患者外周血LncRNA检测在胃癌诊断中的临床价值

作者：线海鹏  赵晓涛

单位：北京大学人民医院检验科

【摘要】长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是长度超过200个核苷酸的不“翻译”为蛋白质的RNA。在胃癌的发生发展过程中，有多种LncRNA表达量有显著变化，如HOTAIR、H19、LINC00152、MEG3、GAS5等。LncRNA在胃癌中的异常表达与胃癌的发病机制、临床诊断以及预后等有着密切的联系。本文旨在通过总结近年来外周血LncRNA在全球第二大致死肿瘤-胃癌领域的相关研究，为外周血LncRNA作为非侵袭性的胃癌诊断及预后标志物提供新的思路。

目前研究显示，超过90%的人类基因组转录为RNA，然而只有1.5%-2.0%人类基因组编码蛋白，转录但不翻译为蛋白质的称为非编码RNA（Non-coding RNA，ncRNA）^[1]。LncRNA是指转录本长度大于200bp，但不具有编码蛋白质功能的长链非编码RNA分子，它具有高度保守的序列特征、特定的空间二级结构、复杂的亚细胞定位等特征。同时，大部分LncRNA在不同的组织中具有不同的分布特异性，其二级结构也不尽相同，这进一步说明了LncRNA拥有丰富的生物学功能^[2]。根据相对位置可以将LncRNA分为五类：（1）基因内LncRNA（intronic LncRNA）：指同一个基因中外显子之间，由内含子转录得到的LncRNA^{[3, 4]}；（2）基因间LncRNA（intergenic LncRNA，lincRNA）：从不同非编码蛋白基因间转录得到的LncRNA；（3）正义LncRNA（sense LncRNA）：转录方向与编码蛋白的基因转录方向相同的LncRNA；（4）反义LncRNA（antisense LncRNA）：转录方向与编码蛋白的基因转录方向相反的LncRNA；（5）双向LncRNA（bidirectional LncRNA）：转录方向与编码蛋白的基因转录方向相同或相反的LncRNA。相关研究应用多种技术和工具来探究LncRNA的相关功能，由于LncRNA种类多、缺少开放读码框（Opening Read Frame，ORF）、保守性较差等特点，所以LncRNA功能研究的难度要远大于microRNA、siRNA和snRNA等非编码RNA^[5]。常用的LncRNA分析方法有：结合染色质免疫共沉淀的深度测序技术（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing，ChIP-seq）、结合RNA-seq的LncRNA功能预测技术、非编码RNA沉默与定位分析技术(Combined knockdown and localization analysis of noncoding RNAs，c-KLAN)、荧光原位杂交技术（FISH）、RT-PCR技术等^[6]。已经证实LncRNA可以对多种生物学相关功能进行调控：（1）肿瘤相关基因的沉默与过表达；（2）不同剪切体的功能调控与形式转换；（3）参与基因转录的上调与下调以及蛋白的甲基化和去甲基化；（4）参与调控细胞的凋亡与自噬。

一、LncRNA与胃癌

长期以来，人们对肿瘤基因组的研究主要集中在外显子组上，随着高通量测序技术的出现，测序深度不断提高，研究者发现，曾经被认为是转录“垃圾（junk）”的长链非编码RNA在生长发育、分化凋亡以及相关细胞代谢中有着不可或缺的作用，然而依旧有很多LncRNA的功能尚不明确^{[7, 8]}。近年来，胃癌相关的LncRNA异常调节受到学界的广泛关注，这些LncRNA与肿瘤的进展、侵袭、转移与化疗耐受密切相关，最新报道显示在胃癌组织中存在135种异常表达的LncRNA，其中71种表达明显上调，64种表达下调，使得LncRNA有望成为胃癌新的治疗靶点^[9]。本文总结（见表1）回顾和分析了近年来胃癌LncRNA的相关研究文献，为胃癌的研究提供了新的思路。

1. H19基因：H19是一种和细胞生长有关的“管家基因”，位于人类11号染色体短臂15区5亚带，长2322bp，拥有五个外显子和四个内含子。其表达含量受到差异表达区域（Differentially Methylated Domain，DMD）和印记控制区域（Imprinting Control Region，ICR）的调控^[10]。H19由于其肿瘤基因的抑制作用，最初被认为肿瘤抑制因子，但最近的研究显示H19同时具有促肿瘤作用和抑肿瘤的作用^[11]。最新研究显示，H19在胃癌组织和胃癌细胞中高表达，在贲门腺癌中表达量更是显著升高，同时与贲门腺癌TNM分析显著相关^{[9, 12-16]}。此外，高表达的H19是胃癌患者生存期的独立危险因素。作为转录因子，细胞同源性禽类骨髓病毒致癌基因（Cellular Homolog of Avian Myelocytomatosis Virus Oncogene，c-myc）可以直接上调胃癌细胞中H19的表达含量，同时研究还显示，H19对p53活化起到一定作用，但其机制尚不明确^[14]。一些研究还显示野生型p53对维护DNA甲基化非常重要，同时在p53突变或者野生型p53 cDNA增加的情况下，H19启动子的活性明显上升^[12]。H19还被认为是某些mi-RNA的前体，如在胃癌细胞中，H19介导miR-675通过肿瘤抑制基因转录因子1（Tumor Suppressor Runt-Related Transcription Factor 1 Gene，RUNX1）来增殖为癌细胞^{[17, 18]}。另外，该研究还发现在肿瘤细胞发生发展过程中的新的基因调节通路：H19/miR-675/RUNX1信号通路，该通路可能成为胃癌潜在的治疗靶点。

近年来相关研究还显示，H19在胃癌患者血浆表达量显著高于非癌人群，同时H19在血浆中非常稳定，且在胃切除后显著降低，这提示H19可能是早期胃癌诊断与评估的新型标志物。研究还显示，H19在缺氧状态下可以被p53/HHIF1-α通路介导，同时体外实验证实H19敲除可以显著抑制缺氧介导的癌细胞增殖^[19]。此外，H19 siRNA在肝癌小鼠模型（Hepatic Cell Cancer，HCC）和膀胱癌细胞系中抑制肿瘤发生，而沉默H19可以增强体外缺氧恢复后肿瘤细胞的增殖能力^[20]。因此，H19可以成为多种肿瘤（尤其是那些可以被缺氧压力促进生长的肿瘤）的治疗靶点。总的来说，H19可能成为胃癌新型的药物治疗靶点。

Table 1. 胃癌相关的LncRNA

2. HOTAIR：HOX转录本基因间反义RNA（HOTAIR）是一个非编码RNA，其转录内容主要为典型HOXC基因的反义转录本。研究显示，HOTAIR长2158bp，位于HOXC所在的12号染色体长臂13区13亚带^[21]。早期研究显示，尽管HOTAIR是一个非编码RNA，但其功能之多使学者们对非编码RNA的功能认识上升到一个新的高度^[22]。HOTAIR与PRC 2（Polycomb Repressive Complex 2）、SUZ12（Suppressor of Zeste 12）、EZH2（Enhancer of Zeste Homolog 2）相互作用引起H3K27三甲基化^{[23, 24]}。另外，其他研究报道显示，高表达的HOTAIR与包括乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌在内的多种癌症有关^[25]。

近来，文献报道显示，HOTAIR在胃癌组织中的高表达与胃癌进展及其TNM分期有关，特别是与肿瘤的淋巴结转移显著相关^[26-28]。多篇研究显示过表达的SUZ12通过PRC2和H3K27的三甲基化途径提示，HOTAIR是一个非常重要的肿瘤转移相关因子^[27]。另外，其他研究显示，EZH2可能结合HOTAIR相关位点，同时高水平的HOTAIR可以通过沉默PRC2抑制基因（如：Growth-Differentiation Factor 15，GDF15）进而介导细胞增殖^{[23, 29, 30]}。此外，HOTAIR通过调节金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMPs）介导上皮间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）进而在肿瘤细胞侵袭中起到重要作用^[28]。miR-196a与HOTAIR同处HOX基因簇中，其上调在胃肠道间质瘤恶性转化中起到非常重要的作用。HOTAIR作为内生的RNA，它与miR-331-3p存在竞争性抑制进而影响人类表皮生长因子2及其转录相关的调节^[31]。

总的来说，HOTAIR是一个肿瘤广谱表达的LncRNA，同时可以成为肿瘤患者诊断和预后评估的独立危险因素。更重要的是，HOTAIR为新一代分子靶向药物的开发提供方向。

二、胃癌相关的其它LncRNA

除了H19和HOTAIR，还有多种LncRNA在胃癌组织及细胞中异常表达，这些LncRNA可以大致分为两类：高表达的LncRNA和低表达的LncRNA。它与H19和HOTAIR类似，这些LncRNA中一部分也被证实与胃癌肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分期有关^{[9, 13, 32, 33]}。

1. 胃癌中高表达的LncRNA：上调的LncRNA与肿瘤的大小、侵袭深度、淋巴结转移有关，因此其可以成为潜在的胃癌患者TNM分期和预后指标。一项96人的配对研究显示，在这些上调的LncRNA中，SUMO1P3（Small Ubiquitin-Like Modifier 1 Pseudogene 3）的表达量与肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移情况、侵袭深度显著相关。这意味着SUMO1P3可以成为胃癌患者潜在的预后生物标志物[34]。另外，它与人类T细胞凋亡和分裂有关，且乳腺癌中表达量下调的GAS5（Growth Arrest Specific Transcript 5）也在胃癌组织中表达上调^{[8, 13, 32]}。这提示GAS5可能同时具备原癌基因和抑癌基因两种功能，这需要进一步的研究确认。

2. 胃癌中低表达的LncRNA：GACAT1（Gastric Cancer-Associated Transcript 1）是胃癌低表达的LncRNA中最具代表性的一个，其表达水平与胃癌淋巴结转移和胃癌分期显著相关^[35]。BM742401是一个新发现的LncRNA，其表达水平在胃癌组织中显著降低且与III期胃癌患者的预后显著相关。同时BM742401与肿瘤的多种代谢过程有关，其中BM742401可以显著下调MMP9的现象受到学者们广泛关注，使得其成为胃癌潜在的治疗靶点^[36]。uc001lsz也是胃癌细胞中新发现的LncRNA，在胃癌早期表达量较高，随着肿瘤的进展，表达量显著降低，使其可以成为肿瘤早期诊断的标志物^[9]。此外，胃癌组织中MEG3（Maternally Expressed Gene 3）通过DNA甲基化导致其表达量下调，同时其功能通过活化p53基因介导细胞凋亡，抑制细胞增殖^[37]。

还有多种LncRNA在胃癌中首次报道，其分子机制已经在其它肿瘤相关文献中阐明。例如，它与结肠癌相关的CCAT1（Colon Cancer-Associated Transcript 1）在胃癌组织中也出现明显上调，同时其与胃癌的肿瘤大小、淋巴结转移情况显著相关^[38]。CCAT1通过调节启动子区域的c-myc与E-box之间的相互作用发挥原癌基因的功能。通过激活EMT进而促进肿瘤转移的HULC（Highly Upregulated In Liver Cancer）被发现在胃癌中通过激活自噬进而介导肿瘤细胞的增殖^[39]。LncRNA-GHET1（Lncrna Gastric Carcinoma Highly Expressed Transcript 1）作为抗肿瘤药的潜在作用靶点与IGF2BP1（Insulin-Like Growth Factor 2 Mrna-Binding Protein 1）结合继而增强c-myc稳定性来促进细胞增殖^[40]。此外LINC00152在BGC-823、MGC-803和SGC-7901等胃癌细胞株表达量显著高于胃组织正常细胞株GES-1，更为重要的是其在胃液中表达含量显著高于正常对照，这提示其具有预测胃癌发生的潜在能力^[41]。

三、LncRNA在胃癌中的潜在临床应用价值

对于肿瘤的早期诊断来说，寻找新型的非侵袭性生物分子标志物是非常必要的，其有助于筛查早期可以治愈的肿瘤个体患者。胃癌作为全球第二大致死肿瘤一直备受人们的重视，更为重要的是多数患者在诊断时已经处于晚期，失去了手术治疗的最佳时机^[42]。因此，如何对胃癌进行早期诊断成为临床亟待解决的问题。前期的深入研究表明，通过mRNA表达谱可以进行肿瘤的早期预测与分型评估，但LncRNA作为肿瘤生物标志物对诊断及预后的价值还有待研究。这可能是由于mRNA具有更多的生物学功能，因此可能对生物信号通路产生更大的影响。但是越来越多的研究表明，LncRNA在多种生物学功能中扮演着非常重要的角色。本文总结了可以用于胃癌的LncRNA的诊断价值，及其特异性与敏感度（表2）。

Table 2. 应用于胃癌诊断的LncRNA

如上表所示，多个LncRNA对胃癌诊断的特异性与敏感度均超过传统的血清学肿瘤标志物，这进一步证明，LncRNA有成为新型胃癌肿瘤标志物的可行性^[43]。虽然上述LncRNA的研究例数有限，且研究类型多为回顾性研究，但是随着越来越多的学者参与其中，相信大型的前瞻性研究很快就会公布，届时将有更有力的证据证明LncRNA可以作为胃癌诊断及预后的标志物。

随着研究的不断深入，多种胃癌相关的LncRNA被相继发现，其与胃癌发生发展的相关机制被不断明确，其作为胃癌诊断与预后标志物的可能性在不断增加，越来越多的学者们将LncRNA视为未来肿瘤诊断和治疗的工具之一。本文分析和论述了多种LncRNA在肿瘤尤其是胃癌中的作用，其中一些指标已经应用于临床试验，这为LncRNA真正用于临床检测及其广泛应用前景打下坚实基础。

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