简单高效的MPA-多重PCR检测技术及其应用前景
实时荧光定量PCR技术具有巨大的优势：快速、灵敏度高、重复性好、污染风险低等优点而得到了广泛的应用，包括病原体的定性定量监测及药效评价、基因单核苷酸变异（SNV）分析、肿瘤基因检测和诊断等，至今仍然是临床基因检验的主流技术，在生物学和医学基础研究、疾病诊断、新药开发、农业、食品、环保等各个领域都被广泛应用。
随着应用领域的拓展，对多个靶标同时检测的需求日渐增多。早期多重PCR方法是通过加入多对引物以扩增多个产物，因受到荧光通道的限制，只能实现有限联检（3-4种病原体联检）。目前常用的荧光PCR机器通常具有4-6个通道，基于水解探针的PCR的多重检测上限通常限于每个荧光通道对应一个靶标（病原体或等位基因），极大地限制了多重检测的能力。利用熔解温度判断产物序列的高分辨熔解曲线(high-resolution melting，HRM)分析技术或是微流控芯片集成多个PCR反应以实现多重检测，如梅里埃Filmarray平台、赛沛GeneXpert平台，但需要专机专用的封闭设备，通用性不强，并且试剂成本昂贵，检测通量有限，不适合在中等级别PCR实验室普及和推广。新近出现的多重探针扩增（MPA）技术，旨在降低成本、应用广泛、兼容常用平台，突破单个检测通道的限制实现多重检测多个靶标。MPA技术将TagMan探针技术和溶解曲线技术相结合，充分利用4个荧光通道（FAM、VIC、ROX、CY5），每个荧光通道分别检测多达6个不同的靶点，成功克服了荧光通道的限制，实现了单管检测多达20个以上靶基因。
MPA技术对每个特定靶点使用PCR引物和探针（双标记荧光探针和部分互补寡核苷酸杂交探针PCO）的组合。每个探针/PCO混合物都有一个独特的溶解曲线（不同的溶解温度），允许对样品中的目标进行特定检测。实时PCR以常规方式进行，指数扩增样品中的任何病毒或细菌靶标。如果存在一个或多个靶标，则在探针水解过程中消耗相应的探针，从而放大荧光信号并生成最终的溶解曲线。通过比较每个样品与阴性质控的溶解曲线，可以判定消耗了哪些特定探针；通过形成一个特征性的溶解曲线特征谱来提示样品中存在的靶标类型，见图1。
图1. MPA技术的双探针设计和特征性溶解曲线谱
目前MPA技术已成功用于多个领域，涉及妇女生殖健康、肿瘤、传染性疾病、基因测序等。包括用于宫颈癌筛查的HPV DNA分型产品（31个亚型）、HPV RNA分型（14个高危亚型）产品、用于肿瘤个体化用药的基因突变产品（EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS）、用于感染性疾病检测的产品（登革热、念珠菌、塞卡病毒、流感病毒）等。其中宫颈癌筛查产品已获得CE-IVD认证，CFDA注册工作也即将完成。
一、结核杆菌的耐药基因检测
传统PCR分析结核杆菌的耐药基因通常需要多个探针（通常超过4个）覆盖rpoB核心区域，Tao Luo等[1]开发了低成本且无需复杂PCR平台的实时PCR方法用于快速检测耐药结核分枝杆菌。针对rpoB基因核心区域，设计两个长荧光标记探针（超过25个核苷酸）就足以检测该区域的突变，无需太多探针致成本增加。所有探针只使用FAM标记，以反应中两个探针的Tm差异实现双重检测，在单荧光通道或是单通道PCR仪就可完成。根据PCR扩增结束时探针的溶解曲线分析溶解温度（Tm）的偏差，当浓度低至5个DNA拷贝时，仍可以区分野生型和突变型，见图2。
图2.（a）结核分枝杆菌rpoB基因核心区（81bp）和两个内部标记长探针的示意图；（b）双标记探针和目标DNA序列产生荧光信号的机理；与野生型相比，耐药突变被检测为溶解温度（Tm）的偏差，这种差异在熔化曲线的导数图上以峰值体现.
二、真菌感染的检测
侵袭性念珠菌病是全世界最常见的医院真菌感染之一，念珠菌诊断的滞后可引起抗真菌治疗的延迟而导致高死亡率。基于多重探针扩增（MPA）技术的单管双通道五重检测技术，设计六个具有独特熔解温度的探针，并用同一种荧光基团标记，用于鉴定引起侵袭性念珠菌病的主要念珠菌菌株[2]。可同时在种水平上鉴定耳念珠菌，光滑念珠菌和假丝酵母菌，在属的水平上鉴定另外六种白色念珠菌和非白色致病性念珠菌。该方法克服了基于传统qPCR单通道检测一种生物标志物的限制，分析扩增后的熔解曲线即可简单识别感染因子，特别是可鉴定多重耐药性的超级真菌：耳念珠菌。
三、HPV检测
应用基于MPA技术开发的高风险人乳头状瘤病毒（HR-HPV）的实时PCR检测方法，可同时检测和区分14种HR-HPV基因型（16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66和68a/b）[3]。此技术的独特优势在于仅需单个PCR反应管，通过测定实时PCR中每个荧光通道中溶解曲线谱的差异分析多达六个靶标，以实现对14种高危HPV类型的多重检测，见图3。全程闭管反应，减少开管污染风险，成本低、速度更快，无需特定的专用平台，广泛兼容临床和研究实验室中常用的96孔实时PCR设备。此技术通过了WHO HPV实验室网络能力研究（2014）的验证，可准确检测所有14种HR-HPV类型，充分验证了特异性和敏感性。另外在一个500例确诊患者细胞学样品的回顾性队列研究中，与其他2个商用试剂进行了性能对比[4]。结果显示检测一致性分别为97%和95%，kappa值分别为0.90和0.93。检测宫颈上皮内瘤变（CIN2）的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为92%、54%、33%和96%。
图3. 基于MPA的HR-HPV特异性探针的设计。（A）设计用于靶向HR-HPV特定序列45（+），51（+），35（+），66（+），56（+）和33（-）探针混合物的溶解曲线图谱。用ROX荧光团标记探针。（B）设计用于靶向HR-HPV特定DNA序列的59（+），31（+），16（+），18（+）和52（-）探针混合物的溶解曲线图谱。用FAM荧光团标记探针.
四、新冠病毒及其他17种呼吸道病原体多重检测
广州市宝创生物技术有限公司采用多重探针扩增（MPA）研发的18种呼吸道病原体联检试剂，既能助力疫情防控，也能在全年度应对多样的呼吸道感染流行情况。检测谱覆盖包括SARS-COV-2在内的18种呼吸道常见病毒及亚型：SARS-COV-2、甲流（H1N1、H3N2、H7N9）、乙流、副流感（1、2、3、4亚型）、腺病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒、偏肺病毒、冠状病毒229E、冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、冠状病毒OC4。临床注册检验的结果表明阳性、阴性内部参考品的符合率为100%；最低检出限≤100 copies/μL；批内精密度验证对应通道Ct值的变异系数（CV）≤5.0%，见表1。
表1. 呼吸道18种病原体核酸分型检测试剂的批内精密度(Ct值)结果
检验结果使用全自动分析软件判读，消除操作人员的主观偏差，使结果判读更加便捷和准确，见图4。
图4. MPA配套自动判读软件的结果示意图。A样本对应的测试孔；B FAM通道上的人冠状病毒Covid-19阳性特征性曲线谱；C HEX通道上人副流感1病毒阳性特征性曲线谱；D FAM通道上空白质控的特征性曲线谱
在定点收治医院与第三方试剂进行的一致性评估，总符合率为75.6%。另外结果显示在疑似感染患者中，除新冠病毒单一感染外，双重感染和三重感染的发病率为10.94%，见图5。此结果与近期8274例武汉新冠肺炎密切接触者中近6%新冠病毒感染者和18%非新冠病毒感染者同时合并其他呼吸道病原体感染的报道类似[5]。
图5. 疑似新冠病毒感染患者中合并感染的发病率
宝创公司研发基于MPA技术的18种呼吸道感染病毒联检试剂盒，可匹配当前大多数实验室现有设备、现有人员，既可以检测SARS-COV-2，又可以筛查常见呼吸道感染病原体的试剂盒。兼容多种常规PCR平台，能够在提高检测通量的同时节省样品降低成本，不仅可以在2019新冠病毒的疫情防控中实现对新冠病毒的高效检出，还可以同时发现和鉴别其他呼吸道病原体的合并感染情况，如甲流、乙流、呼吸道合胞病毒等。辅助临床一线在全年度、全方位地筛查多达32种引起呼吸道感染的常见病原体，早期提供重要的鉴别诊断信息，大幅度提高诊断灵敏度，并有可能会改变现有的流感诊断和管理模式。
广州市宝创生物技术有限公司 供稿
参考文献
Luo, T., et al., Multiplex real-time PCR melting curve assay to detect drug-resistant mutations of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol, 2011. 49(9): p. 3132-8.
Jainlabdin, M.H., et al., Single-tube, dual channel pentaplexing for the identification of Candida strains associated with human infection. Sci Rep, 2019. 9(1): p. 14692.
Sakellariou, G.K., et al., Principles and analytical performance of Papilloplex® HR-HPV, a new commercial CE-IVD molecular diagnostic test for the detection of high-risk HPV genotypes. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2019. 95(1): p. 46-54.
Bhatia, R., et al., Evaluation of a Novel Single-Tube Method for Extended Genotyping of Human Papillomavirus. J Clin Microbiol, 2018. 56(3).
Wang, M., et al., Clinical diagnosis of 8274 samples with 2019-novel coronavirus in Wuhan. medRxiv, 2020.
