分子生物学技术在胚胎植入前遗传学检测中的临床应用价值

随着分子生物学技术日新月异的发展，在胚胎植入前遗传学诊断领域得到广泛的应用，胚胎植入前遗传学检测（Preimplantation Genetic Testing，PGT）技术的出现使生殖科医生能够对胚胎进行染色体/基因层面的检测，从而有利于进一步优选胚胎。通过PGT技术的应用，有效地提高了人类辅助生殖技术的结局和适用范围，给一些染色体病的携带者、单基因遗传病患者、高龄、反复自然流产以及反复种植失败女性带来了生育健康后代的新希望。

胚胎植入前遗传学检测（PGT）也是防治出生缺陷的手段之一。PGT技术俗称第三代试管婴儿技术，是在人类卵细胞体外受精的基础上发展起来的遗传学检测技术，主旨是阻断染色体疾病和单基因遗传病的垂直传递。PGT的前身是胚胎植入前遗传学诊断（Preimplantation Genetic Diagnosis）和胚胎植入前遗传学筛查（Preimplantation Genetic Screening）。2017年美国生殖遗传学会（American Society for Reproductive Medicine，ASRM）将PGD和PGS更名为胚胎植入前遗传学检测PGT，包括三个方面：胚胎植入前非整倍体检测（Preimplantation Genetic Testing for aneuploidies，PGT-A），胚胎植入前单基因遗传病检测（Preimplantation Genetic Testing for monogenic/single gene defects，PGT-M），胚胎植入前染色体结构重排检测（Preimplantation Genetic Testing for chromosomal structural rearrangements，PGT-SR）^[1]。自1990年世界上第一例因性连锁疾病应用PGD的婴儿诞生以来，随着显微操作技术和单细胞遗传诊断技术的进步，PGD的临床应用数在全球范围内逐年上升，国际相关的生殖遗传学会针对PGD和PGS发布了一系列临床操作指南，并不断进行修定。如欧洲人类生殖遗传学会（European Society of Human Reproduction and Embryology，ESHRE）于2005年发布PGD/PGS临床操作指南，2008年修正PGD操作流程及实验质量保证指南，2011年出版覆盖PGD技术多个方面的指南文件包含了PGD/PGS的适应人群、排除或纳入标准^[2]。2018年中华医学遗传学杂志发表的《胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识》明确提出了PGD和PGS适应用人群和检测方法^[3]。

PGT检测的常用方法有荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）、聚合酶链式反应技术（Polymerase Chain Reaction，PCR）、微阵列分析和二代测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）。对于易位的两个染色体，FISH检测常使用着丝粒、特异位点及亚端粒探针，且随着探针的日趋商业化，FISH技术迅速得到推广应用。但FISH技术的局限性是仅对有限的染色体（10-12对）进行分析，另外对复杂的平衡易位不易做出正确的诊断。同时探针的杂交失败和信号的重叠、分离等都可能影响诊断结果^[4]。在《胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识》中也明确提到，胚胎非整倍体筛查，不建议采用FISH技术。PCR可对染色体位拷贝数进行分析，也可用于胚胎植入前单基因疾病检测，同时也用于人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）配型、性连锁基因和性别鉴定等^[7]。但是单细胞 PCR 的局限性主要是容易发生等位基因脱扣（allele drop-out，ADO），发生率可达10%~25％，严重影响分析结果的准确性^[10]。基于PCR方法，对胚胎植入前单基因病检测有一定的误诊率，准确率为93.7%，真阳性率为99.2%，真阴性率为80.9%^[5]。微阵列技术和二代测序技术是近年来应用于PGT的新技术。微阵列技术主要有基于微阵列的比较基因组杂交（Microarray-based Comparative Genomic Hybridization，aCGH）和单核苷酸多态微阵列（single nucleotide polymorphism array，SNP array）。结合全基因组扩增技术（whole whole genome amplificatio，WGA），aCGH可检测DNA中序列拷贝数变异（copy number variant，CNV）和染色体非整倍性；SNP array可应用已知的核苷酸序列作为探针与待测DNA序列进行杂交，通过检测信号进行定性、定量分析，也可检测胚胎染色体非整倍性。相比array CGH，SNP array有更高的分辨率，能检测单亲二倍体、三倍体等，通过SNP连锁关系构建单体型，判断胚胎是否携带单基因病致病单体型。但两种方法仍存在缺点，如不能检测平衡性基因组易位及倒位，同时胚胎活检后的单细胞DNA量无法满足进行微阵列分析的要求；而全基因组DNA扩增的产物保真度不能实现100％；这些都可能会影响到微阵列诊断分析的准确性。NGS技术可通过不同的检测和分析策略，完全有可能实现获得植入前胚胎从染色体异常到单基因突变甚至是新发突变等各个层面的信息^[4]。全基因组低覆盖度测序，可对胚胎活检样本进行染色体非整倍体、4M以上的CNV检测，提供夫妻明确核型诊断信息，胚胎部分区域检测精度可以达到1M。2019年有文章报道从胚胎培养液中提取胚胎游离的DNA，对胚胎染色体进行非整倍体检测^[6]。这一技术的应用，在保证检测结果准确度的同时保持胚胎的完整性，降低了胚胎活检造成的损伤而影响胚胎植入后不良妊娠结局的风险。胚胎植入前单基因遗传病检测方面，根据SNP连锁关系构建致病单体型，采用目标序列捕获技术和全基因组测序技术可对胚胎进行高通量测序，判断胚胎是否携带致病单体型^[7]。采用NGS技术，能更好地实现自动化检测，如配置自动化建库仪、计算机，实现自动化报告解读和发放。

在《胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识》中虽然提到对于胚胎是否携带染色体结构易位，可以不做检测，近年利用NGS检测染色体易位携带者的胚胎是否携带染色体易位的方法不断被报道。如2016年，采用显微切割的方法确定易位携带者断点区域，根据断点上下游SNP信息判定胚胎是否携带染色体易位^[14]。虽然该方法可以排除染色体结构异常的胚胎，但显微切割染色体技术受操作人员的影响较大，限制了其广泛应用。2017年，Jiawei Xu等人，利用染色体非整倍体胚胎分析断点，根据断点附近的连锁关系分析染色体正常倍型的胚胎是否发生染色体易位^[15]。虽然该方法较染色体显微切割容易，但检测前提需要特定的非整倍体胚胎进行辅助判断。如果没有能作为参照的非整倍体胚胎，则不能对胚胎进行染色体易位的检测。

中国大陆首例PGT在1999年在中山大学附属第一医院完成。随着技术的飞速进步，我国在PGT临床应用研究技术水平达到国际先进水平，在国际上首次建立全新植入前胚胎遗传学诊断方法—MARSALA^[6]成绩非凡。PGT技术与ICSI技术，均人为干预了自然选择过程，对其后代出生缺陷发生率的影响尚需要更多的高质量研究来进行客观评价。

随着人类辅助生殖技术与更多新技术、新学科的交叉，人类辅助生殖技术的未来存在无限的可能，但每一项新技术的出现又会带来更多有关伦理、社会和法律方面的争议。在未来，我们必须推进人类辅助生殖技术相关基础和临床研究，开展人类辅助生殖技术安全性研究，加强对人类辅助生殖技术的监管，以便建立一个高效、安全的人类辅助生殖技术临床应用体系。

参考文献

1. The International Glossary on Infertility and Fertility Care, 2017. Hum Reprod 2017 Sep 1; 32(9): 1786-1801 PMID:29117321

2. 黄荷凤主编，植入前遗传学诊断临床实践，上海交通大学出版社

3. 胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识，中华医学遗传学杂志2018年4月第35卷第2期，Chin J Med Genet, April 2018, Vol. 35, No.2

4. 孙莹璞，重视植入前遗传学诊断及筛查技术的安全性。《中国实用妇科与产科杂志》2016年第3期

5. Jos Dreesen, et al. Evaluation of PCR-based preimplantation genetic diagnosis applied to monogenic diseases: a collaborative ESHRE PGD consortium study. Hereditary Cancer in Clinical Practice, December 2013, 11:10

6. Huang L. Noninvasive preimplantation genetic testing for aneuploidy in spent medium may be more reliable than trophectoderm biopsy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Jun 24. pii: 201907472. doi: 10.1073/pnas.1907472116.

7. Yanwen Xu, et al. Embryo Genome Profiling by Single-Cell Sequencingfor Preimplantation Genetic Diagnosis in a β-Thalassemia Family

8. Liang Hu, et al. Reciprocal Translocation Carrier Diagnosis in Preimplantation Human Embryos. EBioMedicine. 2016 Dec; 14: 139-147. doi: 10.1016/j.ebiom.2016.11.007. Epub 2016 Nov 5.

9. Jiawei Xu, et al. Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human preimplantation embryos. Proc Natl Acad Sci USA. 2017 Oct 10; 114(41): E8695-E8702. doi: 10.1073/pnas.1715053114. Epub 2017 Sep 27

10. Yan L, Huang L, Xu L, et al. Live births after simultaneous avoidance of monogenic diseases and chromosome abnormality by next-generation sequencing with linkage analyses. Proc Natl Acad Sci USA. 2015; 112(52): 15964-9.