计量学溯源性与室间质量评价
作者：张传宝 汪静 闫颖
计量溯源性（metrological traceability）是实现检验结果准确可比的前提条件，也是国际间相互承认测量结果的前提条件，中国合格评定国家认可委员会（CNAS）将计量溯源性视为测量结果有效性的基础，并确保获认可的测量活动的计量溯源性满足国际规范的要求[1]。在产品注册检验中，校准品定值的计量溯源性已经成为明确的要求。
一、计量溯源性及其实现
计量溯源性的定义来源于ISO/IEC指南99：《国际计量学词汇—基础和通用概念及相关术语（VIM）》，即通过文件规定的不间断的校准链，将测量结果与参照对象联系起来的测量结果的特性，校准链中的每项校准均会引入测量不确定度【VIM 2.4.1】。用于将测量结果与参照对象联系起来的测量标准和校准的次序，则被称之为计量校准链（metrological traceability chain）【VIM2.4.2】，简称为溯源链[2]。计量溯源链的理想终点是定义到国际单位制（SI）的相关单位，但对于某一指定值，程序的选择和计量溯源链的最终水平取决于是否有较高等级的测量程序和校准品。目前很多情况下，生产商选定的测量程序或工作校准品为计量溯源性的最高等级。因此，在有国际公认的参考测量程序和/或校准品可用之前，测量的正确度取决于其校准等级水平[3]。
在JJF 1001-2011中，国际单位制（international system of units，SI）【VIM 1.16】是指由国际计量大会（CGPM）批准采用的基于国际量值的单位制，包括单位名称和符合、词头名称和符号及其使用规则。其基本量和相应的基本单位分别为：长度（米）、质量（千克）、时间（秒）、电流（安培）、热力学温度（开尔文）、物质的量（摩尔）、发光强度（坎德拉）[2]。
目前，常规医学检验定量项目大约有400到700个，其中多数临床检验项目因被测物质（主要是生物大分子类物质）的复杂性（如混合物、异构体等），其一级参考测量过程的建立和一级参考物质的制备非常困难，其量值溯源只能停止在较低水平，如为产品校准品定值的（参考）测量程序等级，或测量程序和（参考）校准品二个等级。在ISO/DIS 17511：2009（E）中，根据计量学溯源至SI的可能性及测量程序和校准品的不同计量水平的可获得性，可将检验项目确定为以下6种典型的计量学溯源链。
1. 测量结果可以在计量上溯源至SI单位。（1）有可用的一级参考测量程序和一种或多种（经认定的）一级参考物质（用作校准品）。这样的检验项目有大约有25到30个，电解质类物质（如钾、钠、氯、镁、钙、锂离子等）、代谢物类物质（如胆固醇、甘油三酯、葡萄糖、肌肝、尿酸、尿素等）和某些甾体类激素及甲状腺激素。这些项目虽占的数目不大，却是临床检验常规项目的主要组成部分；（2）无一级校准品，但有用于定义待测物的参考测量程序。如酶类的催化活性测定等；（3）有一级参考物质和参考测量程序，待测物是由参考测量程序定义的。这种情况下，参考测量程序测定的是被测量的一个片段或者组分，而非整个分子结果。最典型的例子是IFCC 测定糖化血红蛋白参考方法。
2. 测量结果计量学不能溯源至SI单位。（1）有国际约定校准物（非一级校准物）可用于定义待测物，并遵从ISO15194，无参考测量程序；（2）有国际一致化程序支持的计量溯源性，无国际约定校准物或约定参考测量程序；（3）待测物溯源到生产商内部定义/专有参考物质，无一级校准品或参考程序。
计量溯源性的目的，应是使经校准的常规测量程序所得的结果，表示为按现有校准等级高水平所得值的方式。应在开始进行终测量前建立计量溯源性链，并以校准等级下降的相反方向，即从计量高参考到终用户结果进行描述。本文仅列出第一种情况的校准溯源链，见图1；其他类型的校准溯源链，可参考ISO/DIS 17511：2019（E），没有条件的可参见CNAS-GL18量值溯源要求在医学测量领域的实施指南（等同ISO 17511：2003）。
图1. 溯源至SI单位的完整溯源图
根据被测量的类型和特点，建立合适的校准溯源链，尽可能的将最高等级的测量程序和参考物质的量值，通过从上到下逐级的校准，传递到产品校准中上，是IVD厂商实现计量溯源性的任务。在这一过程中，厂家需要合理评估不确定度，尽量消除校准偏倚，以满足每个项目的分析质量要求为目标，校准品的不确定度应小于目标不确定的1/2为宜。需要注意的是，计量溯源性是检验结果准确的必要条件，而非充分条件。正如VIM 2.41在计量溯源性定义的注5指出的：测量结果的计量溯源性不能保证其测量不确定度满足给定的目的，也不能保证不发生错误。
二、常规测量过程的特异性和参考物质的互通性问题
陈文祥研究员在《临床检验的量值溯源问题》[4]中，对这一部分的内容作了很重要的阐述，引用如下：常规测量过程的特异性及其校准物质或用于常规测量过程校准及质量控制的参考物质的互通性（或称“互换性”）是临床检验计量学溯源性的两个重要问题。常规测量过程特异，测量量与参考测量过程测量量完全一致，是实现计量溯源性的前提。然而，由于临床检验被测物质的复杂性，许多常规测量过程，尤其是利用免疫学原理的测量过程，做到真正意义上的特异非常困难（如不同测量过程作用于同一被测物质的不同抗原决定位点，可能给出不同测量结果）。还有些常规测量过程甚至还作用于被测物质以外的其它物质，其特异性问题则更为严重。在这种情况下，仅通过不同校准物质或参考物质逐级溯源显然不能提高测量的准确性。
临床检验参考物质或校准物质的互通性，指用不同测量过程测量该物质时，各测量过程测量结果之间的数字关系，与用这些测量过程测量实际临床样品时测量结果的数字关系的一致程度，亦即该物质理化性质与实际临床样品的接近程度。参考物质，虽然一般采用与实际样品相同的物质作原料，但出于对被测物质浓度的要求、贮存、运输等方面的原因，往往需对原料成分进行调整并作处理(如冻干、冰冻等)。这些经加工的材料在某些测量过程中的行为有时会不同于实际临床样品，这种差异有时称基质效应，更确切的描述是缺乏互通性。缺乏互通性是各种临床检验质量保证中的常见问题。值得指出的是，互通性问题的存在，不应是参考物质单方面的原因，认识和解决互通性问题需从参考物质和测量过程两方面入手。使参考物质与实际样品尽量接近是必要的，但对基质过分敏感的测量过程一般不是好的测量过程，尤其是对于小分子化合物的分析。然而，某些参考物质对于某些常规测量过程缺乏互通性，目前仍然是客观存在，在利用参考物质进行量值溯源时需首先鉴定参考物质的互通性，鉴定的方法一般是用参考方法和常规方法同时分析参考物质和实际新鲜样品。若存在互通性问题，需进行修正，或改用无基质效应的参考物质。
参考物质的互通性评价通常需要两种以上的测量程序、多份临床病人样本、待评价的参考物质。如果用参考测量程序作为比对方法，其评价过程可参考我国卫生行业标准WS/T 4356-2011《基质效应与互通性评估指南》；如果采用多种常规测量程序进行评价，其评价方法和数据处理可以参考CLSI EP14-A3（Evaluation of Commutability of Processed Sample；Approved Guideline-Third Edition）[5]或者EP30-A（Characterization and Qualification of Commutable Reference Materials for Laboratory Medicine；Approved Guidline）[6]。
三、计量溯源性的确认
鉴于上述特异性和基质效应问题及其它质量问题（线性、灵敏度等）的可能存在，临床检验计量学溯源性均需最后确认其有效性。确认方法是用参考测量过程和常规测量过程同时分析足够数量的、有代表性的、分别取自不同个体的实际新鲜样品，将每个样品一分为二，分别用参考方法和常规方法进行分析测定，可用线性回归进行结果判断。若两方法结果一致（在一定置信水平下斜率与“1”及截距与“0”无显著差异），常规方法的结果的溯源性得以验证或确认，如图2-a所示；如果两个方法结果不一致，可能会有不同情况，一种情况是两种方法结果关系密切，无明显截距，但是斜率与“1”的偏离不能接受，如图2-b，此种情况说明常规方法有足够的特异性，但存在校准偏差，可通过调整校准使常规方法结果准确；另一种情况可以是，两种方法结果的关系过于分散，此种情况的出现往往是由于常规方法存在特异性问题，如图2-c。当然常规方法的特异性问题还会有其他表现，如两种方法间存在明显的截距等。常规方法测量范围不足也会在与参考方法对比中得以发现。两方法的比较，除用上述线性回归方法外，还可以用其它统计方法，如用两种方法结果之差对浓度作图等，如图2-d所示。
四、计量溯源性的验证与室间质量评价
对于绝大多数临床实验室，受参考测量过程不易获得、成本高昂、效率较低等因素的影响，上述确认方法在绝大多数实验室很难实现。而且，对于临床实验室来说，也的确不需要进行如此复杂的确认实验，而是进行相当简便的（正确度）验证实验即可。正确度验证实验在实际操作上，可以分为方法比对和测定定值参考物质两种方式，下文主要对测定定值参考物质进行叙述。
定值参考物质的来源，比较公认的定值参考物质包括：具有互通性的国际、国家有证标准物质；具有互通性的正确度验证物质（标准物质、正确度验证室间质量评价材料、厂家提供的正确度验证质控物）等，这些在CLSI EP15-A2[7]、CLSI EP15-A3[8]、CNAS-GL37[9]、WS/T 492-2016[10]等文件中是一致的。除此以外，对于非正确度验证的室间质量评价材料是否可用于常规方法的正确度验证呢？我国定量生化检验室间质量评价主要分为如下几类：
1. 使用具有互通性的质控品，参加实验室多次重复测定样品，质控品的靶值通过参考方法确定。例如我中心的脂类、酶学、电解质、总蛋白及代谢物、糖化血红蛋白正确度验证计划。
2. 使用具有互通性的样本，实验室单次测定，质控品靶值通过参考方法确定。例如我中心的糖化血红蛋白室间质量评价计划。
3. 采用可能具有基质效应的商品或者自制质控品，实验室单次测定，靶值采用参加者公议值（分组后的中位数或者平均值），这是最常见的一类室间质评计划，是国内为普遍采用的室间质评方式。上述第一类和第二类计划，都可用来评价参加实验室的正确度，验证其计量溯源性。毋庸置疑，这两类计划的样本是可以提供给临床实验室正确度验证。对于第三类计划的样本，能否用作正确度验证呢？在CNAS-GL37、WS/T 492-2016均未推荐用常规室间质评计划做正确度验证；而在CLSI EP15-A2、CLSI EP15-A3均提到，此类室间质量评价计划的样品可以用作正确度验证，其作用在于验证实验室与参加EQA的同组（peer group）实验室结果的一致性，这个同组可能是使用相同的（封闭）系统（如内分泌、肿瘤标志物、心肌标志物等EQA）、相同的试剂（如常规化学EQA）等，而产品的计量溯源性由生产厂家负责实施及确认。使用这类质控品的条件是：组内实验室足够多（至少大于20家）、组内SD应足够小（定值的不确定小、结果更可靠）；缺点包括：由于基质效应的影响，即便采用相同的系统，也可能因为试剂批号或\和校准物的批号不一致，对测定结果带来偏差，影响正确度验证结果的判断。在我国，开发系统特别普遍的情况下，常规化学采用的试剂厂家分组进行统计，不可避免会引入质控品基质效应带来的偏差，对结果的判断带来影响。鉴于此，常规室间质量评价的样本，只能作为备选项，在其他方式不和获取的情况下采用。
室间质量评价结果，能不能用做正确度验证？在CNAS-CL38《医学实验室质量和能力认可准则在临床化学检验领域的应用说明》5.6.3中，这样叙述[11]：使用配套分析系统时，可使用制造商的溯源性文件，并制定适宜的正确度验证计划；使用非配套分析系统时，实验室应采用有证参考物质、正确度控制品等进行正确度验证或与经确认的参考方法（参考实验室）进行结果比对以证明实验室检验结果的正确度，如以上方式无法实现，可通过以下方式提供实验室检测结果可信度的证明：参加适宜的能力验证/室间质评，且在最近一个完整的周期内成绩合格；……
五、全国临床生化正确度验证室间质量评价计划
我中心2010年开展小分子代谢物正确度验证计划、脂类正确度验证计划，2012年开展了酶学正确度验证计划和糖化血红蛋白正确度验证计划，2014年开展电解质正确度验证计划。这些正确度验证室间质量评价计划和常规EQA计划的区别主要在于：（1）采用新鲜冰冻样本（血清或全血），不存在基质效应（具有互通性）；（2）样本测定采用批内多次重复、在不同天内多批测定方式，不同于常规EQA的单次测定方式；（3） 采用参考方法测定值作为靶值，其结果可溯源至SI单位，而非采用参加实验室的公议值为靶值; （4） 评价标准也和常规EQA不同。由此可见，正确度验证计划的两个必备条件是：1）具备可准确定值的参考方法；2）使用互通性的样品。
1. 样本：正确度验证室间质量评价计划的样本力求与临床分析标本一致，但是考虑到运输过程，我们采用国际通用的新鲜冰冻样本：1）新鲜冰冻血清：下列正确度验证计划采用新鲜冰冻血清：总蛋白及代谢物（TP、Glu、Crea、Urea、UA）、电解质（K、Na、Ca、Mg、Cl）、酶学（ALT、AST、ALP、AMY、CK、GGT、LDH）、脂类（TC、TG、HDL-C）；2）新鲜冰冻全血：糖化血红蛋白（HbA1c）。
为保持样本中分析物的稳定性，正确度验证计划采用干冰（固态二氧化碳，-60℃）运输。以2018年全国电解质正确度验证计划为例：2018年3月初将两个浓度各3只样本使用CO2干冰运送到参加实验室，实验室收到样本后保存在-70℃或者20℃冰箱中。实验室分别于3月30日、4月6日和4月13日取每个浓度水平各1只在一个实验批次内重复测定5次；于4月20日一次性将所有测定结果通过网络进行上报。
2. 靶值（指定值）确定及合格评定：不同于常规室间质量评价（能力验证）计划通常采用参加者公议值（平均值和中位数）作为靶值（指定值）的做法，正确度验证室间质量评价计划的靶值采用参考实验室或者参考实验室网络（酶学）进行确定。目前全国正确度验证计划靶值确定方法包括同位素稀释液相色谱串联质谱法（TC、TG、Glu、Crea、UA、HbA1c）、同位素稀释气相色谱串联质谱法（Urea）、超速离心色谱法（HDL-C）、同位素稀释电感耦合等离子体法（K、Na、Ca、Mg）、离子色谱法（Cl）、分光光度法（TP、ALT、AST、ALP、AMY、CK、GGT、LDH）等，测定结果可溯源至SI（国际单位制）单位。
在检验结果上报后，计算各参评实验室测定结果的平均值与靶值间的相对偏差，作为实验室测定偏倚，与允许偏倚标准进行比较，用于评价实验室正确度是否满足要求。采用的评价标准包括WS/T 403-2012《临床化学检验常规项目分析质量指标》或其他标准，具体可参考我中心每年寄送的《临床检验室间质量评价计划》中的《评价标准》章节。
3. 报告：正确度验证室间质量评价计划的报告分为数据和图形两个部分，数据报告如图3所示，每列数据的意义如框图所示。图形报告如图4所示，图形中按照某一批号样本测定结果的相对偏倚，从负到正（从小到大）画出每个实验室结果的棒图。上下红线为该样本偏倚合格范围，图中红点表示用户实验室所在位置，并标出该实验室编码。
图3. 正确度验证室间质量评价计划数据报告
图4. 正确度验证室间质量评价计划图形报告
4. 不合格的处理：正确度验证的目的在于通过评价测定方法的偏倚是否符合标准，从而验证方法正确度及计量溯源性。正常情况下，测定方法的精密度对该计划结果的影响较小，正确度验证计划成绩不合格表明测定方法存在系统误差，实验室应从消除系统误差因素着手进行改进，特别是校准品的配套问题。
需说明的是，采用具有互通性的样本并利用参考方法确定靶值是最理想的室间质评方式，但现阶段还存在较多的限制，比如具有互通性的样本来源、参考方法资源及运输成本等因素，故正确度验证计划还只能是常规EQA的补充，尚无法完全替代常规EQA。
参考文献
CNAS-CL06 测量结果的溯源性要求
中华人民共和国国家计量技术规范JJF 1001-2001通用计量术语及定义
CNAS-GL18量值溯源要求 在医学测量领域的实施指南
陈文祥、申子瑜、王抒、董军、李健斋. 临床检验的量值溯源问题，中华医学检验杂志，2003,26(3): 153-18
Clinical and laboratory standards institute(CLSI). Evaluation of commutability of processed samples; approved guideline-third edition. CLSI document EP14-A3.ISBN 1-56238-972-6. 2014
Clinical and laboratory standards institute(CLSI).characterization and qualification of commutable reference material for laboratory medicine; approved guidelin. CLSI document EP30-A.ISBN 1-56238-726-X. 2010
Clinical and laboratory standards institute(CLSI). User verification of performance for precision and trueness; approved guideline-second edition. CLSI document EP15-A2.ISBN 1-56238-574-7. 2005
Clinical and laboratory standards institute(CLSI). User verification of performance for precision and estimation of bias; approved guideline-third edition. CLSI document EP15-A3.ISBN 1-56238-966-1. 2014
CNAS-CL37《临床化学定量检验程序性能证指南》
WS/T 492-2016 临床检验定量测定项目精密度与正确度性能验证
CNAS-CL38《医学实验室质量和能力认可准则在临床化学检验领域的应用说明》
