APTIMA人乳头瘤病毒（HPV） 16 18/45mRNA基因分型试验检测中国女性 选定组宫颈上皮内瘤样病变3（CIN3） 或癌症的性能

高危人乳头瘤病毒（hrHPV）持续感染是是宫颈癌前病变和浸润性宫颈癌的主要原因，世界范围内99.7%的宫颈癌与特定HPV类型有关。研究显示HPV初步筛查比细胞学筛查更灵敏，能够鉴别CIN3或宫颈癌（≥CIN3）。目前，美国和欧洲已经使用HPV试验作为宫颈癌筛查的独立初步筛查试验。

目前美国有一些有效的HPV试验，欧洲使用线阵HPV基因分型方法（LA；Roche，Molecular Diagnostics, Laval, Quebec, Canada）总计鉴别出37种高危和低危HPV类型。HC2 HPV试验（HC2；Qiagen，Gaithersburg，MD）、AMPLICOR HPV试验（Amplicor，Roche Molecular Diagnostics, Pleasanton，CA）、实时高危HPV试验（Abbott Molecular，Abbott Park，IL）和cobas HPV试验（Roche Molecular Diagnostics，Pleasanton，CA）是监测13或14高危HPV类型DNA的试验。Aptima HPV试验（Gen-Probe Inc.，San Diego，CA）和Protect HPV-Proofer试验（Proofer；Norchip AS，Klokkarstua，Norway）可检测14或5种高危HPV类型的HPVE6/E7 mRNA。

其余悬而未决的问题包括：开发更好的筛查算法提高阴道镜的阳性预测值（PPV）以及在中国执行HPV筛查方法的问题。HC2试验检测HPV DNA序列很灵敏，阴性hrHPV试验与宫颈疾病的存在有关。因此，需要对hrHPV呈阳性的女性进行进一步分类来鉴别存在宫颈癌前病变和宫颈癌风险的女性。

先前的研究显示发展为癌症前体细胞的风险与基因型有关。肿瘤相关hrHPV类型和HPV16、18和45感染的风险特别高。但是HC2试验不能区分个别HPV类型。APTIMA HPV16 18/45 mRNA试验是一种检测HPV 16、18和45的基因分型试验。迄今为止还很少有关于结合病毒载量，HPV16、18和45预测宫颈（癌前）癌临床意义的研究。目前仍然不能确定HPV试验能否通过区分检测中国女性中最重要的HPV类型来进一步优化。

目前的研究中，早已开始使用HPV16、18和45类型特异性mRNA探针来探索HPV16、18和45呈阳性的女性在鉴别≥CIN3方面是否能够受益。因此，此次研究的目的是通过研究中国人群致癌HPV感染和宫颈组织学病变的关系，理解APTIMA HPV16 18/45 mRNA基因分型试验的临床应用，通过鉴别适合用于有≥CIN3趋向女性筛查的生物标志物而受益。

该研究在北京大学第三医院执行。全部程序均经当地伦理学委员会批准。

从2013年11月1日起至2014年1月9日止，总计394名女性接受了连续阴道镜检查符合研究合格标准。

合格标准包括年龄20岁（含20岁）以上、未孕、无骨盆放射历史、无子宫切除和先前宫颈癌或蔓延前病变治疗史、根据HC-2试验hrHPV为阳性存在未测定临床意义的非典型性鳞状细胞或根据流体细胞学试验存在具有更大意义的鳞状细胞。

参与研究之前，未接受阴道镜检查之前，所有研究参与者，根据制造商要求，使用Cervex帚型刷（Rovers Medical Devices，Oss，Netherlands）单独进行一次HPV试验用宫颈标本采样，获得的样品悬浮于PreservCytcollection培养基（Hologic Inc., Marlborough，MA）内。

阴道镜检查由2名资深妇科专家执行，根据护理标准，在患者参与研究当天执行活检。使用阴道镜取得受试者2或3份可见病灶诊断性活组织切片。成功进行阴道镜检查但未发现明显病灶时，在子宫上皮移形带12点钟或6点钟方向进行2次钻取活组织检查。对阴道镜检查不成功的患者进行子宫颈内刮除术。

使用HC2试验（DigeneCorporation，Gaithersburg，MD）—一种通过探针混合液和化学发光法用于检测包括hrHPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68的微孔板信号扩增杂交试验，执行HPV筛查。结果表示为相对光度单位（RLU），该单位通过试剂盒内的样品信号与阳性试剂平均信号之比计算得出。当RLU/临界值（CO）比为1.0或更高时，样品视为阳性。

APTIMA HPV16 18/45 mRNA试验（Gen-Probe Inc., SanDiego，CA）设计用于检测液态宫颈标本内致癌的HPV16、18和45型 HPVE6/E7 mRNA。该程序按照制造商说明执行。简而言之，将1mL等份的PreservCyt样品移入2.9mL缓冲清洁溶液内，在全自动Panther系统上检测一份400-uL等份的混合物。

根据组织学诊断评估HPV试验的临床性能，存在≥CIN3作为原发疾病终点，第二研究终点为CIN2。计算≥CIN2和≥CIN3检测的灵敏度、特异性、PPV和阴性预测值（NPV）。使用二项式方法计算95%置信区间（CI）。

使用皮尔森卡方检验分别比较≥CIN3和＜CIN3组的患者背景。使用风险概率（OR）评估2组间致癌HPV基因分型的差异。使用SPSS软件13.0版（Chicago，IL，USA.）执行统计学分析。小于0.05的概率值视为统计上的显著差异。

利用HC2试验使用RLU/CO评估HPV感染强度（即病毒载量）。结果分入3组：1≤RLU/CO＜100、100≤RLU/CO＜500和RLU/CO≥500。有时，这3个水平的分类合并为2个水平（1≤RLU/CO＜100和RLU/CO≥100）。

利用HC2试验结果和HPV16 18/45 mRNA试验结果，分层定义HPV感染：HPV16阳性（HPV16+）；HPV18/45阳性（HPV18/45+；3名同时感染HPV16的女性分为HPV16+）；HPV16阴性，HPV18/45阴性和HC2阳性（HPV16/18/45-外加HC2+）。

研究参与者为22-68岁女性（中值年龄=35岁）。394名参与者中，152名女性（38.6%）存在≥CIN2；55名（14.0%）存在≥CIN3，包括8名肿瘤患者。其余女性没有组织形态学异常或CIN1。

在所有年龄组中鉴别出具有≥CIN3的病例，阵发性年龄段为30-39岁（图1）。在≤24岁的年龄组中，通过HPV16 18/45 mRNA试验中诊断出3名呈阳性的女性，其中1名诊断为≥CIN3。≤24岁年龄组中没有诊断出≥CIN3及HPV16/18/45 mRNA阴性。

图1. 宫颈疾病和年龄的分布。≥CIN3，宫颈上皮内瘤样病变阶段3或宫颈癌。＜CIN3，宫颈上皮内瘤样病变阶段2或更低阶段。

394名女性中，76名女性为HPV16+；55名为HPV18/45+；63名为HPV16/18/45外加HC2+。因此，该人群中HPV16/18/45的患病率为33.2%（131/394[95%CI，10.5-17.4%]）。

年龄较大组的HPV16/18/45患病率为34.7（95%CI，29.3%-40.0%），与年龄较小组相比也不是显著较高（28.6%，95%CI，19.3%-17.9%）（P=0.280）（表1）。

如表1所述，≥CIN3人群的HPV16/18/45的患病率为65.5%（36/55）（95%CI，52.9%-78.0%），显著高于CN2或更低阶段人群（＜CIN3）（28.0%，95%CI，23.2%-32.8%）（P<0.001）。在8名患有宫颈癌的女性患者中，5名经HPV16 18/45 mRNA检测为阳性，其他为阴性。在3名HPV16/18/45为阴性的女性癌症患者中，1名的细胞学结果为非典型性腺细胞（AGC）其他2名为高度鳞状上皮内病变（HSIL）。

 总研究人群（n=394）

RLU相对光度范围，CO临界值，CI置信区间，n1检测阳性病例数量，N1总病例数量

与HPV16/18/45外加HC2+组的患者相比，HPV16+鉴别≥CIN3的OR为6.3（95%CI，3.2-12.3），HPV18/45为3.2（95%，7.4-7.2）。因此HPV16+组≥CIN3的患病率与HPV18/45+组相比没有明显不同（表2）。

分类算法检测≥CIN2的灵敏度为52.0%（95%CI，44.0-59.9%），特异性为78.5（95%CI，73.3%-83.7%）。≥CIN3作为终点时，灵敏度和特异性分别为65.8%（95%CI，52.9%-78.0%）和75.0（95%CI，97.2%-76.8%）（表3）。

我们在对数尺度上将女性的病毒载量分为3组，这3组分别为1≤RLU/CO＜100、100≤RLU/CO＜500和RLU/CO≥500，并计算具有95%CI的HPV16/18/45 mRNA的患病率。1≤RLU/CO＜100组的HPV16/18/45 mRNA患病率为21.9%（95%CI，14.7%-29.0%），100≤RLU/CO＜500组为34.0%（95%CI，24.5%-43.6%），RLU/CO≥500组为41.3%（95%CI，33.9%-48.6%）。HPV16/18/45 mRNA的患病率睡着病毒载量的增加而上升（表1）（P=0.002）（表1）。

我们通过100RLU/CO的HC2将病毒载量作为区分患者具有高、低HOPV载量的临界值，并计算具有95%CI HPV16/18/45 mRNA阳性或隐性组的高HPV载量患病率。HPV16/18/45阳性组的高病毒载量患病率为78.6（995%CI，71.6%-85.6%），显著高于HOV16/18/45阴性组（62.0，95%CI，56.1-67.8%）（P=0.001）（表4）。

我们选择55名患有≥CIN3的女性，计算具有95%CI的HPV16/18/45 mRNA阳性或阴性组的高HPV载量患病率。HPV16/18/45阳性组的高病毒载量患病率为83.3%（95CI，71.2%-95.5%），显著高于HPV16/18/45阴性组（47.4%，95%CI，24.9%-69.8）（P=0.005）（表5）。

选择263名HPV16/18/45呈阴性的女性时，计算具有95%CI的高HPV载量和低HPV载量组≥CIN3的患病率。高病毒载量组CIN3的患病率为5.5%（95%CI，2.0%-9.0%），统计上并不显著高于低HPV载量组（10.0%，95%CI，4.1-15.9%）（P=0.005）（表6）。

在hrHPV DNA阳性女性分类算法的研究中，我们在参考人群中使用3种hrHPV类型的APTIMA mRNA基因分型试验。该人群的HPV16/18/45 mRNA的流行率为33.2%，≥CIN3人群的HPV16/18/45基因型的流行率为65.5%（95%CI=52.9%-78.0%），这和先前的报告类似。它表明HPV1/18/45基因分型是中国≥CIN3女性最常见的HPV类型。

与HPV16/18/45阴性外加HC2阳性组相比，HPV16+鉴别≥CIN3的OR为6.3（95%CI，3.2%-12.3%），HPV18/45+为3.2（95%CI，1.4-7.2）。它表明存在HPV16/18/45会大幅升高≥CIN3的风险。能将HPV16、18和45从其他致癌HPV类型区分出来的HPV筛查可能能够鉴别存在最高≥CIN3风险的女性，HPV16 18/45 mRNA试验能在中国执行的HPV初步筛查中进一步对HC2阳性病例进行分类。检测≥CIN2和≥CIN3的灵敏度和特异性和其他研究的HPV16/18/45 DNA基因分型类似。因此HPV16/18/45 mRNA呈阳性的女性应该立即接受阴道镜检查。

我们目前的发现显示≤24岁年龄组仅有1名女性诊断为CIN3（1/18），她经过HPV16 18/45试验的检查为阳性。无论HPV16 18/45 mRNA试验是否能用于20-24岁年龄组的初步宫颈筛查，该数据体现的数量有限，需要进一步研究。

一些研究使用HC2值作为病毒载量。我们目前的发现显示病毒载量的可变性很大。由于是广泛分布，病毒载量不能用作疾病生物标志物。基因分型可能改善宫颈筛查项目中存在HPV女性的风险分层。

我们发现HPV16/18/45 mRNA的患病率随着病毒载量的升高而上升（表1），而且当1名妇女为HPV16/18/45 mRNA阳性时，她总是存在高病毒载量（表4）。不仅如此我们发现≥CIN3外加HPV16/18/45阳性显著与高病毒载量有关，这种相关性高于≥CIN3外加HPV16/18/45阴性组。这表明不同的HPV类型可能具有不同的致癌机制，这需要进一步研究。HPV16及其病毒载量与宫颈疾病和癌症前体细胞有关，可以作为预测未来宫颈病变演进的潜在生物标志物。因此，HPV16 18/45 E6/E7mRNA结合高病毒载量可以作为疾病生物标志物，这也需要在中国人群中进一步研究。

世界范围内HPV16、18和45与大约70%-80%的致癌HPV类型有关。因此单独检测HPV16 18/45不能满足肿瘤监测的需求。HPV16/18/45阴性病例的管理需要进一步研究。一些研究建议使用hrHPV病毒载量对hrHPV呈阳性的女性进行分类。我们的数据显示在HPV16 18/45 mRNA阴性的案例中，高病毒载量不能预测分离的宫颈病变（表6）。因此，病毒载量不适于HPV16/18/45呈阴性女性的进一步分类。目前的研究中，仅有3个癌症病例为HPV16/18/45阴性，她们的细胞学结果为HSIL或AGC，这表明HPV16 18/45 mRNA结合细胞学作为分类策略相当安全。

总之，APTIMA试验将与致癌作用有关的E6/E7基因作为目标。HPV16 18/45mRNA基因型试验在宫颈癌筛查方面具有较高价值。APTIMA HPV16 18/45mRNA试验未来可以用于HPV初步筛查计划的分类，或许还能作为单独初步筛查试验。基于联合Pap试验和HPV DNA试验的筛查项目改善了宫颈癌（癌前）的检测，但是也存在局限性。组合试验的灵敏度高于单一试验，因此临床特异性和≥CIN3的PPV不够高。一个包括2个高特异性试验的联合试验的筛查项目能降低阴道镜的使用频率、避免过度治疗降低无谓的治疗成本。例如，APTIMA HPV16 18/45mRNA试验可以用作初步筛查试验，HPV16/18/45呈阳性的女性必须立即接受阴道镜检查和密切随访，但是其他女性应该接受高PPV≥CIN3试验的进一步分类，还需要进一步研究这些试验的临床性能。

但是，此次研究存在一些局限性。hrHPV检测用的HC2系统（Digene）是一种信号扩增杂交抗体捕获试验，RLU/CO表示13致癌HPV类型一种或以上累积病毒载量的半定量值。累积HPV病毒载量表示多重感染之和，不能测定单一HPV基因型复制的真实作用。另一方面，样品细胞数量不标准。因此HC2试验不能可靠地测定HPV DNA水平。

因此没有一种标准的定量测量试验能令人满意地测定HPV DNA水平，如实时PCR（QPCR），临床性能不足。HC2仍是可靠的致癌HPV DNA检测试验，具有很好的实验室间一致性。

（摘自Pathology and Oncology Research，版权归其所有，仅供内部参考）

编译：张凯

审校：王小茜