老年心血管病患者尿液中8-oxoGsn衰弱生物标志物的研究
编译：刘倩
校审：蔡剑平
（译自：Free Radical Biology and Medicine 152 (2020) 248-254）
【摘要】衰弱的诊断通常是主观的，临床医学需要客观的生物标志物。尿中8-oxo-7,8-二氢-2′-脱氧鸟苷（8-oxodGsn）和8-oxo-7,8-二氢鸟苷（8-oxoGsn）是两种尚未被深入研究的衰老生物标志物。本研究择老年心血管疾病患者508例（平均年龄75.0±6.5岁，男性50.8%）。脆弱性通过Fried表型进行评估（强健：0分；衰弱前：1-2分；衰弱：3-5分）。采用改进的超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS/MS）测定尿中8-oxoGsn和8-oxodGsn的浓度。测定尿肌酐（Cre）以校正8-oxoGsn和8-oxodGsn水平。根据Fried表型评分，健康者、衰弱前者和衰弱者的比例分别为20.5%（104/508）、53.9%（274/508）和25.6%（130/508）。3组间尿8-oxoGsn/Cre差异有显著性（P＜0.001），而尿8-oxoGsn/Cre（P=0.600）无显著性差异。单因素和多因素logistic回归分析显示年龄（优势比=1.090，P＜0.001）、收缩压（OR=0.981，P=0.008）、8-oxoGsn/Cre（OR=1.203，P=0.007）、血红蛋白（OR=0.980，P=0.007）和钠（OR=0.915，P=0.044）与衰弱程度独立相关。根据最大Youden指数，8-oxoGsn/Cre在3.879μmol/mol的最佳临界值下，识别脆弱性的敏感性和特异性分别为53.08%和71.96%。尿8-oxoGsn是公认的RNA氧化标志物，这与老年心血管疾病患者的衰弱程度独立相关。而尿中8-oxodGsn与衰弱程度无明显相关性。为了获得更好的体弱诊断性能，需要进一步探索不同病理生理途径的生物标志物。
【关键词】衰弱；生物标志物；氧化应激；8-氧化鸟苷；8-氧化脱氧鸟苷
随着全球老龄化问题的日益突出，衰弱已成为医疗卫生领域最重要的问题之一[1]。约20%的老年患者存在衰弱，这是一个复杂的状态，在应激事件后，易感障碍的分辨率较差[2]。已经证明，衰弱的病人有更高的风险和不良后果，包括跌倒、谵妄、残疾、再入院和死亡[3]。衰弱的诊断通常是主观的，并且基于几个量表，有时是不一致的。因此，对该病的生物标志物的研究越来越有必要。
心血管疾病已成为老年患者慢性疾病的第一杀手，以前的研究表明，8-氧代-7- 8-二氢鸟苷（8-oxoGsn）是最容易氧化的RNA氧化产物[4]。研究表明，多种病理生理途径与心血管疾病和衰弱相关[5]。最受关注的衰弱生物标志物是那些与炎症反应[6], 营养、免疫、激素[7]、氧化损伤产物、抗氧化剂等有关的标志物[8-10]。由于氧化应激是衰老的一个重要因素[11]，氧化应激生物标志物如8-羟基-2'-脱氧鸟苷（8-oxodGsn）[12]，活性氧代谢物（d-ROM）[13]，氧化型谷胱甘肽[14]的衍生物与衰弱性密切相关。然而，最近的研究表明，氧化应激生物标志物包括活性氧/氮、氧化性DNA损伤和总抗氧化能力与衰弱无关[7]。这些结论的不一致可能是由于氧化应激产物的不同来源。
据我们所知，目前还没有研究的重点是衰弱和比DNA更容易被氧化的RNA氧化产物8-oxoGsn[15,16]。以前的研究表明8-氧代-7,8-二氢鸟苷（8-oxoGsn）是RNA最容易氧化的产物[17]。8-oxoGsn在RNA中的积累可以改变哺乳动物细胞的蛋白质合成，导致突变蛋白的积累[18]。RNA氧化参与了许多疾病的发生和发展，特别是慢性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧硬化症、糖尿病、癌症等[19-22]。组织细胞中含有8-oxoGsn的RNA被酶降解为8-oxoGsn并释放到血液中，血液循环到肾脏并随尿液排出。由于尿中的8-oxoGsn是通过氧化RNA代谢在全身组织中产生的，可以用来评价全身氧化应激引起的氧化损伤程度。
我们团队先前的研究表明，尿8-oxoGsn是一种潜在的生物标记物，可用于确定一个人的生理年龄，并识别患有年龄相关性疾病的高危人群[23]，这就说明尿8-oxoGsn可能是一种很有前途的衰弱生物标记物。同时，DNA氧化损伤引起的8-氧化脱氧核糖核酸是公认的氧化应激生物标志物[24]。
8-oxoGsn和8-oxodGsn分别是RNA和DNA的主要氧化产物，是氧化应激生物标志物。然而，目前还没有研究探讨这两种生物标志物与衰弱的相关性及其对衰弱的诊断价值。本文旨在：1. 探讨老年心血管疾病患者核酸氧化应激与衰弱的关系；2. 比较DNA和RNA氧化应激生物标志物8-oxodGsn和8-oxoGsn对衰弱的诊断价值。
一、对象和方法
1. 入组标准：我们招募了2018年9月至2019年2月在北京医院心内科住院的老年患者。纳入标准为（1）≥65岁，（2）住院。排除标准为（1）不能配合评估（如严重认知障碍、耳聋、生命体征不稳定等），（2）入院后24小时内早晨未取新鲜尿液样本，（3）无知情同意书。
本研究符合赫尔辛基宣言,并经北京医院伦理委员会（编号2018BJYYEC-121-02）批准。所有参与者都给出了书面知情同意书。
2. 数据收集：通过访谈和电子健康档案收集患者的人口学信息和病史。血液实验室检查的入院结果，包括血红蛋白、白细胞（WBC）、血浆肌酐、尿酸、白蛋白、血脂和电解质，也从电子健康记录中收集。研究数据使用北京大学临床研究所的REDCap电子数据采集工具进行管理[25]。
3. 临床样本的收集及保存：我们通过访谈和电子病历收集患者的人口学信息和病史。血液实验室检查的入院结果，包括血红蛋白、白细胞（WBC）、血浆肌酐、尿酸、白蛋白、血脂和电解质，也从电子健康记录中收集。研究数据使用北京大学临床研究所主持的研究电子数据采集（REDCap）进行管理[25]。
4. 衰弱性评估：所有患者入院后24小时内用Fried表型客观评价脆性[26]。五项衰弱性标准是：（1）一年内的体重下降超过5%或大于3kg；（2）通过流行病学研究中心抑郁量表中的两个问题（项目7和20）确定的自我报告的疲劳[27]；（3）肌力下降：由支配手的握力定义的衰弱，根据体重指数（BMI）和性别进行调整（男性：BMI≤24kg/m2时不超过29kg，24-28kg/m2时不超过30kg，BM＞28kg/m2时不超过32kg；女性：BMI≤23kg/m2时不超过17kg，23-26kg/m2时不超过17.3kg，26-29kg/m2时不超过18kg，BMI＞29kg/m2时不超过21kg；（4）躯体功能下降：慢速行走，定义为4米＜0.65米/秒（男性小于173厘米，女性小于159厘米）或小于0.76米/秒（男性大于173厘米，女性大于159厘米）；（5）躯体活动量降低，定义为男性每周小于383千卡，女性每周小于270千卡。使用的cut-off值是Fried等人提出的[26]。如果患者不符合任何一个标准，则将其分为健壮型；如果满足一个或两个标准，则将其分为前衰弱型；如果满足三个或更多标准，则将其分为衰弱型[26]。
5. 尿液中肌酐、8-氧化鸟苷和8-氧化脱氧鸟苷浓度检测：每名入组病人于入院后24小时内从中流尿液中提取新鲜尿液样本。尿液样本在分析前保存在-80℃。样品在4℃下解冻，然后在7500g下离心5分钟。使用上清液进行分析。8-oxoGsn（＞98%纯度）、8-oxodGsn（＞98%纯度）和同位素标记的8-oxo-[15N5]dGsn水平是从剑桥同位素实验室（美国马萨诸塞州安多佛）获得的。8-oxo-[15N213C1]Gsn从多伦多研究化学公司（加拿大北约克）采购，HPLC级醋酸铵从Fisher Scientific（美国加利福尼亚州Carlsb）购买，HPLC级甲酸从阿拉丁（美国加利福尼亚州Ontario）购买，高效液相色谱级溶剂从默克（德国Darmstadt）获得。用于分析的水为Milli-Q水质，在18.2MΩ下去离子。
用改进的UPLC-MS/MS测定尿液中8-oxoGsn和8-oxodGsn的含量。所有样本均采用安捷伦1290UPLC仪器进行分析，该仪器配备有带有喷射电子喷雾电离（ESI）源的安捷伦三重四极质谱仪和iFunnel（安捷伦6490；美国加利福尼亚州圣克拉拉市）。实验结果表明，0.1%甲酸与5mM醋酸铵（A）和0.1%甲酸甲醇（B）组成的流动相具有较好的分离效果，在35℃的Agilent C18（3μm，3.00×100mM）柱上实现了UPLC分离，流速为0.4ml/min，梯度洗脱步骤为：0～3min（90%～70%A），3～4min（70%～2%A），4～5min（2%A），5～5.01min（2%～90%A），5～7min（90%A）。总跑步时间是7分钟。
在正离子检测模式下进行质谱数据采集。雾化器的最佳氮气值为30psi，ESI针阀电压为2000v，干气和鞘气的温度分别设置为200℃和400℃，流速分别为16和12l/min。监测多反应模式（MRM）进行定量分析。低压和高压射频分别为50伏和120伏。8-oxodGsn、8-oxodGsn-内标（IS）和8-oxoGsn-IS的MRM跃迁分别为m/z284→168，m/z289→173，m/z300→168，m/z303→171。8-oxodGsn和8-oxodGsn-IS的碰撞能量设置为10ev，8-oxoGsn和8-oxoGsn-IS的碰撞能量设置为14v。使用日立7600自动生化分析仪（日本东京日立）测定肌酐浓度。
6. 数据统计：Kolmogorov-Smirnov检验用于检验正态分布的连续变量。数据描述为平均值±标准差或频率（百分位数）。当考虑三组时，采用单因素方差分析对正态分布变量进行比较。Tukey的HSD测试与方差分析（post-hoc analysis）相结合，用来比较彼此之间的差异。卡方检验用于两组或三组分类数据的比较。采用单变量和多变量Logistic回归模型，确定衰弱性的独立相关因素。除单因素分析中P值<0.10的两个因素和性别外，所有因素均进入多变量模型。两个因素，即舒张压和低密度脂蛋白，没有纳入多变量模型，以避免分别与收缩压和总胆固醇共线。然后，在Akaike信息准则（AIC）的指导下，逐步进行相关因子选择。AIC最小的模型被认为是最佳拟合模型。logistic回归模型的结果显示为优势比（ORs）和95%置信区间（95%CIs）。计算受试者操作特征（ROC）曲线，以估计8-oxoGsn/Cre和8-oxodGsn/Cre与衰弱相关的曲线下面积（AUCs），定义为Fried评分≥3。使用DeLong等人的方法对AUC进行比较[28]。用最大Youden指数确定8-oxoGsn/Cre的最佳临界点。P值＜0.05被认为具有统计学意义。所有分析均使用R软件程序3.5.3版进行。
二、研究结果
1. 研究资料分析结果：本研究共纳入508例老年患者。男性占50.8%（258/508），平均年龄75.0±6.45岁。根据Fried表型评分，这些受试者的健壮比率、衰弱前比率和衰弱比率分别为20.5%（104/508）、53.9%（274/508）和25.6%（130/508）。年龄（P＞0.001）、文化程度（P=0.017）、心率（HR，P=0.015）、收缩压（SBP，P=0.015）三组间有显著性差异。衰弱组在糖尿病（P＜0.001）、房颤（P=0.003）、心力衰竭（P＜0.001）和中风（P=0.006）中的比例最高。所有受试者的人口统计学和临床特征的详细信息见表1。
2. 尿8-氧化鸟苷和8-氧化脱氧鸟苷水平和血浆标志物水平：尿生物标志物方面，8-oxoGsn（P=0.011）和8-oxoGsn/Cre（P＜0.001）在三组间有显著性差异。8-oxodGsn（P=0.379）和8-oxodGsn/Cre（P=0.600）在三组之间无显著性差异。至于传统的血液生物标志物，血红蛋白、白蛋白和钠在两组之间有显著性差异（均P＜0.001）（表2）。图1显示，衰弱前组的8-oxoGsn/Cre显著高于健康组（3.64-1.52umol/mol vs 3.16-1.21μmol/mol，P=0.025），衰弱组8-oxoGsn/Cre显著高于衰弱前组（4.38-1.96umol/mol vs 3.64-1.52umol/mol，P＜0.001）。对于健壮组和衰弱前组，女性的8-oxoGsn/Cre高于男性（分别为P=0.007和P=0.001）。女性在健壮组（P=0.044）和衰弱前组（P=0.002）中的8-oxodGsn/Cre值也高于男性。对于衰弱组，8-oxoGsn/Cre（P=0.735）和8-oxodGsn/Cre（P=0.464）均无性别差异。
注：数值显示为平均值±标准偏差。* P＜0.05，强健vs衰弱前期，† P＜0.05，强健vs衰弱‡ P＜0.05，衰弱前期vs衰弱
图1. Comparison of 8-oxoGsn/Cre and 8-oxodGsn/Cre results for different frailty groups
3. 各个变量对衰弱的影响的回归分析：根据单因素Logistic回归结果，我们发现年龄（P＜0.001）、心率（P=0.006）、收缩压（P=0.008）、糖尿病（P=0.022）、心房颤动（P=0.001）、心力衰竭（P＜0.001）、中风（P=0.002）、8-oxoGsn/Cre（P＜0.001）、血红蛋白（P＜0.001）、总胆固醇（P=0.047）、白蛋白（P＜0.001），钠（P=0.001）与Fried评分≥3分的衰弱程度有显著相关性。通过多因素Logistic回归，我们发现年龄（OR=1.081，P＜0.001）、收缩压（OR=0.985，P=0.048）、8-oxoGsn/Cre（OR=1.179，P=0.019）和血红蛋白（OR=0.983，P=0.046）与老年患者的衰弱性呈独立相关（表3）。
注：所有单变量分析P值小于0.05的协变量均进入多变量模型
4. 8-oxoGsn/Cre和8-oxodGsn/Cre对衰弱的诊断价值：关于8-oxoGsn/Cre和8-oxodGsn/Cre对衰弱的诊断价值，8-oxoGsn/Cre和8-oxodGsn/Cre之间的ROC的AUCs以确定受试者的衰弱程度有显著差异（0.663对0.524，P＜0.001，图2）。用最大Youde-指数法测定8oxoG/Cre的最佳截留值为3.879μmol/mol，对53.08%μmol/mol的8oxoG/Cre的敏感性和特异性分别为53.08%和71.96%。
图2. The AUCs of the ROC curve for 8-oxoGsn/Cre and 8-oxodGsn/Cre against Fried scale ≥3 in the diagnosis of frailty
三、讨论
我们的研究表明，在老年心血管疾病患者中，尿8-oxoGsn/Cre是一个在年龄和其他重要临床因素调整后与衰弱独立相关的因素。然而，作为DNA的主要氧化产物的尿8-氧化脱氧鸟苷没有显示出与衰弱性的相关性。RNA氧化产物的弱诊断价值优于DNA，但二者均不足以作为衰弱性的临床诊断指标。
我们以前对1126名中国普通人群（21～90岁）的研究表明，8-oxoGsn与年龄的相关性强于8-oxodGsn（8-oxoGsn，r=0.580，p＜0.001；8-oxodGsn，r=0.337，p＜0.001），这表明8-oxoGsn是一种比8-oxodGsn更好的衰老生物标志物[23]。这一结果与我们目前的研究结果一致，即8-oxoGsn比8-oxodGsn是一种更好的生物衰弱性标志物。在已发表的文章中，男性8-oxoGsn/Cre在71-80岁时为2.62±0.89μmol/mol，女性在71-80岁时8-oxoGsn/Cre为2.99±0.80μmol/mol[23]，与正常参考值相比，采用同样的检测方法，我们的受试者在平均年龄为75.0±6.45岁时的平均值为3.73±1.64μmol/mol，明显升高。同样的现象也出现在8-oxodGsn中。尽管我们的研究人群来自心血管疾病住院患者，但非衰弱组的性别差异显示出与一般老年组相同的趋势，这表明女性尿中8-oxoGsn和8-oxodGsn的水平显著高于男性[23,29]。8-氧化的鸟苷和8-氧化脱氧鸟苷水平在女性中的增加可能是由于雌激素的产生减少，这可能导致抗氧化能力降低[23]。众所周知，铁通过Fenton反应产生羟基自由基而引起氧化应激[29]。女性在更年期期间铁含量的增加可能是氧化应激增加的另一个原因。然而，在我们的受试者的衰弱组中，没有观察到8-oxoGsn和8-oxodGsn之间的性别差异，这可以解释为更多缺陷的累积效应掩盖了性别对氧化应激的影响。
我们的研究发现，肌酐校正的尿8-oxoGsn与衰弱是独立相关的。这一发现与以前的研究相一致，即氧化应激的生物标志物常常与衰弱状态相关[30,31]。至于抗氧化剂标志物，维生素E和总抗氧化潜能显著降低与衰弱有关[32,33]。氧化应激可能通过炎症导致衰弱，这是一个系统的生理过程，可能涉及多个器官，导致年龄增加的慢性疾病和衰弱的风险增加[34]。此外，氧化损伤直接导致衰弱的表征-肌肉质量和功能的减少。骨骼肌消耗大量氧气，并能产生大量ROS主要是指O2的一类单电子还原产物，包括超氧阴离子、羟基自由基、H2O2和单线态氧。其中，羟基自由基和单线态氧参与了DNA和RNA的8-oxodGsn和8-oxoGsn的形成[35]。ROS水平的增加被认为是肌肉数量和质量损失的共同决定因素[36]。
虽然我们认为ROS与衰弱性有关，但我们发现DNA的氧化产物的水平与衰弱性没有显著相关性，这一发现与最近的研究结果一致，表明DNA氧化损伤与衰弱无关[7]。相比之下，两项小样本研究显示，衰弱组8-oxodGsn增加[12, 33]，不同研究结果之间的不一致可能是由于这两项研究的样本量和ELISA检测方法的低特异性[37]。值得注意的是，我们建立了一种灵敏度高、特异性强的UPLC-MS/MS方法[23]。同时加入同位素内标，减少了样品前处理和质谱检测的误差。因此，我们的结果更可靠。
就我们所知，目前没有研究评估RNA氧化应激与衰弱的结果分析。我们首次报道8-oxoGsn在不同衰弱程度的组间有显著性差异。我们的实验室揭示了8-oxoGsn在RNA中的积累可以改变哺乳动物细胞的蛋白质合成，从而导致突变蛋白的积累的机制[18]。此外，我们的团队报告，RNA氧化损伤存在于慢性肾脏疾病患者中，随着疾病的恶化而增加。据报道，阿尔茨海默病和帕金森病患者的脑脊液中8-oxoGsn的含量升高[38]。这些结果表明，8-oxoGsn与一些老年人发病率高的慢性病有关。因此，间接支持8-oxoGsn可能是一个很好的衰弱生物标志物，衰弱在老年人中也有较高的发病率，特别是在慢性病较多的老年人中。与其他现有的氧化应激生物标志物相比[40-42]，我们测量尿中8-oxoGsn的方法更简单、更便宜。一次样品测试所需时间不超过10分钟。此外，其他现有的氧化应激生物标志物主要是从血浆和组织中检测出来的，这些生物标志物的采集成本高并具有损伤性。我们团队先前的研究表明，8-oxoGsn在尿液中的含量远高于血浆或其他组织[43-45]。这些证据表明尿中8-oxoGsn作为氧化应激的生物标志物优于血浆中的8-oxoGsn。
我们发现尿中8-oxoGsn而不是8-oxodGsn与衰弱有关，这可能是因为RNA比DNA更容易受到ROS的攻击。大多数RNA分子位于细胞质中，而DNA通常位于细胞核内。核糖核酸也位于离软骨细胞较近的地方，因为它们都位于细胞质中，所以它们能产生ROS而不是DNA。RNA受到更多ROS的攻击，产生更多的氧化产物。此外，大多数RNA分子是单链的，不与氢键结合，并且不受组蛋白的保护[46]。因此，RNA比DNA更容易被氧化。事实上，基于氧化鸟嘌呤的RNA损伤是DNA损伤的10倍[15,16]。尿中8-oxoGsn水平高于8-oxoGsn，导致8-oxoGsn对衰弱发育和衰老更为敏感。
8-oxoGsn在衰弱的诊断中表现一般（53.08%的敏感性；71.96%的特异性），尽管两者有独立的联系，因此我们不能认为它是一个好的诊断指标。然而，8-oxoGsn的这种表现并不令人惊讶，因为据我们所知，还没有关于任何生物标志物对衰弱的诊断价值的报告。一个合理的解释是，衰弱反映了多维缺陷的累积负担[47]，其中氧化应激是参与多种发病过程的因素之一[2]。因此，8-oxoGsn作为一种单一的生物标志物不能很好地诊断衰弱。结合来自不同发病途径的生物标志物可能是必要的，以创造一个客观的诊断工具和良好的性能。此外，目前还没有诊断衰弱的金标准，Fried评分只是常用的临床标准之一。因此，无论是临床诊断标准还是实验室诊断标准都有待进一步探讨。
与本研究相关的几个局限性值得注意。首先，尽管本研究中使用的Fried表型被广泛应用并被接受为诊断标准，但对于衰弱程度的测量尚无“金标准”。第二，我们的研究是一个横截面的研究，因此我们不能提供老年心血管疾病患者脆弱性生物标志物的任何预测值。第三，住院老年心血管疾病患者的研究对象不能完全代表一般老年人群，因此有必要在更大范围的普通老年人群中进行进一步的研究。
尿8-oxoGsn是公认的RNA氧化标志物，与老年心血管疾病患者的衰弱程度独立相关。而尿中8-氧代葡萄糖则与衰弱无明显的相关性。今后还应探索更多来自不同病理组织学途径的生物标志物。
基金项目资助：这项工作得到了北京市科委（D18110000218003）、中国医学科学院非营利中央研究所基金（No.2019PT320013）和CAMS医学科学创新基金（No.2018-I2M-1-002）的资助。
竞争利益说明：作者声明他们没有相互竞争的利益。
致谢：我们衷心感谢小飞博士、李和欣女士、徐思源女士和唐小坤女士（中国北京国家老年医学中心北京医院生物库）对所有样品的储存和管理提供的专业和友好的支持。
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