老年重症肌无力致病抗原和抗体检测方法及临床诊断意义
作者：殷剑 王红
单位：北京医院神经内科
一、重症肌无力介绍
重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是一种主要由乙酰胆碱受体抗体介导、细胞免 疫依赖、补体参与，累及神经肌肉接头突触后膜乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor， AChR），进而引起神经肌肉接头传递障碍，出现骨骼肌收缩无力为特征的获得性自身免疫性 疾病[1, 2]。 自多国的人口统计和流行病学调查，重症肌无力可以累积所有年龄段的人群，笔者所在 单位诊断新发病的女性重症肌无力患者最高年龄为98.5岁，男性新发病MG起病年龄94岁。并 随着人口老龄化等原因，发病率在各国均显现增加趋势。Lotan Itay等以色列学者对乙酰胆碱 受体抗体阳性患者的流行病学调查结果显示（见图1，图2），在近20年内重症肌无力发病率 增加将近4倍，其中大于50岁新诊断的重症肌无力患者增加最多。老年起病的重症肌无力发病 率明显增加，在各国医学界已经成为共识。由于重症肌无力需与多种疾病（如吉兰巴雷综合 征，CIDP和副肿瘤综合征）鉴别诊断，使重症肌无力抗体的辅助检查在临床具有重要价值。 乙酰胆碱与AChR结合能启动肌细胞兴奋-收缩耦联的动作电位 ， 乙酰胆碱 （acetylcholine，ACh）可由乙酰胆碱脂酶（acetylcholinesterase，AChE）水解为胆碱和乙酸 而终止其作用。分泌蛋白Agrin从神经肌肉接头突触前膜释放后与后膜的低密度脂蛋白受体相关蛋白4（low-density lipoprotein receptor-related protein，LRP4）相结合，促进LRP4与肌肉特异性激酶（muscle-specific kinase，muscle-specific kinase，MuSK）的联结并使MuSK磷酸化，继而募集Dok7使其酪氨酸磷酸化，激活胞质内信号转导通路后通过锚定Rapsn诱导AChR的簇集，GRN-LRP4-muscle-specific kinase（MuSK）-DOK7蛋白组的存在有助于维系神经肌肉接头功能的完整性，神经肌肉接头示意图见图3。
图1. 以色列1995-2015年全国乙酰胆碱受体阳性MG患者的发病率增加将近4倍
图2. 以色列1990-2015年新诊断全国乙酰胆碱受体阳性MG患者的年龄变化趋势，大于50岁新起病的男女患者均明显增加
（Myasthenia gravis-autoantibody characteristics and their implications for therapy..
Nat Rev Neurol. 2016; 12(5): 259-68）
图3. 神经肌肉接头示意图
二、重症肌无力的免疫发病机制与免疫网络
重症肌无力是目前人类研究最多、最了解的自身抗体介导的神经系统疾病，目前研究显示重症肌无力相关自身抗原可分为两大类：跨膜或细胞外自身抗原和细胞内自抗原类[3]。
1. 跨膜或细胞外自身抗原（Transmembrane or extracellular proteins）：抗跨膜或细胞外自身抗原抗体对重症肌无力有致病作用，直接抗体（如抗AChR抗体）或间接抗体（如anti-muscle-specific kinase，MuSK抗体和抗LRP4抗体）影响神经肌肉接头处的AChR功能，导致肌肉跨膜离子转运受损和肌肉收缩减少。
（1）骨骼肌烟碱性乙酰胆碱受体：骨骼肌烟碱性乙酰胆碱受体（AChR）是重症肌无力中最常见的自身抗原，主要集中在神经肌肉接头突触后膜皱褶的顶端。骨骼肌烟碱性AChR是一种250kD的跨膜五聚体糖蛋白，由两个α1-亚基、一个β1-亚基、一个δ-亚基和一个γ亚基（胚胎型AChR）或ε-亚基（成人型ACHR）组成。乙酰胆碱受体亚基形成阳离子通道，与乙酰胆碱（Ach）可以结合到α1-亚基上的两个结合位点，从而使阳离子（Na+，Ca2+和K+）在膜上通过，产生动作电位[3]。
抗AChR抗体在80%的重症肌无力患者血清中检测到。抗AChR抗体是多克隆抗体，抗体与AChR的胞外结构域（可以是各个亚基）结合，AChR主要的免疫原性区域（main immunogenic region，MIR）被确定为50%以上抗体的靶点，见图4。免疫原性区域（MIR）主要是由AChRα1-亚基的氨基酸（67～76）形成的周围的一组表位。抗AChR抗体的致病作用的一个重要机制是通过激活补体系统。大多数致病抗体能够在抗原结合的情况下激活补体级联系统，导致相关的膜攻击复合体（MAC）的形成和神经肌肉接头突触后膜的损伤。第二个重要的致病机制是由双价AChR和抗AChR抗体的交联复合物介导抗原调节，加速乙酰胆碱受体的内化和破坏。由自身抗体诱导的AChR降解而引起增加的AChR合成增加不能补偿这种损失导致突触后膜上的AChR丢失和密度减少。第三，一些抗AChR抗体会直接阻断ACh结合位点，从而阻断AChR信号。针对ACHRα亚基的抗AChR抗体比其他其他AChR亚基的抗体更易产生重症肌无力，直接影响疾病严重程度。
注：（A）单个AChRα亚基的带状图，使五聚体的中心轴位于右侧。神经肌肉接头突触后膜显示为灰色矩形。α螺旋m1-m4是一种跨膜结构，形成AChR的离子渗透门。免疫原性区域（红色显示）位于β2-和β3-链之间。（B）从突触间隙看整个受体的。蓝色为AChRα亚单位，红色为免疫原性区域，品红中的AChRβ亚单位，淡蓝色的AChRδ亚单位，灰色中的AcRγ亚单位。（C）示意图通过免疫原性区域表达自身抗体诱导的分子间交联
图4. 肌肉与AChR的示意图
（2）肌肉特异性激酶（MuSK）：肌肉特异性激酶是跨膜单亚基蛋白，负责AChR在神经肌肉接头突触后膜的聚集，神经肌肉接头突触后膜的LRP4-Agrin复合物诱导的磷酸化激活MuSK，AChR的聚集过程还需要包括rapsyn蛋白，一种连接AChR和细胞骨架的支架蛋白。抗MuSK抗体在1-10%的重症肌无力患者中检测到。大多数抗MuSK抗体属于IgG4亚类，它不能激活补体系统，并且不能诱导抗原调节，因为它们在功能上是单一的。她们的作用方式不同于AChR抗体[3]。患者体内抗MuSK抗体滴度随时间的变化通常反映疾病活动性和严重性[3]。
（3）脂蛋白受体相关蛋白4（LRP4）：LRP4是一个单亚单位跨膜蛋白，包含多个重复低密度脂蛋在细胞膜外[4]。LRP4-AGRIN复合物触发MuSK激活和磷酸化，抗LRP4抗体在重症肌无力患者已被检测。但使用检测的方法不同，和不同人群,检出率报道不同。在10个不同国家双抗体阴性重症肌无力患者检出率为7-33%，变异很大。此外，8%的抗AChR抗体阳性重症肌无力患者、15%的抗MuSK抗体阳性重症肌无力患者发现了抗LRP4抗体。在肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者中，也有10至23%的患者发现了抗LRP4抗体。抗LRP4抗体在重症肌无力中的致病性尚未完全确定。
（4）Agrin：人集聚蛋白（Agrin）[5]与肌肉细胞膜上的蛋白质结合，如LRP4，dystroglycan和laminin，从而调节神经肌肉接头的形成、维持和再生。抗Agrin抗体在一些重症肌无力患者（有或无抗AChR抗体的MG患者）中检测到。这种抗体在体外抑制MuSK磷酸化和AChR聚集。使用Agrin免疫小鼠与可以导致肌肉无力和人类的重症肌无力相似。然而，抗Agrin抗体是否在人类疾病中起着任何致病作用尚不清楚。
（5）胶原蛋白Q（ColQ）：胶原蛋白Q（ColQ）在重症肌无力突触后膜的细胞膜外浓缩和锚定AChE。在3%的重症肌无力患者（包括五名抗AChR和抗MuSK抗体双阴性的患者）和2.3%的健康对照者的血清中已检测到抗COLQ抗体。抗COLQ抗体的致病作用尚未确定。但COLQ基因突变可导致肌无力综合征[3]。
（6）电压调节钾通道Kv1.4：在10和20%的日本和欧洲重症肌无力患者中检测到了抗骨骼肌中电压调节钾通道Kv1.4 α亚基的抗体。Kv1.4集中在神经肌肉接头突触后膜，也见于心内膜。抗Kv1.4抗体可能与MG患者的心肌上电压门控钾通道有交叉反应。在日本患者中，抗kv1.4抗体的存在与重症肌无力严重程度和心脏并发症相关，但在欧洲患者中没有观察到这种现象。
2. 胞内抗原：横纹肌抗体的靶蛋白多位于肌细胞内，其自身抗体并不直接暴露于循环中，抗细胞内抗原的抗体不太可能对重症肌无力致病，但在临床上可用作重症肌无力特征的标记物，如疾病严重程度、胸腺瘤和肌病的存在，特别是抗TITIN抗体。
（1）TITIN：肌联蛋白（TITIN）是骨骼肌纤维中第三类丰富蛋白质，是肌肉收缩的必要条件。抗TITIN抗体在20-30%的抗AChR抗体阳性重症肌无力患者检测到，大多数是胸腺瘤或晚发型重症肌无力患者。事实上，抗TITIN抗体也是早发型重症肌无力患者合并胸腺瘤的标志物，其敏感性和特异性均在90%左右。针对TITIN产生的自身免疫反应会引起严重的肌无力症状[6]。
（2）Ryanodine受体：Ryanodine受体（RyR受体）是位于骨骼肌（RyR1）和心肌（RyR2）肌质网的钙离子释放通道，在横纹肌的兴奋收缩偶联中起重要作用，RyR抗体主要是IgG1和IgG3抗体，因而推测其作用过程中有补体参与。重症肌无力患者体内的RyR抗体对位于骨骼肌和心肌的RyR受体存在交叉反应。抗Ryr抗体存在于70%的胸腺瘤重症肌无力患者血清中和14%的晚发型重症肌无力患者血清中。这个抗体的存在是胸腺瘤的标志物，显示严重的重症肌无力[7]。
（3）Cortactin：皮层肌动蛋白（Cortactin）与肌动蛋白结合，促进肌动蛋白组装，参与MuSK介导的AChR聚集。在抗AChR抗体和抗MuSK抗体双阴性的重症肌无力患者中有20%被检测到抗Cortactin抗体，5-10%的抗AChR抗体阳性重症肌无力患者有该抗体。
然而，这些抗体在5%的健康对照者和10-15%的其他自身免疫性疾病患者同样可以检测出，其中多发性肌炎患者20%可以检测出。由于缺乏特异性使它们不能用于诊断目的，该抗体目前还没有被用作重症肌无力的生物标记物[8]。
三、重症肌无力的抗体检测技术
所有类似重症肌无力临床病史的患者都应进行相应抗体检测[9]。大多数重症肌无力患者血清可以检测到抗-AChR抗体，未检测到抗-AChR抗体的重症肌无力患者应该进行抗MuSK抗体的检测，有条件者可进行抗LRP4抗体检测。重症肌无力合并胸腺瘤患者一般仅检测抗-AChR抗体即可。重症肌无力患者可以进行检测到细胞内抗原的抗体（抗-agrin、抗ColQ和抗Kv1.4抗体），这些抗体几乎只在抗AChR抗体阳性重症肌无力患者血清中出现[10]。
1. 抗AChR抗体检测：大多数诊断实验室用放射免疫测定试剂盒检测抗AChR抗体，特异性几乎100%的（图5）。检测呈阳性，有肌肉无力病史，一般不需要其他诊断测试，就可以诊断重症肌无力。最初开发放射性免疫沉淀测定（RIPA），使用125 I-ɑ银环蛇毒素标记大鼠肌肉AChR来检测MG患者血清中的抗体。后来发展使用人类肌肉的AChR（胚胎型AChR，混合从正常和去神经人的肌肉的提取的AChR）。进一步，转染乙酰胆碱受体亚单位基因进入人类肌肉细胞系TE671，表达后作为稳定的胎儿和成人型AChR的来源[10]。
注：放射免疫沉淀法radioimmunoprecipitation assay (RIPA) ，酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay ELISA），细胞分析法cell-based assay（CBA），荧光免疫沉淀法fluorescence immunoprecipitation assays（FIPA）
图5. 检测抗AChR抗体的四种技术原理图
需要指出的是在临床中出现意想不到的阳性结果应该均应重新测试（推荐不同试验方法交叉检测验证），因为生物标志物测试是可能出现技术误差。RIPA在全身型重症肌无力的灵敏度通常为80～85%，特异性很高。在胸腺瘤患者中可以出现假阳性，但非常罕见，怀孕期间妇女罕见出现抗AChR抗体。
多国指南推荐测定AChR和MuSK抗体的主要使用RIPA，但放射性的使用有一定的技术限制。使用不同技术和不同抗原制剂的替代测定的方法被开发出来。其中大部分是使用ELISA技术（图5），如英国RsR公司商品化的重组人源化胎儿和成人型混合AChR受体的竞争抑制法ELISA检测，对诊断重症肌无力具有与RIPA相似的、良好的敏感性和特异性，可以定量测定抗-AChR抗体滴度（但检测区段往往较放射免疫法窄）。步骤复杂耗时长，操作要求条件较高。
当拟似重症肌无力诊断，抗AChR抗体和MuSK抗体检测均为阴性，还可以使用活细胞CBA法（图5）。其AChR抗原以更天然的形式和更高丛集性表达时，可检测到对可溶性AChR亲和力低的抗AChR抗体。然而，这种CBA测试不是常规可用的，因为CBA没有生产商业试剂盒并且测试过程复杂[11]。
荧光免疫沉淀测定（FIPAs）（图5）使用荧光蛋白直接标记不同的抗原[12]，首先报告用于神经脊髓炎的水通道蛋白-4抗体的测定。这种方法的优点是可以使用不同颜色的荧光标记蛋白，以便同时检测两种或两种以上的抗体。例如EGFP-AChR和Mcherry-MuSK的抗体在中国重症肌无力患者同时被测量。FIPAs的定量结果与RIPA方法结果高度相关。
总之，对于抗AChR抗体的测定，CBA法测定似乎是最敏感的。但抗体滴度定量测定对于重症肌无力病情监测很重要，RIPA，定量非放射性方法（如FIPA，胎儿和成人型AChR受体混合抗原的竞争抑制法ELISA法），显得很重要。
2. 抗MuSK抗体测定：对于抗AChR抗体阴性的重症肌无力患者，使用特异性RIPA或ELISA检测抗MuSK抗体IgG4型抗体。抗MuSK抗体阳性的MG阳性通常比AChR抗体阳性重症肌无力患者更多的累及球部症状。
3. 其他抗体的检测：LRP4的IgG型抗体的存在已被多个实验室证实，没有商品化试剂盒提供。抗LRP4抗体通常通过表达整个重组蛋白的CBA方法来检测。ELISA也被使用，尽管CBA方法和ELISA方法之间的关联一致性尚不清楚。LRP4是一种具有未知表位的大蛋白，仅检测少数肽段的抗体是不够的。抗LRP4抗体的检测并不是MG的确定地致病抗体诊断[13]。
抗titin抗体通常由商品化ELISA试剂盒检测，比RIPA法更灵敏[14]。抗RyR抗体可提示胸腺瘤和重症重症肌无力的存在[15]。虽然抗Ryr抗体的检测由一些诊断实验室提供，但没有合格商品化检验的试剂盒，该抗体在临床实践中较少进行使用。
4. 抗体滴度的监测价值：除了对重症肌无力中抗体的诊断价值外，抗体检测在重症肌无力患者后续治疗中很有用，这往往被国内医生和患者忽视。一般而言，抗AChR抗体水平与个体重症肌无力患者之间的临床状态不相关：即有轻症重症肌无力患者可以高抗体滴度，严重重症肌无力患者抗体滴度可以低者。然而，在单个个体内，连续的抗体监测在相对较短的时间内与疾病的临床状态演变密切相关，特别是在血浆交换或免疫治疗后，以及在长期队列研究（如胸腺切除术）中被确定[16]。同样，抗MuSK抗体显示出与个体临床状态变化的良好相关性[17]。
随着人口老龄化的加剧老年起病的重症肌无力会越来越多，抗体检测在协助诊断和对治疗疗效的判断中是非常重要的技术支撑、充分理解不同检测技术的原理和特性对准确临床判断十分重要。
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