外周血淋巴细胞亚群及细胞因子与自身免疫性肝病和幽门螺旋杆菌感染的相关性
作者：吕金明 王亚磊 彭新国 尹洪民
【摘要】目的：研究外周血T淋巴细胞及细胞因子与幽门螺旋杆菌（HP）感染和自身免疫性肝病（AILD）的相关性。方法：连续选择入我院首次诊断为AILD患者共60例，采用13C尿素呼气试验（13C-UBT）检测HP感染；流式细胞术法检测外周血中T淋巴细胞亚群百分含量；全自动生化分析仪检测肝功能指标，包括谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）和谷氨酰转肽酶（GGT）水平；ELISA法检测血清细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-10和TNF-α水平。结果：共检出HP阳性37例（61.67%），HP阳性感染患者外周血中CD3+、CD3+ CD8+淋巴细胞百分含量明显低于HP阴性者，差异有统计学意义（P＜0.05）。HP阳性感染患者的ALT、AST、ALP和GGT水平与HP阴性者比较无差异（P＞0.05）。HP阳性感染患者的IFN-γ、IL-6、IL-10和TNF-α水平明显高于HP阴性者，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：自身免疫性肝病患者幽门螺旋杆菌感染阳性率较高，与其T淋巴细胞亚群百分含量降低和细胞因子水平升高密切相关。
自身免疫性肝病（AILD）主要由于机体免疫系统过度激活，导致肝脏炎症反应、肝细胞、胆管坏死等一系列慢性、进展性肝脏疾病[1]。分为原发性胆汁性肝硬化（PBC）、自身免性肝炎（AIH）和原发性硬化性胆管炎（PSC）三种，与微生物感染、生物异源性物质、营养不良、疫苗接种、紫外线照射以及环境因素等密切相关[2]。随着生物化学、免疫学及组织病理学等检测技术的进步，AILD的检出和诊断率逐渐提高。幽门螺杆菌（Hp）是定植于胃和十二指肠的革兰阴性杆菌，Hp感染是导致消化性溃疡的主要因素[3]。此外，Hp也可以在肝脏、肾脏等部位存在，可能与AILD的发生有关[4]。T细胞在维持体内免疫环境稳态与阻止自身免疫性反应中发挥重要的作用[5]。本研究旨在分析外周血中T淋巴细胞亚群及细胞因子含量在Hp感染和AILD的相关性，为AILD的临床诊疗提供新思路。
一、研究对象与方法
1. 研究对象：连续选择2018年01月至2018年12月入我院首次诊断为AILD患者共60例，其中PBC诊断参考2009年美国肝病学会（AASLD）标准，AIH诊断参考2010年AASLD标准，PSC诊断参考Mayer标准。排除自身免疫性疾病、肝癌、病毒性肝炎、酒精性肝炎、萎缩性胃炎、胃溃疡、妊娠及哺乳期妇女。其中男性39例，女性21例，年龄45~78岁，平均（58.7±13.6）岁。
2. 研究方法：采用13C尿素呼气试验（13C-UBT）检测HP感染，流式细胞术法检测外周血中T淋巴细胞百分含量；全自动生化分析仪检测肝功能指标，包括谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）和谷氨酰转肽酶（GGT）水平；ELISA法检测血清细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-10和TNF-α水平。
（1）13C-UBT方法：受试者清晨空腹（禁食8h，禁饮4h），正常呼吸，防倒流的气体导管插入CO2集气瓶瓶中，缓慢呼气4~5s（严禁倒吸，避免液体溅出），拔出导管，加入稀释闪烁液，迅速拧紧，为0min呼气。用少量凉水（20ml）送服1粒13C颗粒，静坐30min后，按上述方法收集呼吸气。采用北京华恒安邦科技有限公司提供的HG-IRIS200型13C红外光谱仪和北京勃然制药有限公司提供的13CO2试剂盒进行检测，以13C计数（30min/0min）≥4为阳性，＜4为阴性。
（2）流式细胞术：流式细胞术（FCM）检测淋巴细胞亚群数量：空腹抽取受试者2ml外周血，EDTA-Na2作为抗凝剂。加淋巴细胞分离液用密度梯度离心法分离单个核细胞层。用适当的RPMI 1640培养基将单个核细胞再悬浮并计数。调节培养基用量，使细胞浓度约为2×106/ml。在流式细胞术专用EP管中加100ul细胞悬液，加20ul对应的一组荧光标记单克隆抗体，吸吹混匀，室温避光反应30min，加1ml Hanks液500/min离心8min后洗涤一次，再加1ml Hanks液充分混匀，应用FCM上机检测10000个细胞，应用bd diva软件分析淋巴细胞的百分含量。
（3）ELISA法：根据试剂盒说明书进行标本稀释及加样：将试剂盒恢复到室温，空腹抽取受试者2 ml外周血进行血清分离，血清稀释后加到反应区孔内，同时加到反应区孔内不同浓度的细胞因子，制定标准曲线；温育及洗板：加样板的凹槽里，盖上生物薄片，室温（20℃）孵育30min后，用缓冲液冲洗，加入100μl的细胞因子酶标抗体，室温（20℃）温育30min，冲洗；显色与终止反应：在反应空内加入显色剂，室温反应15min后加终止液终止反应；用酶标仪进行浓度检测后换算出相应细胞因子的浓度。试剂盒购自sigma公司, St. Louis,MO,USA。
3. 统计学方法：采用SPSS20.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，计数资料以例数或%表示，组间比较用χ2检验；P＜0.05认为差异有统计学意义。
二、研究结果
1. HP阳性率分析：共检出HP阳性37例（61.67%），阳性感染者的HP比值为4.1~7.6，平均（5.8±1.3）。
2. 受试者T淋巴细胞亚群分化抗原的比较：HP阴性感染患者的CD3+、CD3+CD8+细胞明显高于HP阳性者，差异有统计学意义（P＜0.05）。CD3+CD4+细胞、CD4+/CD8+细胞比值，HP阳性感染患者与HP阴性者差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。
3. 肝功能指标水平比较：HP阳性感染患者的ALT、AST、ALP和GGT水平与HP阴性者比较无差异（P＞0.05）。见表2。
4. IFN-γ、IL-6、IL-10和TNF-α水平比较：HP阳性感染患者的IFN-γ、IL-6、IL-10和TNF-α水平明显高于HP阴性者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。
三、讨 论
AILD可通过肝功能检查进行初步诊断，ALT和AST大幅升高，提示肝细胞受损较重，但是常规指标很难把AILD与病毒性肝炎鉴别出来，误诊或漏诊率较高，导致AILD患者长期无法治愈，严重影响预后[6]。AILD患者免疫耐受机制丧失，诱导T淋巴细胞介导的肝脏靶抗原损伤等[7]。HP含有一些细胞毒素相关蛋白，最重要的一种毒力蛋白因子就是-cagA[8]。当观察到疾病患者的HP呈阳性时，其浓度可能会增加，大量的cagA可能会相应地转移到胃粘膜上皮细胞。细胞下游的信号通路因此被激活，导致感染症状加重，从而诱导细胞免疫反应[9]。当病人处于一定的免疫耐受状态时，其防御能力会降低。因此，很容易导致内毒素血症，导致肝脏炎症损伤[10]。
AILD患者中与HP阴性感染患者相比，HP阳性感染患者外周血中总的T淋巴细胞特征性标志的CD3+淋巴细胞、CD3+CD8+淋巴细胞的含量明显减少（p＜0.01），而CD3+CD4+淋巴细胞的含量和CD4+/CD8+淋巴细胞比值，差异无统计学意义（p＞0.05），CD4+是辅助性T淋巴细胞的重要表面标志，通过识别并结合MHCⅡ类分子分泌细胞因子，并协助其它细胞参与免疫应答。据报道，HP感染后，可引起人体免疫功能紊乱，血浆炎性介质被大量释放，加重炎症，导致肝组织损伤，与自身抗体发生反应形成免疫复合物，进而造成免疫性肝病[11-12]。HP感染可增加肝细胞坏死或凋亡发生，使淋巴细胞浸润到肝内胆管，加速发生肝硬化[13-14]。
通过该研究得出AILD患者中HP阳性率为61.67%，并且HP阳性感染患者血液中的IFN-γ、IL-6、IL-10和TNF-α含量明显高于HP阴性者，差异有统计学意义（P＜0.05），提示，自身免疫性肝病患者幽门螺旋杆菌感染阳性率较高，与多种免疫性抗体阳性和细胞因子水平升高密切相关。通过对HP的早期检测和干预可提高AILD的诊断准确率和临床治疗效果。然而，上述结果在大样本临床环境下仍需进一步确认，以获得具体结论。
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