人类辅助生殖体外受精 — 胚胎移植实验室技术与临床应用价值

作者：陈曦  田莉

单位：北京大学人民医院

世界范围内约有1/6的夫妇面临着不孕症的困扰，越来越多的不孕夫妇需要借助辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）治疗来获得临床妊娠，并最终达到生育健康婴儿的目的^[1]。源自中国国家疾病预防控制中心的数据报告显示，2016年，中国有31万多新生儿来自ART治疗，占全部新生儿的1.69%^[2]。体外受精-胚胎移植实验室（in vitro fertilization and embryo transfer, IVF 实验室）技术的实施是ART治疗成功的保证。体外受精-胚胎移植的核心实验室技术包括：体外受精技术、胚胎培养技术、胚胎移植技术、配子和胚胎冻融技术、种植前胚胎遗传学检测技术及各种衍生实验室技术^[3,4]。

一、体外受精技术

体外受精方式主要包括常规体外受精（conventional in vitro fertilization，CIVF）技术和卵胞浆内单精子显微注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）技术，此外，有些IVF实验室目前也采用一种短时受精补救性ICSI（rescue-ICSI）体外受精技术。

1. CIVF技术：是将不孕症夫妇的卵子与精子取出体外，在体外培养体系中受精并发育成胚胎的技术。CIVF操作是直接在培养卵冠丘复合体（oocyte corona cumulus complexes,OCCCs）的培养液内加入优选后的精子，使精卵结合发生受精，发育至胚胎。CIVF授精技术主要解决体内精卵不能相遇问题，其临床应用价值在于解决女性因素不孕，针对以下患者实施CIVF技术：（1）排卵异常患者：包括① 小卵泡排卵患者；② 优势卵泡不破裂，不能正常排卵的LUFS患者；③ 多囊卵巢综合征患者；④ 卵巢功能储备下降，需要进行多次促排卵治疗积攒胚胎进行胚胎移植患者。（2）输卵管因素不孕患者：以输卵管造影及腹腔镜检查结果作为判断输卵管功能的标准，以下情况可考虑进行IVF-ET治疗：① 双侧输卵管阻塞；② 输卵管部分通畅；③ 输卵管积水；④ 输卵管与周围组织粘连；⑤ 输卵管结核；⑥ 输卵管发育异常；⑦ 输卵管切除。（3）子宫内膜因素不孕患者：轻、中度子宫内膜异位症患者经多次人工授精失败，或重度子宫内膜异位症患者。（4）不明原因不孕患者。（5）免疫性不孕患者，包括临床常见的抗精子抗体阳性、抗磷脂抗体阳性等患者。除女性因素不孕外，IVF-ET也被用来对少、弱精子症经多次人工授精失败的不孕夫妻进行助孕治疗^[5,6]。

2. ICSI技术：ICSI授精是CIVF授精技术的衍生和发展，是将精子通过显微注射技术直接注入到卵胞质内，实现体外受精的目的。ICSI技术临床应用价值在于解决男方严重少精子症、弱畸精症、少弱畸精症、梗阻性无精症或睾丸发育不良、免疫性不孕、前次周期IVF受精失败的患者，此外为避免精子DNA污染，ICSI也被应用于需要进行植入前胚胎遗传学检测（PGT）的患者卵子的体外受精^[6,7]。

由于ICSI较IVF受精率高，可以得到更多胚胎以供移植时选择，国外生殖中心采用ICSI方式进行体外受精的比例逐年增加^[8]。随着对ICSI及辅助生育安全性认识的提高，人们发现，ICSI可能较IVF更容易产生出生缺陷，尿道下裂、多指（趾）或并指（趾）的新生儿缺陷在ICSI患者中比例明显增高；ICSI过程中，对配子过多的体外操作是否会提高印迹基因疾病发生风险，也日益引起人们关注；此外对于那些因Y染色体AZF区基因微缺失引起的无精或少精症患者，ICSI技术帮助他们解决不孕症烦恼的同时，也将Y染色体遗传缺陷带给了他们的男性后代。研究证实，对于非男性因素导致不孕的患者，ICSI与IVF相比，并没有改善受精后的妊娠结局，而相同周期ICSI费用比IVF高，因此，临床工作中严格把握ICSI治疗指征非常必要^[9]。

3. Half-ICSI和Rescue-ICSI技术：Half-ICSI授精技术即将半数卵子进行IVF常规授精，半数卵子进行ICSI授精；Rescue-ICSI授精技术是我国学者创建并在全国普遍开展起来的体外授精方法，在加精后5小时左右，剥除OCCCs周围的颗粒细胞，观察卵母细胞第二极体排出情况，以确保卵子受精。

这两种受精方式是传统的IVF和ICSI的衍生技术，主要目的是避免体外受精失败发生。有8%左右的CIVF周期会发生受精失败和低受精率^[9]，完全受精失败可能导致治疗周期无可移植胚胎；而ICSI虽然可保证卵子获得更高的受精机会，但由于ICSI技术涉及更多的生殖安全性、执行成本和病人就医费用高等问题，因此，我国中华医学会生殖医学分会规范指南明确规定了ICSI授精的临床指征^[10]。为避免受精失败给患者造成经济损失和精神损失，half-ICSI或者短时受精观察补救性ICSI（rescue-ICSI）成为不明确授精方式情况下最常用的两种替代授精方式^[11-13]。但由于执行成本增加，95%的half-ICSI患者为此增加了不必要的医疗花费。短时受精观察Rescue-ICSI技术能够降低完全受精失败发生，避免不必要的ICSI操作，减少患者经济负担，但该技术需要在加精后3-5h进行第二极体观察，实验室必须在此时进行卵子颗粒细胞的剥除，同样增加了卵子异常受精和卵子损伤的风险，生殖安全性问题也一直受到业内关注，而报道ICSI可能增加胚胎染色体异常几率发生^[14]。

此外，针对特殊小圆头精子、来自睾丸的冻融精子在进行ICSI后，建议采用人工卵母细胞激活术（artificial oocyte active，AOA），但AOA的临床安全性尚无足够证据证明，因此AOA应在临床上仅使用于特殊人群，并获得患者知情同意^[15,16]。

二、胚胎培养技术

1. 低氧培养技术的临床应用：即将培养箱内氧浓度通过使用三气培养箱，利用向培养箱内补充高纯氮气使培养箱内氧浓度下降到5%或以下的培养方式。低氧浓度可使体外培养的胚胎更容易发育到囊胚，相关meta分析认为，低氧浓度与出生率提高具有明显的相关性。低氧浓度培养环境与胚胎发育的体内环境相类似，同时低氧培养减少了ROS的产生，降低了胚胎的应激反应^[17,18]。

2. 囊胚培养技术在临床的应用：随着体外培养体系的发展和成熟，囊胚培养技术已经越来越成为IVF实验室技术的关键。囊胚培养的临床意义在于：（1）更符合临床生理。生理情况下，囊胚经过5-6天的发育从输卵管进入子宫腔，开始发育并完成种植，因此囊胚移植更符合生理，相较于卵裂期胚胎移植可显著提高临床妊娠结局。（2）临床采用单囊胚移植技术可有效避免多胎妊娠的发生，特别是针对二胎患者、宫颈机能不全患者、复发性流产患者进行单囊胚移植更具有孕期母胎安全的临床意义。（3）囊胚培养可筛除染色体可能异常的胚胎，减少体外培养胚胎的储存数量，缩短患者成功妊娠的病程^[19]。

囊胚培养如果失败，则无可移植胚胎风险；而囊胚移植的男性婴儿出生比例高也是临床是否采用全部囊胚移植策略的一个影响因素。

3. 时差培养技术的临床应用：时差培养箱可以实时观察胚胎培养情况，并通过定时连续的图像采集功能，记录胚胎发育全过程，无需将胚胎拿出培养箱外进行胚胎形态学观察即可得到胚胎发育的全部数据，胚胎培养更安全^[20]。胚胎时差培养的临床价值在于可实现受精捕捉，发现异常卵裂的胚胎，通过早期卵裂速度判断胚胎发育潜能，选择优质胚胎进行单胚胎移植。研究证实通过对时差培养得到的胚胎发育情况数据分析和优选后，单卵裂期胚胎移植的成功率明显高于常规体外培养的卵裂期胚胎。这种对胚胎的优选技术不仅在临床结局上可获得满意的结果，同时也降低了胚胎在体外的培养时间，减少了培养环境因素可能引起的表观遗传学改变，同时避免因囊胚移植而造成的性别比例失调现象^[21]。时差胚胎培养技术的临床应用还体现在海量图片的记录上，为将来IVF实验室发展人工智能技术，判断胚胎发育潜能提供了大数据学习的影响资料和数据资料，利于后期机器学习、训练和结果验证，而智能化胚胎培养将是IVF实验室胚胎培养的未来趋势^[22]。

三、胚胎移植技术与胚胎评估和辅助孵化技术

胚胎移植是将胚胎通过导管送入子宫腔内，使之成功着床的技术。由于多胎妊娠增加围产期并发症发生风险，单胚胎移植已经成为目前IVF-ET助孕治疗的趋势。因此胚胎移植技术的细节越来越受到关注。使用软管进行胚胎移植的成功率好于硬管移植；是否使用胚胎胶移植尚有证据分歧，但胚胎胶布的使用不会增加负面移植风险。胚胎移植涉及的胚胎评估技术虽然有多种方法，但形态学评估法及形态动力学评估法仍然是目前常用的胚胎评估方法。通过胚胎质量评估结果不但指导实验室筛选移植胚胎，同时也为临床医生回顾本周期的促排卵方案情况提供实验室依据。胚胎移植相应的衍生技术是帮助胚胎孵出的辅助孵化技术（assisted hatching, AH），AH是通过使用低能量的激光对即将移植胚胎的透明带，进行削薄或者打孔处理，以帮助胚胎孵出的一项技术。常用于透明带厚的卵子、冻融胚胎移植前、高龄取卵患者胚胎、反复种植失败的患者，但辅助孵化目前仍无明确证据证明其使用的有效性及对出生率的影响^[23]。

四、配子和胚胎玻璃化冻融技术

胚胎冷冻技术现已成为IVF实验室的技术常规。其临床意义在于：① 增加IVF治疗累积妊娠率；② 降低多胎妊娠风险；③ 避免发生OHSS；④ 为因疾病、社会或心理因素无法进行新鲜胚胎移植的病人保留继续治疗的机会；⑤ 有助于受卵病人的治疗。随着冷冻保护剂的改进和玻璃化冻融技术的发展，卵子冻融成功率已经得到显著提高。卵子冷冻保存主要应用于IVF实验室内取卵日无法获得丈夫的精子情况，同时，卵子冷冻保存最大的临床意义在于可以为肿瘤患者进行生育力保存，以及捐赠卵子的卵子库建立。

卵子冷冻保存技术从慢速冷冻发展至玻璃化冷冻，实现了质的飞跃^[24]。目前玻璃化冻存卵子用于肿瘤患者生育力保存越来越受到广泛关注^[25]。由于卵子体积大，胞质内含有大量的水分，卵膜渗透性差，含有大量膜性结构细胞器，同时具有特殊的MII结构，胞质内纺锤体对温度极敏感等独特的形态和生理特性，使得卵子冷冻技术虽然能够获得满意的复苏率，但冷冻带来的细胞器和细胞内脂类物质的损伤可能导致卵子发育能力受到影响^[26,27]，如何保证冷冻复苏后的卵子具有生理活性，是目前需要解决的关键问题^[28]。研究证实，通过改善冷冻保护剂内血清浓度及各种氨基酸含量，可改善冷冻复苏后的卵子发育潜能^[29-31]，但尚缺乏临床数据支撑。对于社会因素进行的卵子冷冻保存技术，由于法律法规限制，同时卵子长期保存可能存在的生殖安全风险的不确定性，目前在我国，仍禁止未婚健康育龄女性进行卵子冷冻保存。

相比于卵子冷冻技术，精子冷冻保存技术相对完善，目前针对显微外科取精技术发展起来的微量精子冷冻技术解决了无精子症患者的不育问题。通过多次进行显微取精技术，获得睾丸来源的精子，在显微镜下将每一个活动的精子收集起来，进行冷冻保存，可以避免IVF实验室在取卵日无精子授精的情况发生，同时由于冷冻时精子是存活的，在解冻后，只要尾部不是僵硬的，即使不活动，依然可以放心用来进行ICSI操作。微量精子冷冻技术为越来越多的无精子症患者提供了可以获得出生婴儿的机会。

五、卵母细胞体外成熟培养技术 

卵母细胞体外成熟（in vitro maturation，IVM）技术指的是将小卵泡内的卵子穿刺取出后进行未成熟卵体外成熟培养，ICSI受精后，获得胚胎，以获得临床妊娠和出生健康婴儿的技术。IVM临床应用一直受到限制。这主要源于IVM卵子成熟率低，核质发育不同步，使得IVM卵子获得的胚胎发育阻滞率高^[32]，临床妊娠率只有30%左右，和体内成熟的卵子相比，卵子发育潜能非常低下，IVM卵子的临床应用一直受到限制，目前，IVM卵子的临床应用主要集中在肿瘤患者生育力保存和卵巢高反应人群，特别是PCOS患者的助孕治疗方面。

对于有生育要求的育龄肿瘤患者，尤其是白血病肿瘤患者，临床可以通过促排卵的方式获得成熟卵子进行冷冻保存，未成熟卵子进行IVM培养后，再进行卵子冷冻以实现生育力保存的目的。医疗机构熟练掌握卵子冷冻技术和IVM技术，来满足肿瘤患者的生育力保存要求成为必需。目前，虽然有相应的技术操作指南，但是这两项技术获得的卵子的临床妊娠率仍显著低于新鲜体内成熟的卵子。如何提高冷冻卵子活力，提高未成熟卵子的临床利用率，是目前急需解决的临床问题^[33,34]。

多囊卵巢综合征（PCOS）患者由于在促排卵过程中容易发生卵巢高反应，因此在微量促排卵药物的刺激下，通过无扳机药物取卵，获得的卵母细胞经IVM体外成熟培养，ICSI授精的方式，可使PCOS患者获得35%左右的临床妊娠，同时也避免了OHSS的发生，降低了患者的经济费用。2018年我国关于《多囊卵巢综合征中国诊疗指南》指出[6]：IVM技术在PCOS患者辅助生殖治疗中的应用仍有争议。IVM在PCOS患者辅助生殖治疗中的主要适应症为：（1）对促排卵药物不敏感，如对CC抵抗、对低剂量促性腺激素长时间不反应，而导致卵泡发育或生长时间过长。（2）既往在常规低剂量的促性腺激素作用下，发生过中重度OHSS的患者。

目前，实验室可以通过改善IVM培养体系和培养方法，提高IVM卵子成熟率，同时促进卵胞质成熟，提高核质发育同步性，使IVM卵子更具有发育潜能^[34,35]。取卵获得的GV卵子，经IVM培养后，若无法受精，依然需要冷冻卵子保存，而IVM后的卵子冷冻保存明显会影响卵子的发育潜能^[36]。因此，改善不同来源的IVM卵子培养条件依然成为实验室的需要解决的主要问题。

六、植入前胚胎遗传学检测

胚胎植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing，PGT）是在胚胎着床之前对配子或胚胎的遗传物质进行分析,检测配子或胚胎是否有遗传物质异常的一种早期产前诊断方法，经过PGT筛选检测项目正常的胚胎进行移植，胚胎活检细胞以囊胚滋养层细胞活检为趋势。高通量分子遗传学检测技术的快速发展，极大提高了PGT诊断的准确性和全面性，并且进一步将PGT分为胚胎植入前非整倍性检测（PGT for aneuploidies，PGT-A）；胚胎植入前染色体结构变异检测（PGT for chromosomal structural rearrangements，PGT-SR）；胚胎植入前单基因病检测（PGT for monogenic/single gene defects，PGT-M）三种技术。其中，PGT-A归类为植入前遗传学筛查（preimplantation genetic screening，PGS），而PGT-SR和PGT-M则归类为胚胎植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis，PGD）。

PGS的临床应用的循证证据尚需进一步的研究和验证，其指征也面临修正和更新，目前PGS可应用于以下几个方面：女方高龄，女方年龄38岁及以上取卵患者；不明原因反复自然流产2次及以上患者；不明原因反复种植失败患者；严重畸形精子症患者。

PGD技术的临床意义在于筛查单基因遗传性疾病。当夫妇任一方或双方携带染色体结构异常，包括相互易位、罗氏易位、倒位、复杂易位、致病性微缺失或微重复时；当具有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、X连锁隐性遗传、X连锁显性遗传、Y连锁遗传等遗传病子代高风险的夫妇，且家族中的致病基因突变诊断明确或致病基因连锁标记明确时；或者当夫妇任一方或双方携带有严重疾病的遗传易感基因的致病突变患者时，可利用PGD技术筛选正常胚胎进行移植，实现优生优育的临床目的^[37,38]。

综述所述，IVF实验室技术始终贯穿整个IVF助孕治疗的始终，合理正确使用IVF技术，将对改善不孕夫妇妊娠结局具有重要的临床价值和社会意义。

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