HPV疫苗类型抗体多重免疫分析检测的 发展和评估

人乳头瘤病毒（HPV）血清学已经作为终生HPV暴露的测量工具。在HPV疫苗试验中，血清学鉴别首次用于实验的个体，监测疫苗接种和免疫桥性。在缺乏相关免疫防护时，免疫反应的非劣性已经用于评估发生变化的剂量方案和新疫苗配方。

中和试验，如基于中和试验的假病毒颗粒（PBNA），是HPV血清学保护的金标，这种保护被认为源于中和抗体。这些中和试验耗费人力和时间甚巨，所以大部分大型研究使用其他抗体检测试验。由于主要免疫反应是中和表位，这些试验通常与PBNA有关。直接ELSIA[构想完整的L1病毒样颗粒（VLP）作为抗原]和竞争型Luminex免疫分析（cLIA）[一种磁珠液体阵列（Luminex公司，德州奥斯丁）]，cLIA使用与结合试验血清形成竞争的特异类型标记中和单克隆抗体，这2种试验已经用于HPV疫苗试验。测量的抗体反应类型存在固有区别，缺乏标准的试剂，还缺乏统一的方法确立临界值困扰着这些试验之间的比较工作。

现有4类型的疫苗目标多重试验的需求越来越大，作为替代品的9化合价疫苗正在接受审查。使用多重试验可以减少样品量，提高大型试验的产能。这2种应用范围最广的多重试验平台是磁珠液体阵列（Luminex）和电化学发光多点试验。MSD使用了大试验动态范围的电化学发光技术。这些点被印在一个阵列内，阵列的微孔为碳电极多点微孔板。每个点的小区域需要较少的L1-VLP捕获试剂。构象完整的L1-VLP是试验的关键，保存这种关键的试剂能降低产物成本并大量减少所需质量控制（QC）的时间。由于这种试剂直接结合到微孔板，所以，该试验与传统的单定位点ELISA类似，减少了分析物之间的竞争。MSD提供的现有微孔板形式支持在一个微孔内多点定位4、7或10种分析物。该设备不需要射流，因为这种技术基于CCD相机捕获的电化学信号成像，读取速度很快（大约70秒/微孔板）。我们利用MSD平台开发了一种直接L1-VLP ELISA同时检测HPV6、11、16和18，该技术还能执行研究根据再现性、线性范围、检测下限、试剂稳定性和与cLIA（cLIA的人群基于接种疫苗前的美国普通人群）的一致性确认性能。

使用人胚胎肾脏细胞193TT生产HPVL1/L2 VLP，并利用OptiprepTM密度梯度（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO）将其纯化。HPV6、11、16和18的质粒结构源于马里兰州贝塞斯达美国国家癌症研究所的J•Schiller。利用人工重力流琼脂糖胶过滤去除VLP制备中的OptiprepTM。每个VLP部分储存在-80℃的环境中，VLP以小等份的形式储存以便后续的质量分析。利用Coomasie Plus Protein Assay（Thermo Scientific, Waltham, MA）完成蛋白质测定。利用完整VLP上识别构象表位的类型特异性单克隆抗体，测定每部分VLP的质量和完整性。对具有等同于或高于实验室储存VLP的VLP部分，再次进行外形和大小均匀性验证。该验证需要利用透射电子显微镜（TEM）鉴别特殊构象ELISA的反应性，观察其是够等同于或高于实验室储存的参考VLP。完全验证的混合VLP可以用来包被微孔板。

HPV16单一试验用于评估MSD微孔板的类型、阻断缓冲液、抗体包被浓度、第2抗体浓度和培养时间。在室内执行单一微孔板印制。将稀释到磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH7.4）内的1份30ul等分的HPV16添加到正在接受评估的单点微孔板的每个微孔内，并在试验使用前进行4℃隔夜培养。利用已知的质量控制血清，使用2.4章内的方法执行ELISA。将评估标准与阳性、阴性和空白微孔的相对光度单位（RLU）比较。在MSD以7点形式印制的多重微孔板上评估额外参数，参数包括VLP抗原缓冲液（D-磷酸缓冲盐水（DPBS）（ph7.4）+0.5M NaCl存在或不存在OptiprepTM）、20-80ug/ml的VLP包被浓度以及稳定VLP抗原的药物（添加或不添加牛血清白蛋白或专利稳定药物）。HPV6、11、16和18VLP占用4个点，在其余3个点中单独使用PBS-PSA。冷冻VLP等份从-80℃储存处使用干冰送达MSD，并在印制前解冻。专利MSD印制方法包括QC测定点位准确度。微孔板在印制的3-5天内使用冰袋运送至CDC并在实验前储存在4℃的环境中。根据cLIA，16-19剩余个体血清检测卡对4种VLP类型的反应为高、低和阴性，利用这种检测卡通过2.4章的清洗和检测方法评估试验参数。

使用HPV6、11、16和18阳性热灭活混合血清样品作为参考进行确认实验。这种样品根据HPV16国际标准校准（05-134，英国国家生物标准与检定所）测定国际单位（IU）/ml，其他HPV类型使用任意单位/ml（AU/ml）。对不同HPV类型呈高、低和/或阴性反应性的混合样品，作为实验稳定性质控品。源于美国2005和2006年采集广泛接种疫苗前人群（n=1544）样品的剩余血清，已经预先经过cLIA检验，用于2种试验的比较。这些样品的子集（n=100）用于不同微孔板批次的再现性试验，为样品检验测定合适的稀释系列。儿童血清用于测定每种类型RLU的临界值（COV）。

使用试验稀释液[1%ECLTM阻断剂（GE Healthcare Biosciences，Piscataway，NJ 1X PBST（PBS-0.1% Tween 20）]制备连续3.6倍稀释血清，以1:10或1:100以及更高比例开始。每种样品最少进行3次稀释试验。使用自动液体处理工作站（PerkinElmer，Waltham， MA）执行连续稀释。其他全部剩余步骤为人工操作。使用1X PBST 5%ECLTM阻断剂在室温（24℃±2）下封闭微孔板1小时，每个微孔150ul，实验室旋转器设定为650rpm。全部后续培养步骤在37℃的环境中以650rpm的速度振动1小时。在去除阻断剂后，每个微孔添加25ul样品，培养微孔板。使用自动微孔板清洗机（ELx405VRS，Biotek，Winooski，VT）每个微孔使用150ul 1X PBST清洗，每个培养的微孔板4次。添加浓度为1ug/ml的25ul生物素标记小鼠抗人IgG（Fc specific）（Biotrend Chemicals LLC，Destin，FL）到试验稀释液中，接着在随后步骤中添加25ul硫代链霉亲合素标签TM（MSD）（试验稀释液内1:500稀释）到每个微孔内，添加150ul 1X读取缓冲液T（MSD）到每个微孔内，并立即在扇形成像仪6000（MSD）上进行读数（读取时间：70秒/微孔板）。每个点的RLU使用微软Excel表格报告。

将同一微孔的每个VLP点的RLU减去RLU空白计算净RLU。净RLU用于测定动态范围，使用平行线法（PLL）测定抗体浓度，详见WHO HPV Labnet手册。RLU低于COV曲线，不具备PLL条件的样品标为0滴定量。基于1:100稀释儿童血清的RLU测定每个微孔板批次的每个HPV类型的RLU COV。RLU分布非正态和最佳拟合4参数约翰逊苏分布。更加拟合约翰逊苏分布不仅仅是补充两个额外参数，正态分布无法满足更加拟合约翰逊苏分布的需要，如简约度量测定，如Akaike信息标准（AIC）和Bayes信息标准（BIC）。对数正态分布不是这些数据的备用数据，因为一些未暴露的血清，减去背景后，很大比例的血清值<0。除非另行指定，如果数据正常分布，将99th百分位数分布（大约等同于平均RLU+2.33标准差（SD））的RLU用作COV。注明时，99.87百分位数（大约等同于平均RLU+3标准差）的RLU用作备用COV。

接种疫苗个体的高滴定量血清和血浆的连续稀释，从1:10至1:3.14 x106，用于测定3批微孔板净RLU的线性动态范围。最小检测信号基于平均值+3SD超过背景信号，仅在进行给定VLP类型样品稀释时这样处理。最大信号设置在1x106RLU，制造商设计再现信号的上限。

测定2个微孔板批次内可定量抗体浓度试验间变异系数（CV），这2个批次的微孔板使用17-20份血清样品，使用不同的VLP制备物印制，每个微孔板批次经过3次运行测试，计算这2个批次的中值CV。3个微孔板批次，每个微孔板批次运行1次，运行11-22份血清样品，这3个微孔板批次使用不同的VLP制备物印制，通过这样的方法测定逐批试验间变异系数。所有实验由相同的操作员执行。使用23份样品在相同的微孔板上运行一次计算2名操作员的操作员间变异系数。使用相同批次的10-12块微孔板检测1份样品4-6天，计算2名操作员的试验内变异系数。

根据cLIA结果选择几乎未接种疫苗人群的样品，包括对HPV6、11、16和18反应性为高、低和阴性的样品（n=100）。样品在2个微孔板批次上使用不同的稀释比（1:10或1:100）检测。在不同的稀释比和使用不同的微孔板批次试验时，利用Kappa评分评估阳性和阴性结果的一致性。

一个月内在一个微孔板上试验一个包含19个血清样品的样品集一次，相同批次储存在4℃环境中。一批在12个月以后试验，第2批在储存5个月后试验。这些月份的时间基于实验室接收的日期而不是印制的日期。每个月计算抗体水平的平均倍数差异，并与第1次运行的结果比较。

通过检测先前经cLIA检测4454个剩余样品，确认为M4ELISA确立的最终试验参数。M4ELISA试验抗体水平（表示为IU/ml或AU/ml）与cLIA结果（mMUcor/ml或IU/ml）比较。对HPV16而言，1IU/ml=11.8mMU/ml（Personal Communication，PPD）。使用Cohen’s kappa评分以及阳性和阴性一致性百分比评估试验间的定性一致性。执行McNemar试验鉴别最有可能呈抗体阳性的试验。通过限制在类型特异性阳性样品中的类型和试验，计算几何平均浓度（GMC）。除了HPV16外，试验间GMC由于是任意单位不能比较。对HPV16而言，GMC比较限制在cLIA和M4ELISA的样品阳性之间。计算所有样品的所有试验间一致性的可定量浓度的Spearman相关性。使用SPSS 21.0版软件（IBM，NY）和GraphPad Prism 5.0版（La Jolla，CA）执行所有统计分析。使用R程序内的ggplot2建立相关性图表。仅作为制图目的，全部低于cLIA检测限的值，HPV6、11和18指定为5，HPV16指定为0.5。

表1总结了评估和选择的作为最终试验条件的条件集合。试验的动态范围是1000倍，该范围经过每个HPV类型高滴定量疫苗接种血清样品7个稀释步骤的线性反应证明（图1）。该范围与3个印制的微孔板批次一致，具有仅包含样品稀释液微孔的检测下限，范围350-650RLU，该范围取决于微孔板批次。

a专利属于MSD

图1：M4ELISA HPV6、11、16和18的动态范围

不计微孔板和试剂批次，全部VLP类型中值试验间变异性低于20%。图2显示的是1个微孔板批次内测量的抗体浓度范围之间的试验间CV。相同微孔板批次内的试验间变异性为：HPV6（8.7%）、HPV11（8.9%）、HPV16（7.5%）和HPV18（15.8%）（图2A）。同一VLP制备物2个微孔板批次间变异性为：HPV6（12.8%）、HPV11（10.3%）、HPV16（8.3%）和HPV18（7.9%）（图2B）。不同VLP制备物3个微孔板批次之间的变异性略高：HPV6（15.8%）、HPV11（14.5%）、HPV16（16.9%）和HPV18（17.4%）（图2C）。操作员1的试验间变异性为2.9%-4.8%；操作员2为3.5%-6.7%。操作员间的变异性不是广泛评估，但是4个类型的中值CV范围为5.5%-13.8%。

图2. 变异系数A-微孔板批次内（2个微孔板批次，每个微孔板批次3次运行17-20个血清样品）；B逐批CV（在相同VLP制备物印制的3个微孔板批次上，每个微孔板批次运行一次检测11-22个血清样品）；C逐批CV（不同VLP制备物印制的3个微孔板批次上，每批微孔板运行一次检测11-22个样品）。

5个月后4℃环境储存期间2个评估的微孔板批次，HPV的抗体水平变化低于2倍。储存超过12个月批次的评估，HPV6、11和16水平保持稳定，但是HPV18的结果在5个月后发生了变化（图3）。

图3. 4℃环境储存12个月后印制试验微孔板的稳定性

2个微孔板批次以1:10和1:100开始稀释的被测样品之间的抗体水平定量相关性为HPV 6、11和16，r2>0.90；HPV 18 r2>0.87。每个类型2个批次的kappa定性一致性评分为0.8-0.9，即使使用不同的开始稀释比检测的批间差异也不显著（McNemar所有批次P值>0.6）。M4ELSIA的类型特异性通过检测HPV16的国际标准和HPV18备用国际标准确定，仅各自类型为阳性，其他3个类型为阴性。

4个类型试验间的总体一致性范围是86.3%-91.5%。2个试验的阳性百分比一致性范围是41.1%-61.7%。kappa统计显示试验间的一致性低，HPV18的最低评分（k=0.38）（表2）。

表2 M4ELSIA和竞争型Luminex 试验（cLIA）的一致性统计

cLIA和M4ELISA的HPV16抗体最大浓度为141.5和142.8IU/ml。一致样品计算的HPV16 GMC没有显著区别（6.2IU/ml cLIA [95% CI 5.7-6.8] vs 6.7 IU/mlMSD [95% CI 5.8–7.7] （p=0.23）。HPV16 GMC在2倍范围内，如果每个试验包括全部阳性样品：cLIA阳性（n =401），5.7 IU/ml [95% CI 5.2–6.2 IU/ml]；M4ELISA阳性（n= 796）2.6 IU/ml [95% CI 2.4–2.9 IU/ml]。全部样品的抗体水平相关性为HPV6，P=0.53；HPV11，P=0.37；HPV16，P=0.46；HPV18，P=0.34（图4）。每个试验的一致样品，相关性HPV6，P=0.59；HPV11，P=0.56；HPV16，P=0.62；HPV18，P=0.69。

如表2所述，M4ELSIA血清学阳性反应的样品比cLIA多（HPV6-22.9% vs 12.8%；HPV11-11.6% vs4.5%；HPV16-17.8% vs 9.0%；HPV18-11.1% vs 3.3%；p-value<0.001全部样品）。cLIA阴性M4ELISA阳性的比例11.8%，HPV6；7.8%，HPV11；10.0%，HPV16和8.2%，HPV18；cLIA阳性M4ELSIA阴性的比例1.8%，HPV6；0.7，HPV11；1.2%，HPV16和0.3%，HPV18（McNemar’s p<0.000001全部类型）。

升高M4ELISA的RLU COV到99.87百分位数，所有类型一致性升高到k=0.6-0.7。阳性百分比一致性为72.1%，HPV6；64.4%，HPV11；68.3%，HPV16；65.2% ，HPV18。Mcnemar的类型差异表明M4ELISA的HPV11和18比cLIA的阳性率更高，p<0.002；但是HPV6，p=0.34；HPV16，P=0.07。cLIA阴性M4ELSISA阳性样品的比例下降，3.3%，HPV6；2.2%，HPV11；3.3%， HPV16；1.6%，HPV18。

该报告叙述了基于传统直接L1-VLP ELISA微孔板形式的多重ELSIA，利用具有多点印制功能的MSD电化学发光平台，同时检测4种4价HPV疫苗接种HPV类型，HPV6、HPV11、HPV16和HPV18的抗体反应。M4ELSIA每种类型的动态范围很大（~1000倍），背景干扰低，微孔板读取时间70秒。通过中值逐批CV测量或不同VLP制备物测量，全部4种类型的试验间变异性低于20%，该值多重试验的限值在可接受范围内。我们利用未接种疫苗人群的cLIA结果验证类型特异性并提供与M4ELISA的总体比较，认识到：由于设计原因，M4ELISA和cLIA不可能完全一致。ELISA检测VLP上结合到所有表位的IgG，包括中和和非中和表位；cLIA检测结合到任一表位的Ig类抗体。M4ELISA在HPV6和HPV16方面与cLIA的一致性适中（分别为k=0.54和0.53），HPV11和HPV18差异明显（分别为k=0.44和0.38）。就全部类型而言，M4ELISA检测的阳性样品是cLIA的2-3倍，影响了试验间一致性和相关性。这些结果和其他比较VLP-ELISA和未接种疫苗人群cLIA的研究观测到的结果类似，k的范围是0.29-0.66。大部分的有差异结果接近M4ELISA的检测下限。将M4ELISA的RLU COV从99百分位数提高到99.87百分位数（等同于+3SD）改进了总体阳性一致性，并导致了2项试验4种HPV类型出现类似的血清学阳性反应率。Safaeian等人观测到了类似结果，通过较高的ELSIA COV，HPV16 VLP-ELISA和cLIA的阳性百分比一致性从49%提高到78%，从而支持了两种试验形式的比较。

HPV血清学临界值的测定和真阴性测定一样困难，使临界值计算方法产生了诸多变化。使用成人血清通过临床灵敏度/特异性算法测定cLIA临界值，以灵敏度为代价取得了高特异性。但是我们相信儿童血清的99%的RLU限值能更好地反应M4ELSIA在检测自然暴露抗体方面的能力。

图4. M4ELISA和cLIA全部样品抗体水平相关性

MSD多点微孔的设计降低了背景噪音，每个点形成各自的回路，测量结合到点的电化学发光信号，而不是结合到微孔壁的信号。分离结合表面也能减少抗体和检测试剂之间的竞争。低背景干扰有助于改善自然感染人群的抗体反应检测，这一人群的抗体水平介于cLIA和M4ELSIA之间，每种类型的水平适中，范围介于0.34-0.53之间。对于HPV16和HPV18，cLIA和另一个未接种疫苗人群ELSIA平台报告了类似的相关性。在高抗体水平环境中，这两项试验的区别，如接种疫苗之后，可以预见这种区别更小。HPV16是一个例外，直接比较试验间的GMT不可行。cLIA和M4ELISA之间HPV16最大抗体浓度一致（分别为141.5和142.8IU/ml）。HPV16一致样品的GMT也类似（6.2和6.7IU/ml）。由于该人群大多数未接种疫苗，因此仅仅测量了自然暴露反应。在其他报告中，接种疫苗后的GMT显著高于自然感染者的GMT。直接比较试验间HPV16的能力强调了将国际标准与HPV血清学试验相结合的重要性。

可以认识到VLP产物的质量控制是保持反应类型特异性的关键。我们的结果（数据未显示）表明OptiprepTM Gradient培养基中的VLP可以用于包被单一MSD微孔板，但是会导致7点MSD微孔板内抗原印制不一致。移除OptiprepTM可以实现抗原印制一致性。我们假设粘性OptiprepTM培养基能干扰设计用于为每个点输送超低量（纳升范围）液体的自动输送线。在测定点位时出现罕见的、独立于HPV类型的随机不规则行为，这种行为可以在每个微孔板批次中1/3的样品稀释中检测到，微孔中仅有一个点显示出低RLU。当这种情况发生时，需要重新检测。

大多数公布的L1-VLP ELISA必须在使用前对微孔板进行准备。多点印制需要将抗体运送到制造商处进行印制。因此抗体需要保持稳定达一周时间才能让试验供研究使用，但是大型人群检测使用单一试剂最为理想。因此确认MSD印制微孔板的稳定性十分重要。将BSA与80ug/ml浓度的VLP相结合，在微孔板上利用相同VLP制备物，可以让抗体实现长达12个月的稳定检测。BSA对蛋白质和酶的稳定效果已经显而易见，但是机制仍不明确。通常认为是BSA加强了蛋白质的疏水作用，因此避免了蛋白质的变性。

此次研究是第1次HPV6和HPV11的ELSIA和cLIA比较研究，使用2个平台对自然暴露抗体反应进行了评估。我们已经了解到多重M4ELISA可再现，灵敏度高，能够提高检验效能。该试验的优势包括抗原需求量低、读取速度快，与液体阵列平台相比简化了扫描仪维护。多孔MSD微孔板包括10孔型，表明现有试验能够扩展将需要检测对9价HPV疫苗抗体反应的额外HPV类型包括在内。该试验也具有局限性，如抗原需要厂商印制，微孔板使用前需要储存，会出现更多的重复试验等。一些因素如试验间操作员变异性以及一个抗体浓度范围内的试验内变异性等也需要进一步评估。

（摘自Journal of Immunological Methods，版权归其所有，仅供内部参考）

编译：张凯

审校：王小茜