高效液相色谱和质谱联用技术在蜱传脑炎代谢组学检测中的应用与临床诊断价值
作者：杜彦丹 陆德生 牛艺卿
单位：内蒙古林业总医院
【摘要】目的 探讨用超高效液相色谱与质谱联用技术（UPLC-MS）检测蜱传脑炎（TBE）患者外周血清代谢物，寻找特征代谢物作为TBE患者筛查、诊断或监测指标。方法 将数据利用Mzmine2.0软件进行前处理和归一化，应用SIMCA16.0软件构建正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型，对TBE组和正常对照组进行代谢产物初筛。将代谢物的质荷比（m/z）输入到HMDB 数据库及统计学分析筛选两组间的特征代谢物。通过绘制ROC曲线及计算特征代谢产物的AUC值（以AUC＞0.9作为评价指标）评价这些特征代谢产物诊断TBE的效能。结果 采用UPLC-MS技术筛选出45种与TBE病程相关的代谢物，TBE组与正常对照组比较，代谢物AUC＞0.9的有19种，经分析确认溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酸、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、心磷脂、3-O-半乳糖神经酰胺9种代谢物可以作为TBE特征代谢物。结论 利用UPLC-MS技术平台检测TBE患者血清特征代谢物是有效的方法；确定的9种特征代谢物可能成为TBE筛查、诊断或监测指标。
【关键词】蜱传脑炎；代谢组学；液质联用技术
蜱传脑炎又称森林脑炎（tick-borne encephalitis，TBE）是由森林脑炎病毒（tick-borne encephalitis virus，TBEV）引起的一种严重的神经系统疾病，蜱虫为其主要传播媒介，属于自然疫源性疾病[1]。该病主要分布于我国东北、西北、西南的原始森林区，随着西部大开发和振兴东北战略实施的深入，感染率和发病率均呈增长趋势[2, 3]。TBE已成为严重影响牧区和林区人们健康和经济发展的重要公共卫生问题。目前TBE的临床实验室诊断方法主要是免疫学方法，其特异性较差，无法满足临床要求，应用RT-PCR技术检测早期患者血清或CSF中的病毒RNA，敏感性和特异性均高，辅助诊断意义较大，然而其具有时效性，往往TBE患者会错过最佳检出的时期，降低了其早期诊断效果[4]。因此，临床实验室迫切需要建立一种敏感性、特异性高、精度良好的新型检测技术。
一、研究对象与方法
1. 一般资料：选取于2018年4月~2018年12月就诊于内蒙古林业总医院神经内科住院的TBE患者30例为实验组及同期30例健康体检者为正常对照（Normal）组。实验组纳入标准：（1）蜱咬伤，患者外周血清TBEV特异性抗体IgM或IgG≥l：20阳性，明确诊断为TBE患者（符合《职业性森林脑炎的诊断标准》(GBZ2002)）。（2）近期未发生感染及预防接种。正常对照组纳入标准：无蜱咬伤及森脑疫苗接种史，患者外周血清TBEV特异性抗体IgM或IgG阴性的健康体检者。两组排除标准：（1）排除妊娠期或哺乳期女性。（2）排除存在严重的心、脑、肝、肾等器质性疾病和自身免疫疾病人群。（3）排除未能按照实验要求及时抽血者。两组年龄控制在18~65岁之间。本研究已受到内蒙古林业总医院伦理委员会的批准，所有研究对象在采血前均取得本人或家属的知情同意。
2. 仪器与试剂：采用高效液相色谱和质谱（UPLC-MS）平台：（1）色谱仪检测条件：以反相C18柱（2.1 mm×150mm.1.9μm）为色谱柱，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液。流动相时间和浓度设置为：95%流动相A和5%流动相B，维持2.5min；之后在4min内，流动相B线性增加到95%，维持5%流动相A和95%流动相B3min；之后在4min内，将流动相B线性降低到5%，最后95%流动相A和5%流动相B，维持2.5min。其它参数设置为：进样量为10μL、自动进样器温度为4℃、流速为200μL/min以及柱温为20℃；（2）质谱仪检测条件：离子源为电喷雾离子源（ESI），全峰宽半峰高分辨率（FWHM）能够达到100,000。参数为：正离子模式下进行检测、数据采集范围为质荷比（m/z）50~1000、毛细管电压为7V、离子源电压为4.8kV、锥孔电压为50V。
3. 研究方法：（1）样本收集：收集患者基本资料，并分别清晨采集受试者空腹静脉血，离心留取血清待用。（2）特征代谢物的筛选与鉴定：将收集血清标本同时进行去蛋白、烘干、溶解、上样。分别取5µL待测样品，充分混匀，即为质控品。在样品分析前连续检测16个质控品，之后每检测6个样品检测1次质控品，每次质控品检测之后加测一次空白，以防止交叉污染。将获取的数据利用 MZmine2.0软件进行预处[5]，导入SIMCAP16.0软件构建正交偏最小二乘判别分析模型（OPLS-DA）；再根据变量投影重要性（VIP）值及VIP置信区间对所测离子进行初步筛选。筛选标准为：VIP>1且置信区间不包含0的离子。特征代谢物则通过将特征离子的m/z带入HMDB数据库进行鉴别[6]。
4. 统计分析：应用SPSS 23.0软件进行统计分析，对于符合正态分布计量资料采用t检验或方差分析比较，对于不符合正态分布的连续性资料采用Kruskal-Wallis H检验或Mann-Whitney U检验进行比较，对于计数资料比较采用χ2检验。绘制受试者工作特征曲线（ROC）以及计算各个曲线所对应的曲线下面积（AUC）。以P＜0.05表示差异有统计学意义。
二、研究结果
1. 基本资料分析：两组基本资料比较，性别（χ2=3.270，P=0.071）和年龄（t=-1.500，P=0.139）均差异无统计学意义。见表1。
2. 质控结果：共检测了16个质控品，进行数据分析，建立了质控物模型图。质控品均在质控范围内，本批样品分析结果可靠（见图1）。
3. 各组的总离子流图：各样品所对应的总离子流图（TIC），横坐标表示的是保留时间（RT），纵坐标表示总离子流强度。在保留时间为5.40min左右时，各组所检测到的代谢离子在种类或是含量上存在差异（见图2）。
4. 区分模型的构建：得到的数据进行前处理，进行主成分分析（PCA），构建OPLS-DA模型，具有较好的模型解释率和预测率：R2X=80.2%，R2Y=90.9%，Q2=88.1%。正常对照组集中在左半象限，TBE组集中在右半象限（见图3).
5. 特征代谢物的初步筛选和鉴定：根据所构建OPLS-DA区分模型，共筛选出47种代谢离子，对这些离子的色谱峰积分面积值得差异进行统计分析，最终鉴定出45种特征代谢物（见表2）。
6. TBE的诊断效能评估：通过对两组的比较，探索这些特征代谢物对TBE诊断效能，TBE组共有12种代谢物表达降低，33种代谢物表达升高，表达降低的12种代谢物中有3种具有较高的区分效能，其AUC结果为：3-O-Protocatechuoylceanothic acid为0.977；Dipiperamide C为0.970；CL（8:0/8:0/8:0/8:0）为0.976。表达升高的33种代谢物中有16种具有较高的区分效能，其AUC结果为：PG（16:1(9Z)/16:1(9Z)）为1.000；PA（22:2(13Z,16Z)/18:1(11Z)）为1.000；LysoPA（24:0/0:0）为1.000；LysoSM（d18:1）为0.996；3-O-Sulfogalactosylceramide（d18:1/20:0）为0.940；19alpha-19-Hydroxy-3，11-dioxo-12-ursen-28-oic acid为0.991；Sinapoylspermine为1.000；LysoPC（15:0）为0.994；PE（P-16:0e/0:0）为0.988；Menatetrenone为0.957；Cholesterol sulfate为0.954；PE-NMe（22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)）为0.918；Apo-12'-violaxanthal为0.947；PS（24:0/20:2(11Z,14Z)）为0.963；PS（MonoMe(13,5)/DiMe(13,5)）为0.979；PG（18:0/20:3(5Z,8Z,11Z)）为0.946（见图4）。
三、分析与讨论
代谢组学（Metabonomics）是对某一生物或细胞在某一特定生理病理时期内所有低分子量（相对分子质量小于1000 Da）代谢产物同时进行定性和定量分析的一门新学科，是系统生物学的重要组成部分[7]。代谢组学与其它组学相比有其自身的特点：（1）种类相对较少，便于研究；（2）与其他组学比较，更易于检测；（3）无需建立庞大的数据库；（4）各生物代谢产物较为相似，具有良好的通用性。随着代谢组学的发展，在医学领域的应用范围愈加广泛，比如疾病诊断、医药研制开发、毒理学等与人类健康密切相关的领域[8-10]。液相色谱-质谱法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）技术是代谢组学主要技术平台之一，被引进临床实验室以来，便很快以其高灵敏度、低检测限、样本用量少、高通量、检测速度快、样本前处理简单的优势显示出巨大的生命力，广泛应用于临床分析的众多领域，并成为很多分析物检测的金标准。
探讨利用超高效液相色谱与质谱联用（UPLC-MS）技术检测TBE患者外周血清非靶向代谢物，寻找特征代谢物作为TBE患者早期筛查、诊断或监测指标。年龄、性别是影响人体代谢的重要原因之一，本研究为排除年龄、性别对实验结果的影响，在实验设计阶段对年龄进行限制，对两组样本的年龄、性别进行组间的统计学比较，两组样本在年龄、性别方面的差异无统计学意义（P＞0.05），排除年龄、性别对实样结果的影响。
本研究溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid, LPA）表达水平高于正常对照组，LPA是磷脂酸的生物合成前体，影响许多生化过程，LPA主要通过与其特异的G蛋白偶联受体LPA1-7结合而起作用，从而对多种细胞类型起诱导作用[11]Crack P J等人研究正常人和急性闭合性颅脑损伤后死亡的患者的LPA，通过比较发现在脑损伤后，LPA表达水平上调，表明中枢神经系统（CNS）创伤后LPA表达水平上调[12]，LPA可以使星形胶质细胞出现反应性增生，形成神经胶质瘢痕，这种反应性增生影响神经元损伤后再生[13]。LPA可能与TBE脑损伤后综合征有关。ROC结果表明LysoPA（24:0/0:0）（AUC值1.000特异性1.000和灵敏度1.000）具有较高的诊断效能，综上所述，LPA有可能成为实验室早期筛查、诊断检测指标。
本研究共鉴定出8种溶血磷脂酰胆碱（Lysophosphatidylcholine，LysoPC），其中3种表达降低5种表达升高，其调节多种细胞事件，包括氧化应激、分化和炎症[14, 15]，LPC可能既参与固有免疫又参与特异性免疫，LPC可能通过刺激T细胞，诱导IFN-γ高表达，IFN-γ对淋巴细胞具有双相性，大剂量抑制免疫反应，而低剂量可以增强免疫的效果。IFN-γ抑制B细胞生成IgE，有研究表明TBE患者B细胞表达量降低[16]，由于相关研究较少尚需进一步研究确定LPC和TBE的关系，ROC 结果表明LysoPC（15:0）（AUC值0.994特异性1.000和灵敏度0.933）具有较高的诊断效能，综上所述，LysoPC（15:0）有可能成为实验室早期筛查、诊断检测指标。
鉴定出TBE组和正常对照组血清中差异的甘油磷脂包括磷脂酸（phosphatidic acid，PA）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）、心磷脂（Cardiolipin，CL）。PA、PE、PS、PG在TBE患者清中表达升高，而CL表达降低。PA和PE有着促进膜曲率和增加膜融合的共同作用[17，18]，TBEV需要与靶细胞膜融合，入侵靶细胞[19]，TBEV可能诱导患者体内PA和PE增加，使其更容易与靶细胞膜融合。高浓度的PS会诱导Ca2+浓度增加，加重神经细胞损伤[20]，PS的升高可能参与TBE患者神经系统的损伤。PG在某些疾病中表达升高，如癌症等[21-23]，然其与TBE关系尚不清楚，有待进一步研究确定。CL以不同的分子形式广法的存在中枢神经系统中，这些不同分子形式的CL支持线粒体功能、代谢过程和保持脑细胞活力[24]，CL含量发生改变时，神经元和胶质细胞功能均会发生改变[25]，虽然其与TBE的关系尚不明确，当其在神经系统疾病作用是明确的，主要通过其对线粒体结构和功能的调控影响神经系统。经ROC分析PA（22:2(13Z,16Z)/18:1(11Z)）、PE（P-16:0e/0:0）、PE（22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z）、PS（MonoMe(13,5)/DiMe(13,5)）、PG（18:0/20:3(5Z,8Z,11Z)）、CL的AUC值均大于0.9，均有较高的诊断效能，综上所述，这些甘油磷脂有可能成为实验室早期筛查、诊断或监测指标。
3-O-半乳糖神经酰胺（3-O-Sulfogalactosylceramide）在TBE组明显高于正常对照组，积累的3-O-Sulfogalactosylceramide使中枢和周围神经系统的髓鞘细胞丢失，破坏细胞生理功能，髓鞘丢失会导致许多神经系统疾病恶化，这种疾病是致命的，而且无法治愈，如视神经萎缩、癫痫和痴呆、导致过早死亡[26, 27]，而TBE导致的呼吸肌麻痹也是很难逆转，目前资料较少，我们只能大胆推测其与3-O-Sulfogalactosylceramide增加有关，这也为我们研究TBE患者呼吸肌麻痹寻找一条新的途径，ROC结果表明3-O-Sulfogalactosylceramide（AUC值0.940特异性0.967和灵敏度0.800）具有较高的诊断效能，综上所述，3-O-Sulfogalactosylceramide有可能成为实验室早期筛查、诊断或监测指标。
利用UPLC-MS技术平台检测TBE患者血清特征代谢物是有效的方法；确定的9种特征代谢物可能成为TBE筛查、诊断或监测指标。由于本次研究样本量少，需要进一步研究确认。
四、结论
1. 利用UPLC-MS技术平台检测TBE患者血清特征代谢物是有效的方法。
2. TBE患者血清确定的LysoPC(15:0)、LysoPA（24:0/0:0）、PA（22:2(13Z,16Z)/18:1(11Z）、PE（P-16:0e/0:0）、PE（22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z）、PS（MonoMe(13,5)/DiMe(13,5)）、PG（18:0/20:3(5Z,8Z,11Z)）、CL、3-O-Sulfogalactosylceramide 9种特征代谢物可能成为TBE早期筛查、诊断检测指标。
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