该病毒起源于蝙蝠，且与人类共存至少500-800年^{【8, 9】}。 根据冠状病毒的血清学和基因组特点，将冠状病毒亚科分为α、β、γ、δ四个属，其中β属又分为A、B、C、D系^【10】。冠状病毒主要编码4种结构蛋白为棘突蛋白（S蛋白）、核衣壳蛋白（N蛋白）、膜蛋白（M蛋白）和包膜蛋白（E蛋白），这些蛋白是维持冠状病毒结构完整性的必要蛋白^【11】。其中S蛋白介导病毒附着于宿主细胞的表面受体，驱动病毒和宿主细胞膜之间发生融合，促进病毒侵入宿主细胞^【12】；N蛋白是形成病毒中病毒样颗粒（VLP）的必需蛋白^【13】；M蛋白是最大的结构蛋白，常与其它结构蛋白相互作用，决定了病毒包膜的形状^【14】；E蛋白是最小的结构蛋白，在宿主细胞内大量表达，与病毒的重组、成熟及复制有关^【15-17】。

作为冠状病毒家族成员，2019-nCoV有包膜、呈直径为60~140nm的圆球形或椭圆球形。我国学者Xu等对其进行了遗传进化分析，发现2019-nCoV的分子核酸序列与SARS-CoV和MERS-CoV有明显区别，2019-nCoV与SARS-CoV的分子序列同源性是70%；它与MERS-CoV的序列同源性是40%。随后，该课题组通过对2019-nCoV的S蛋白的结构模拟，发现其受体结构域与MERS-CoV病毒的受体结构差异很大，MERS-CoV的受体是二肽基肽酶-4（DPP-4），继而排除了2019-nCoV的S蛋白受体是DPP-4的可能性。2019-nCoV的S蛋白整体结构与SARS-CoV病毒相似度极高，虽然其与人受体ACE2相互作用的蛋白与SARS-CoV病毒相比发生了4个氨基酸的改变，然而该突变并不影响其与ACE2受体蛋白相互作用的结构构象。上述证据支持2019-nCoV是通过S蛋白与受体蛋白ACE2相互作用，从而侵入人体呼吸道上皮细胞，且具有很强的感染人的能力^【18】。

二、2019-nCoV感染的免疫学指标 

1.淋巴细胞计数及淋巴细胞亚群分析

淋巴细胞减少是SARS和COVID-19发病早期的共同表现，也是病毒感染性疾病的非特异性表现。对COVID-19患者，淋巴细胞计数减少被认为是预后较差的一个检验学指标^【11-13】，其主要影响的淋巴细胞种类是CD4+T淋巴细胞，但也包括CD8+T淋巴细胞和自然杀伤细胞（NK）。这一表现与SARS-CoV感染极为相似，在重症与合并ARDS的SARS患者中，CD4+与CD8+T淋巴细胞计数均明显降低，但CD4/CD8比值无明显变化。通过淋巴细胞计数与淋巴细胞亚群分析，包括 T细胞（CD3+）、B细胞（CD19+）、NK细胞（CD16/CD56）、辅助性T细胞（CD3/CD4）和抑制性T细胞（CD3/CD8）的分析，可以了解患者的免疫功能状态，对了解COVID-19发病机理、判断预后和指导临床治疗均有意义。

细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T Lymphocyte，CTL）在机体抵抗各类病毒感染，以及因病毒感染所致的免疫病理损伤起到了极为重要的作用。我国学者的研究结果显示：CD8+CTL在急性SARS-CoV感染中参与控制病毒复制、以及导致免疫损伤中发挥双重作用^【19】。 SARS-CoV感染肺部组织后，导致组织中的上皮细胞、肺细胞、基质细胞、抗原呈递细胞等释放细胞因子或趋化因子，吸引特异性CCR5+CD44+CTL迁移至肺部。这些特异性淋巴细胞被招募到外周组织清除病毒的同时，外周血中的CD8+就会明显减少，这也是造成SARS-CoV感染相关的淋巴细胞减少症的原因之一^【19】。目前CTL在COVID-19疾病控制和机体免疫的作用尚不明确。

2. 细胞因子检测

细胞因子是由免疫细胞产生的、一类具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。COVID-19的重症/危重症患者会出现IL-2、IL-6、IL-7、IL-10、GSCF、IP10、MCD1、M1D1A、以及TNF-α等细胞因子不同程度的升高。有必要根据病程发展，适当检测相应的细胞因子，旨在评估患者的自身免疫状态、精准治疗^【20】。病毒感染宿主后，通过宿主细胞进行复制、并在传播过程中造成宿主细胞死亡，诱发炎症反应，炎症反应加速免疫相关细胞聚集和细胞因子释放^{【21, 22】}；另一方面，CTL还能破坏病毒感染的组织细胞，并诱导更多的中性粒细胞和巨噬细胞迁移至损伤的组织，而迁移来的致敏淋巴细胞和单核/巨噬细胞等会产生更多的炎性因子，导致细胞因子网络失调，并且提高了吞噬细胞和NK细胞的杀伤活性，病情趋于恶化^【19】。对细胞因子的检测有助于治疗评估，如对过强免疫因子释放的患者有必要适量使用激素，有报道血液净化治疗有助于清除过量细胞因子，对重症患者治疗有一定作用^【1】。当前，临床实验室常用的细胞因子检测包括IL-6、IL-2及TNF-α，随着基础研究开展，希望对其它细胞因子包括IFN-α/β/γ的研究不断完善。

3. 2019-nCoV特异性抗体检测

根据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第六版）》，病毒核酸检测阳性仍是COVID-19诊断依据。但临床常遇到疑似患者多次2019-CoV核酸检测假阴性的情况，这一现象加大临床诊断的难度，也给疑似患者收容、治疗带来困难甚至延误病情。核酸检测假阴性的影响因素很多，检验前包括：样本的采集、存放、转运、RNA提取方法等多方面因素；检验中包括试剂质量、操作技术、质量控制等。新版《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》中已经提出用血清样本进行抗体检测作为辅助诊断的要求。

2019-nCoV抗体检测试剂盒包括针对IgM、IgG，以及IgM/IgG联合检测三种类型。临床评估实验显示抗-IgM和抗-IgG的临床特异度分别为96.20%和94.41%；COVID-19确诊病例中，抗-IgM敏感度为70.24%，抗-IgG的敏感度为96.1%。另外，在19例核酸检测阴性的患者中，有16例患者的抗-IgM为阳性（84.21%），18例为抗-IgG阳性（94.74%）^【23】。该结果显示，2019-nCoV抗体检测具有良好的敏感度和特异性。其应用可以部分弥补了核酸检测“假阴性”漏洞，值得临床推广。同时应该看到，目前对试剂的应用均基于流行期间确诊患者的小样本分析，对于2019-nCoV后流行期的应用效果尚需大样本检测分析。 

目前，我国获批的2019-nCov抗IgM和IgG检测试剂盒主要采用2019-nCov的包膜蛋白E和核衣壳蛋白N作为抗原。胶体金法检测所需样本量较少、操作简便、样本不需要离心处理，可以减少气溶胶污染的可能性；基于酶联免疫与化学发光法检测需静脉采血及样本离心等操作，增加了气溶胶污染的可能性，但是其准确度和灵敏性更优。此外，应该关注针对COVID-2019的抗体检测，尤其是IgG抗体检测，可能受到既往其它冠状病毒感染的影响。文献报道已治愈的SARS患者，通过体液免疫产生的IgG抗体，可以持续超过12月以上。其次，要注意IgM抗体检测可能受到类风湿因子、自身抗体及异嗜性抗体干扰导致假阳性；第三，由于对IgG抗体检测需要间隔一段时间追踪复测，会造成临床不便，因此，有必要设立国家标准品，用以对IgG抗体检测进行相对定量。鉴于新冠病毒无既往感染，希望在近期推荐针对IgG的cut-off作为判断感染的标准。

综上，临床诊疗中有必要结合临床症状、影像学特征，以及免疫相关的指标， 动态监测病情变化，对重症病例做到早预警，及时干预，提高治愈率。

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