头颈部鳞状细胞癌患者血浆和唾液内 HPV和体细胞突变的检测

为了研究肿瘤特异性DNA作为头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）生物标志物的潜力，我们分析了从93名HNSCC患者唾液或血浆中提取的DNA。从中寻找体细胞突变或人乳头瘤病毒基因，将二者并称为肿瘤DNA。在对血浆和唾液进行检测时，47名患者中有96%检出了肿瘤DNA。早期和晚期存在可检测肿瘤DNA的患者分数分别为100%（n=10）和95%（n=37）。肿瘤患者口腔、咽部、喉头和下咽部肿瘤DNA的检测率分别为100%（n=15）、91（n=22）、100%（n=7）和100%（n=3）。唾液中，全部口腔癌患者和47%-70%其他癌症患者检测出了肿瘤DNA。血浆中，80%的口腔癌患者和86%-100%其他癌症患者发现了肿瘤DNA。因此，对于口腔癌患者，唾液更容易富集肿瘤DNA，而血浆内更容易富集其他癌症患者的肿瘤DNA。3名术后复发患者在复发诊断之前的唾液内发现了肿瘤DNA，而在5名未复发患者唾液内没检测到肿瘤DNA。唾液和血浆内的肿瘤DNA似乎具有作为检测HNSCC生物标志物的潜在价值。

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是世界上第七大常见癌症，每年大约新增50多万患者，仅美国每年就有超过5万名新增患者。某些类型HNSCC的发病率似乎在逐年上升，尤其是年轻人群，造成这种情况的部分原因是人乳头瘤病毒（HPV）感染的患病率的上升。HNSCC患者的5年总存活率很低，只有50%，尤其是对于HPV阴性肿瘤患者，这种情况仍未改变。目前治疗这种疾病的靶向疗法非常少，这部分因为导致该类癌症发生的致癌基因激活性突变较少；大多数HNSCC的遗传变异使肿瘤抑制基因失去了活性。目前还没有可用的HNSCC生物标志物用于检测疾病严重性或对疗法的反应，从限制了这种对人类健康造成不利影响甚至造成死亡的恶性疾病的研究进展。

尽管HNSCC肿瘤通常可以根据组织学、生物医学特性包括人口统计资料、危险因素和临床表现进行分类，但是这种疾病会因发病部位的不同而产生差异（图1）。解剖学上，该肿瘤被归类为口腔（包括舌头）、咽部（包括舌根）、喉头和下咽部鳞状细胞癌（SCC）。口腔SCC，除舌部以外，在美国的发病率逐年降低，这是因为烟草消耗在逐年减少。相反，涉及上颚和舌神经（舌根）扁桃体的口咽部SCC发病率逐年上升，尤其是青少年。 这些肿瘤通常与HPV有关。患有和HPV有关肿瘤患者的存活情况优于那些患有和HPV无关肿瘤的患者。喉部SCC的发病率正在下降，不像其他位点的HNSCC，由于存在组织学障碍，不太容易发生远端转移。下咽部是HNSCC最不常见的位点，下咽部的发病率正在下降但是相对其他位点预后较差。

肿瘤内存在的遗传变异可以作为癌症生物标志物的想法在二十多年前就已经提出了。遗传变异超越传统生物标志物如癌胚抗原或前列腺特异性抗原的优势在于肿瘤细胞的基因改变非常特殊。将遗传变异用作这一目的一项挑战是体液内的突变DNA模板浓度通常很低。但在过去的几年中，技术的进步使检测这种突变成为现实，尽管这类突变很罕见。技术的进步促进了血浆、粪便、子宫颈抹片以及尿液内的变异DNA序列检测。

图1：肿瘤DNA从头颈部癌症脱落到唾液或血浆内的原理示意图。多个组织学位置的肿瘤脱落到唾液或血液循环内的DNA片段包含肿瘤特异性突变和HPV DNA。唾液内肿瘤DNA的检测能力随着肿瘤组织学位置的不同而变化，口腔癌症的灵敏度最高。血浆内肿瘤DNA的检测能力变化与肿瘤组织学位置关系较弱。

在此项原理验证性研究中，我们确定了在患有不同阶段和不同组织学位点HNSCC患者的唾液和血浆中检测出遗传变异DNA的可能性。我们选择这两种体液基于如下原因：血浆能容纳许多种癌症包括HNSCC的肿瘤DNA，尽管只是一些HNSCC，但是包括所有晚期阶段，这在之前已经得到了证实。在血浆应该可以检测从HNSCC基底侧上皮细胞释放到淋巴或静脉系统中的肿瘤DNA。另一方面，在唾液中应该可以检测主要从HNSCC管腔侧释放的DNA。下文将详述通过检测验证这些假设。

93名HNSCC患者参与了这项研究。参与者的平均年龄为60岁，其中83%为男性，男性是HNSCC的典型患者群体（表S1）。从口腔、咽部、喉部和下咽部分别采集了46、34、10和3份样品。20名（22%）患者为疾病早期（I或II期），其余73名（78%）患者为疾病晚期（III或IV期）。

研究伊始，我们试图从每种肿瘤至少鉴别一种遗传变异。我们首先研究了肿瘤DNA内是否存在HPV16或HPV18序列。对不断增长的NSCC亚型而言，HPV是一种既定的病因学因素，尤其是口咽部SCC。通过使用与多数HPV相关HNSCC 高危HPVE7基因特异PCR引物对，我们鉴别出30名（32%）患者的肿瘤包含HPV16 DNA，但没有检测出HPV18 DNA。HPV16占多数并不奇怪，以为之前该肿瘤的流行病学研究已经证实了这一点。在63名患者中（不存在HPV），我们使用多重PCR和大型平行测序（引物序列详见表S2）研究了HNSCC常见变异基因或基因区域的体细胞突变，包括TP53、PIK3CA、CDKN2A、FBXW7、HRAS和NRAS，从而鉴别出63份样品中58份样品的驱动突变。在剩下的5份样品中，通过低覆盖基因组测序鉴别出了已有报道的1种驱动突变或染色体易位。最终，我们鉴别并确定了63份样品都具有遗传变异。最常见的突变基因是TP53（63名患者的86%）。我们还研究了25名存在HPV患者肿瘤的突变，发现了这些样品中的12份存在突变。

筛查试验的重要特点是样品易于获得，不会造成患者不适，而且采样过程标准化。为了达到这些目标，我们使用含潄剂、血浆和商购试剂盒制备常规基因分型用DNA。就唾液而言，我们使用采样试管（包括细胞和细胞碎片）的全部成分制备DNA。此次研究术前采集唾液的93名患者中，47名（51%）患者同时志愿捐献血浆。血浆中的DNA使用先前所述额方法纯化。使用数字PCR 查询HPV序列和易位，使用Safe-SeqS（安全测序系统）评估点突变，该系统是一种基于PCR的技术，用于检测低频率突变（见前述）。

研究结果显示, 76%患者（n=93）的唾液和87%患者（n=47）患者的血浆中鉴别出了肿瘤DNA（表1）。在同时捐献血浆和唾液患者的子集中，96%（n=47）的患者至少一种体液中存在肿瘤特异性突变。47名患者中的21名存在HPV阳性肿瘤。21名患者（86%）中的18名患者的血浆和/或唾液中存在可检测的HPV DNA（表1）。由于在健康个体的口腔标本中很少发现HPV16，于是我们将10名非HPV阳性肿瘤患者作为对照组分析了他们的唾液或血浆样品。不出所料，这些样品中没有发现HPV，确认了该试验的特异性。在全部26名非HPV阳性肿瘤的患者中，我们通过唾液和血浆鉴别的大部分内生DNA突变为TP53基因（92%）。因此，体细胞突变和HPV序列都可以作为恶性肿瘤生物标志物。在同时检测血浆和唾液时，这些生物标志物检测癌症的灵敏度会显著提高，优于单独检测血浆或唾液。同时进行血浆和唾液采样的患者的唾液内肿瘤DNA数量与血浆内肿瘤DNA数量没有显著相关性（相关系数0.074，P=0.74），但是使用唾液或者血浆用于检测HPV或者体细胞突变，对于不同疾病位点会产生差异，详见下文。

全部（100%）46名患有口腔癌症患者的唾液中都能检测出肿瘤DNA（表1）。在不能直接通过含潄剂采样的位点，唾液检测恶性肿瘤的灵敏度较低：口咽部癌症、喉头癌症和下咽部癌症患者唾液存在可检测肿瘤DNA的比率分别为47%（n=34）、70%（n=10）和67%（n=3）。血浆内肿瘤DNA的检测率随着位点不同发生的变化较小：口咽部癌症、喉头癌症和下咽部癌症患者血浆存在可检测肿瘤DNA的比率分别为80%（n=15）、91%（n=22）和100%（n=3）。

众所周知HPV相关肿瘤在某些特殊位点最常见，尤其是口咽部。34名口咽部癌症患者中的29名（85%）为HPV阳性。剩余的5名口咽部癌症患者通过PCR检测为HPV阴性，这可能与烟草消费有关，存在TP53突变。相反，59份样品中的1份口腔、咽部、喉部和下咽部均为HPV阴性。46名检测的口腔癌症患者中的1名呈HPV阳性的发现与近来口腔HPV相关癌症的低发病率相一致。就口腔HPV相关癌症而言，此次研究的HNSCC患者中，30名（32%）的体液中存在HPV DNA，是一种非常方便的标志物。通过HPV16 E7基因特异单一引物，唾液样品中的40%（n=30）检测出了HPV，86%的可用血浆样品检测出了HPV16 DNA（表1）。

表1. 唾液和血浆内的肿瘤DNA检测。通过检查唾液、血浆或二者同时检查检出肿瘤的患者百分比，按肿瘤位点、阶段和HPV状况分类。

共同来看，这些数据表明在检测咽部、喉部和下咽部肿瘤DNA方面，血浆是比唾液更佳的体液。在32名患有上述位点癌症且唾液血液都经检测的患者中，血浆中检出的突变DNA明显比唾液中检出的多, 分别为29和18。可检测突变DNA等位基因的数量，表述为评估的总等位基因分数，这些患者血浆内检出的等位基因是唾液内检出的等位基因的10倍以上（中值，分别为0.146%和0.015%；P=0.005，威尔科克森秩和检验）。较高的等位基因分布简化了鉴别突变任务。这种等位基因数量的对比在口腔内未观测到：患者血浆和唾液内突变DNA分布，以及突变等位基因分布类似（中值0.65% VS 0.54%； P=0.14，威尔科克森秩和检验）。

大部分HNSCC患者在诊断时已经处于疾病晚期（III期或IV期）。因此，此次研究的93名患者中仅有22名处于疾病早期。总的来说，从疾病早期患者血清中检测出肿瘤特异性DNA的概率是100%（n=20），唾液的检出概率是86%（n=73）（P=0.116，费舍尔精密试验）。疾病早期阶段，唾液能提供比血浆更灵敏的预测因素。 唾液灵敏度，100%（15/15名口腔癌症患者，3/3名口咽癌症患者，和2/2名喉癌患者）；血浆灵敏度，70%（5/7名口腔癌症患者，2/2名口咽癌症患者，和0/1名喉癌患者），（P=0.03，费舍尔精密试验；表1）。75%（15/20）的处于疾病早期患者提供的信息有助于提高唾液在口腔癌症的肿瘤DNA的检测灵敏度，术后优先检测唾液可以更加容易检出肿瘤DNA。相反，晚期疾病患者中，血浆能提供比唾液更灵敏的预测因素，疾病早期患者的唾液VS疾病晚期患者的血浆，肿瘤DNA检出率，92%（n=37）VS 70%（n=73）（P=0.008，费舍尔精密试验，表1）。按淋巴状态进行区分时，存在/不存在淋巴转移患者血浆/唾液检出肿瘤特异性DNA的概率分别为83%（n=59）和100%（n=34）。唾液和血浆均检测时，癌症的检测能力会随着疾病的阶段不同而略有差异（表1）。一个重要的提示是：仅有5名患有非口腔部位早期癌症的患者；尽管所有患者均可检出肿瘤DNA（在唾液中全部都检出肿瘤DNA，3名血浆经过检测患者中的2名在血浆中检出了肿瘤DNA），但是处于疾病早期患者检出的肿瘤DNA数量远低于晚期患者（中值，0.007% VS 0.06%；P=0.03，威尔科克森秩和检验）。

使用PCR评估时，30名患者的肿瘤中存在HPV16 DNA，不存在HPV18。这30名患者中，29名患者的肿瘤被认为与HPV相关，这种判断基于高危HPV序列的原位杂交分析和通过p16抗体进行的免疫组织化学分析所获得的临床数据；一个病例中，未在诊所确定HPV状态。此外，诊所内不存在患有与HPV相关肿瘤的患者而且通过PCR鉴别其肿瘤不存在HPV16 DNA。这支持了我们实验的特异性和灵敏度。如文献所述，30名患者的肿瘤中只有1名患者的口咽部肿瘤发现了HPV DNA。正如预期的那样, 患有与HPV相关肿瘤的患者的血浆比唾液提供了更多信息；患者血浆中检测HPV DNA的概率是86%（n=21），而唾液的概率仅为40%（n=30）（表1）。

尽管不是此次研究的主要目的，但是我们还是确定了手术摘除肿瘤后患者的唾液或血浆内是否可检出肿瘤DNA。9名治疗前可鉴别出肿瘤DNA患者的“随访”样品可用，但是实在出现疾病复发临床迹象之前（图1）。例如，患者HN339患有口腔癌症，术后四个月在其血浆和唾液内发现了肿瘤DNA，但是出现明显临床复发是在19个月之后（术后23.6个月）。与之类似的是，患者HN402，患有口腔癌症，术后8个月在血浆和唾液中检出肿瘤DNA，却是在出现明显复发9个月之前。患者HN380患有喉癌，术后7个月在唾液中发现了肿瘤DNA，此时没有出现任何临床表现或放射学结果提示癌症复发；此后不久该患者死于癌症复发。患者HN367患有口咽癌症，术后25个月在唾液中发现肿瘤DNA；档案记录时（术后36个月），没有病理切片证明疾病明显出现复发，但是影像学分析提示的局部或转移性病变造影的可疑迹象，让临床进程变得颇为复杂。其他5名样品可用患者的唾液和/或血浆中没有检出肿瘤DNA，这些患者在中值随访12个月时没有出现临床复发迹象。

现有HNSCC诊断方法使疾病早期检测、治疗反应评估、治疗副作用区分、治疗无进展和疾病复发的区分充满挑战。这些问题让临床决策大打折扣，严重危害患者管理。尽管现在对于这些癌症的了解越来越深入，包括HNSCC，这些癌症出现的状况源于遗传变异，但是如前所述这些知识只是应对诊断挑战的开始。在此次原理证明性研究中，我们证明了HNSCC患者的唾液和血浆中可以检测出肿瘤衍生DNA。我们还证明血浆可以作为唾液评估的补充，可以容易地在超过90%试验参与者的体液中检出肿瘤衍生DNA。我们的发现在概念和实际功能上有助于HNSCC早期临床检测试验的设计，无论是对于高危患者还是先前经过治疗但存在复发危险的患者，试验设计无疑都是有帮助的。不仅如此，这些结果成为了治疗反应检测的范例。

此次研究有几个值得注意的发现。唾液内肿瘤DNA检测的灵敏度在各个点都不同，并且对于口腔肿瘤最为有效。不仅是46名口腔癌症患者每一名的肿瘤DNA检测，而且唾液内突变DNA分数尤其高（中值，0.65%；四分差范围，0.17%-0.22%，平均值，3.46）。不仅如此，早期口腔癌症的检测率很高；75%的口腔癌症患者处于早期阶段（I期和II期），并全部可检测。口腔癌症患者唾液内高肿瘤DNA分数形成了解剖学概念，证明这一试验类型局部体液最佳检测灵敏度的优势。

口腔远端HNSCC（口咽、喉部和下咽部）仍可以通过唾液检查检测，但是检测的频率（分别为47%、70%和67%）和突变等位基因的分数（中值，0.015%）显著低于口腔内（0.65%）。解剖学定位很可能能够解释这种区别。漱口可能会提高这些远端位置肿瘤DNA的检测能力，但是为了检验这个想法，不得不设计可再现的漱口方案。

此次研究的一个惊人的现象是当同时检测唾液和血浆时，证明可以提高灵敏度。灵敏度提高的原因可能仅仅因为这二者内的突变DNA作为生物标志物的高度特异性；因为不希望出现假阳性，所以可以结合任何数量的试验，在无损特异性的前提下，提高灵敏度。当可以同时检测唾液和血浆时，将这两种体液结合检测可以使癌症的检测率达到96%，高于单独检测这二者其中一种的检测率。

我们强调：我们的研究确认了使用唾液和血浆揭示HNSCC存在的循证原理，但是不能构成临床试验。对于每个患者，我们首先对肿瘤进行评估，接着使用变异（存在HPV或体细胞突变）来查询唾液或血浆。在实际的诊断试验中，一枚基因检测卡会被用于评估每个案例。幸运的是，发现突变的技术已经陈述，即使这些突变出现的频率很低。根据此次研究得到的结果以及大型HNSCC遗传研究的结果，一枚检测卡可以包含HPV16 DNA序列、TP53、PIK3CA、NOTCH1和CDKN2A，能检测超过95%的侵袭性HNSCC。我们研究的另一个局限性是早期口腔癌症患者数量很少，这部分反映了一个不幸的事实：实际上大多数检出的癌症都已经处于晚期。未来更大规模的研究应该能够测定使用本文描述的方法，检测早期咽部、喉部和下咽部癌症的检测频率。实际上美国至少70%的口咽癌症都与HPV有关，这大大降低了任务的难度。

本文研究结果的一个重要用途是用于临床可疑病灶的诊断。现有HNSCC诊断程序相当复杂且高度专业化，造成了诊断和治疗的延误，对预后和存活也产生诸多不利影响。通过检测患者的唾液和血浆内的肿瘤DNA可以让很多患者避免这种延误。例如一种试验可以成为常规检测的潜在组成部分，对现有诊断方式进行补充，实现更好的临床决策。另一种显而易见的用途是疾病监视和监测。在9名唾液和/或血浆进行预处理的患者中，在术后的不同时段多次采集样品。事实是5名术后未出现复发的患者未检出突变，这强调了突变试验的特异性。令人鼓舞的是我们在术后仅数月出现复发患者的唾液中鉴别出了临床水平的肿瘤DNA，这表明，试验可以提供具有临床意义的前置期。此次研究的结果提供了更大型研究的设计方案来探索唾液或血浆内存在肿瘤DNA是否有通过临床标准助于管理决定性治疗后的无病患者。

这是一项使用采集的样品进行的回顾性研究，样品来自93名捐献唾液的HNSCC患者，其中47名同时捐献了血浆。采用双盲形式进行数据分析，全部样品均经过去识别。

此研究使用的全部样品来自93名患者，样品使用约翰霍普金斯大学（JHU）和MD安德森医学中心机构审查委员会批准的协议采集。当前研究涉及的患者从未参加过我们先前从事的研究，描述了HNSCC的基因组特征。在原发HNSCC决定性治疗和复发HNSCC抢救治疗前采集了唾液样品比例分别为（n=71,93名患者的76%）和（n=22.93名患者的24%）。在这些患者的子集（n=9）中，采集治疗后唾液进行监测。大部分患者（93名患者的95%）接受了原发肿瘤和/或转移淋巴结病理切片检查，距离第一次采样的时间平均为44天（表S3）。22名患者出现了复发，先前的治疗包括重复手术、放射、和/或化疗，这些治疗在样品采集前的平均2.9年完成。

治疗前，采集了93名患者中47名患者的全血样品。使用了4-10ml血浆进行DNA纯化，平均血浆使用量为6ml。

使用2种不同的方法采集了唾液。使用JHU方法时，要求患者使用15-20买了0.9%的生理盐水漱口10-15秒，然后将漱口水吐到试管中。使用MD安德森方法时，患者需要将唾液置于口底5分钟且不可吞咽，然后将唾液吐到采样用小瓶中。使用这两种方法获得的DNA数量、突变DNA分数和HPV序列数量没有太大差别。唾液被置于-80℃环境中直到DNA纯化完成，所有的唾液，无需细胞离心分离，全部用于DNA纯化。使用的平均唾液量为15ml（范围，10-20ml）。

当可以使用从侵袭性SCC手术标本中获得的新鲜肿瘤组织时，将这些组织置于-80℃的环境中。冷冻的组织不可用时，使用福尔马林固定石蜡（FFPE）包埋的组织进行DNA纯化。无论何种情况（新鲜冷冻或FFPE），解剖肿瘤确保瘤细胞结构大于30%。使用AllPrep试剂盒（Qiagen，catalog #80204）从全血细胞小球内纯化DNA，使用QIAamp循环核酸试剂盒（Qiagen，catalog #55114）从血浆中纯化DNA。

每个肿瘤使用分层方法鉴别体细胞突变。首先，使用这些变体（HPV16：TGTGACTCTACGCTTCGGTTG 和 GCCCATTAACAGGTCTTCCA；HPV18： GCATGGACCTAAGGCAACAT 和 GAAGGTCAACCGGAATTTCAT）的E7致癌基因特异性引物评估HPV16和HPV18是否存在。不存在HPV时，使用包含TP53、PIK3CA、CDKN2A、FBXW7、HRAS和 NRAS相关区扩增引物的多重PCR鉴别肿瘤内的驱动突变。如果在查询区域未鉴别出突变，则从每名患者的肿瘤和全血细胞小球中制备DNA配对末端文库并用于低覆盖度全基因组测序或外显子组测序。在约翰霍普金斯医学院的Goldman测序机构或PGDx Inc. 内的Illumina HiSeq设备上执行大规模平行测序。使用如下标准鉴别先前所述的点突变：等位基因分数>20%，点突变读数>5，易位读数>1。通过不一致映射配对末端读数分析鉴别基因组重排。当至少5对不同的标签（具有不同的起始位点）跨越相同的2个1-kb bins时，不一致映射配对末端读数集合成1-kb bins，并根据近似断点进行进一步注释。通过独立的PCR和测序反应确认1个选定的突变，并随后将用于查询唾液或血浆。此次研究使用的全部寡核苷酸由TriLink生物技术公司合成。

利用检测肿瘤DNA内HPV16使用的PCR引物检测血浆或唾液DNA内的HPV16序列。在至少3中独立PCR试验中评估每种唾液DNA或血浆DNA，3种试验必须全部为阳性才可以将样品列为阳性。作为额外特异性质控品，对该PCR产物进行测序确保其代表HPV16序列。为了对血浆和唾液内HPV16序列的数量进行定量，我们利用使用相同引物的数字PCR。还要利用数字PCR对利用引物跨越断点存在易位的序列数量进行定量。为了评估唾液和血浆内的点突变，我们使用Safe-SeqS，一种PCR误差减少技术，检测包含至多3ng输入DNA的反应内低频率突变。根据质量评分选择测序设备生成的高质量序列读数，指示碱基错误响应的可能性。读数的模板特异性部分与参考序列匹配。接着根据合并作为分子条码的唯一识别符序列（UID）将通用模板分子的读数分组。通过命令存在于超过90% UID族（“超级突变体”）读数内的突变，减少样品制备期间或测序步骤期间引入的人为突变。每种血浆或唾液样品的每一项PCR至少独立重复3次，突变等位基因分数定义为总超级突变体数量除以实验内总UID数量。使用源于正常个体的DNA作为对照组，每个查询突变利用至少5项独立试验。只有在血浆或唾液样品中突变体等位基因分时显著超过对照组DNA频率时，样品才能评分为阳性（表S3）。

通过肿瘤位点、阶段和肿瘤HPV相关性计算血液和唾液内检测肿瘤特异性突变的灵敏度。利用费舍尔精密试验检验血浆和/或唾液内肿瘤DNA的检测能力，利用威尔科克森秩和检验比较唾液和血浆内的治疗DNA数量。为了比较Safe-SeqS试验患者和对照组内个体的突变体分数，使用等比例双侧X2检验计算P值，双侧X2检验条件不足时使用费舍尔精密试验计算P值。使用皮尔森积差相关系数，一种线性相关测量标准，计算唾液和血浆内突变体分数的一致性。使用R统计学软件包版本3.1.2执行全部统计学分析。

（摘自Science Translational Medicine，版权归其所有，仅供内部参考）

编译：张凯

审校：胡济梁