全外显子基因测序在无精子症遗传学病因诊断中的临床应用研究

作者：周善杰  田莉

随着分子生物学技术的大发展，特别是基因测序技术的成熟和临床应用，将全外显子基因测序（whole exome sequencing，WES）技术应用于无精子症的遗传学病因诊断，拓宽了基因突变在该病发病机制中的重要作用和认知范围，不仅给无精子症潜在的病理生理学研究带来曙光，而且也为临床上更有效的和精准的诊断与治疗提供了技术支撑。

一、无精子症的患病情况、病因及其诊断方法

大约7%的男性受到不育症的影响，通过精液检测能够确定精液异常类型并初步对不育症进行诊断学分类。有文献认为无精子症占不育症患者的19%～30%，这些患者病因明确的少于半数，其中基因或者遗传性疾病、Y染色体特定异常是主要因素，因此需要积极寻找不育症的病因^[1]。不育症男方因素中20%～25%为已知的基因因素，约有521个基因与男性不育症的单基因病因存在相关性^[2]。

无精子症是指精液中无精子，至少要进行3次以上严格的精液采集和检查，且所有显微镜检查未见精子的精液标本都应离心确定沉渣中无精子。无精子症的病因复杂，概括分为两大类，一是睾丸本身生精功能障碍，称为原发性无精子症或非梗阻性无精子症（nonobstructive azoospermia，NOA）；另一种是睾丸生精功能正常，但由于输精管道阻塞或先天性输精管缺如而导致产生的精子不能排出体外，称为梗阻性无精子症（obstructive azoospermia，OA）。无精子症的诊断需要基于病史、体格检查、精浆生化、生殖激素、染色体及基因检查、影像学检查和睾丸组织活检等综合判断与分析，虽然上述常规方法能够初步鉴别NOA和OA，然而，由于多数无精子症的病因不能明确，从而不能确立精准的治疗方案。40%的不育症患者的病因仍然不明确（可称为特发性病例），需要运用新的检测和诊断方法寻找病因，其中全外显子基因测序（whole exome sequencing，WES）方法或许可以揭示一部分潜在的遗传学病因。

二、全外显子基因测序在无精子症遗传学病因诊断中的应用

WES属于第二代测序，通过外显子DNA序列芯片或探针，将基因组中外显子区域的DNA序列捕获后集中进行高通量测序，主要步骤包括：（1）目标区域序列的富集；（2）DNA测序；（3）生物信息学统计、筛选出候选基因、Sanger法验证，最终找到致病基因。虽然WES捕获探针仅能覆盖人类基因组的1%～1.5%，却涵盖了与基因功能相关的绝大多数功能性变异，即使只对编码区域进行高通量测序，依然能解释至少85%的致病基因多态性或者变异，WES被认为是一种性价比最高的高通量技术。在过去的数年中，WES技术得到不断改进，现在正迅速进入临床实验室，已有许多常染色体隐性遗传疾病的致病基因被找到，从而改变了临床检测和诊断的格局^[3,4]。

过去的20年，应用于诊断男性不育症的常规遗传学分析方法没有变化，无精子症的传统遗传因素检测方法包括染色体核型分析、Y染色体微缺失、CFTR基因突变等检测，但是仅能解释20%的遗传学原因，寻找潜在的遗传学病因从而促进临床工作显得尤为迫切。重度少精子症（＜5×106/ml）和无精子症等显著的精子计数异常是染色体核型和Y染色体微缺失检测的指征，而候选基因的突变筛查指征为特殊的精液或者睾丸表型。采用WES技术发现导致不育症的突变基因是研究热点之一，本文将概括的综述WES在无精子症诊断和疾病研究领域寻找遗传学病因的新进展和新发现。

三、WES在NOA遗传学诊断中的应用

NOA在男性中的患病率约1%～2%，在不育症患者中患病率约10%～20%。大多数NOA患者的病因是未知的，既往仅有几个基因突变被确认为其病因。现将近年来新报道的基因突变综述如下。

1. NOA与减数分裂过程有关的新发基因突变：在临床上25%的无精子症患者可观测到减数分裂期阻滞，但是发生所有的精曲小管中纯粹同质性阻滞（或许由于单一基因的突变所致）的较少，由于大量的基因作用于减数分裂过程，因而产生广泛的遗传异质性。Gershoni等^[5,6]利用WES或全基因组测序法（whole genome sequencing，WGS）鉴定出MEIOB、X连锁外显子睾丸表达基因14（Testis-expressed gene 14，TEX14）和DNAH6等3个无精子症突变，分别与减数分裂交换、子代细胞脱落、可能的快速前期运动等不同减数分裂过程相关。MEIOB基因编码减数分裂过程中DNA双链断裂修复所需的单链DNA结合蛋白，其特异的在人类和小鼠睾丸表达，MeioB敲除小鼠由于减数分裂阻滞而出现无精子症。该作者新发现MEIOB基因纯合移码突变，其导致MEIOB蛋白截短，进而保守的C端DNA结合域缺乏。另有报道^[7] 2例血亲家庭NOA和减数分裂阻滞的兄弟患有编码减数分裂双链断裂形成蛋白1基因（meiotic double-stranded break formation protein 1）的纯合错义突变（MEI1；c.C3307T:p.R1103W），另1例弟弟为杂合突变；已有MEI1敲除与减数分裂阻滞相关的小鼠动物模型，这表明该突变是有害的。

多数真核生物的减数分裂同源重组由2种重组酶系统介导，即参与有丝分裂和减数分裂的RAD51及减数分裂特异的DMC1；RAD51对于人类减数分裂的作用尚不清楚；小鼠敲除Rad51或者任何旁系同源Rad51，均呈现胚胎致死性。Yang等^[8]使用纯合性基因定位和WES检测1个患有减数分裂阻滞、无精子症的血亲家庭，发现1个旁系同源RAD51基因的1bp纯合置换异常（c.41T＞C/p.Leu14Pro），命名为XRCC2。通过CRISPR/Cas9方法制作的携带Xrcc2-c.T41C/p.Leu14Pro突变的基因敲入小鼠，纯合性突变可以存活，呈现减数分裂阻滞、无精子症、卵巢早衰（primary ovarian failure，POF）和不育症。

基质抗原3基因（stromal antigen 3，STAG3）编码的减数分裂特异蛋白对减数分裂黏连蛋白复合物的功能性至关重要，已知STAG3序列变异导致雄性和雌性小鼠的减数分裂阻滞、人类POF，但是对于男性不育症患者的意义尚不清楚。van der Bijl等^[9]报道，2个导致完全减数分裂阻滞和不育症的STAG3基因复合杂合变异c.[1262T＞G]；[1312C＞T]和p. [（Leu421Arg）]；[（Arg438Ter）]；Stag3基因敲除小鼠的生殖细胞发育不超过偶线期，显示极端的染色体畸变；这表明STAG3变异负面影响蛋白功能是NOA一个少见的原因（＜1%）。SYCE1基因编码联会复合体中心成分1（synaptonemal complex central element 1，SYCE1）蛋白作用于减数分裂期间联会复合体的形成，Syce1缺失雄性和雌性小鼠罹患不育，人类SYCE1突变引起POF和NOA。Pashaei等^[10]新发现SYCE1基因的剪接位点突变c.375-2A＞G，突变影响该基因内含子6中的受体剪接位点，导致无精子症和不育症。

2. 无精子症有关的X-连锁基因的新发突变：TEX11是减数分裂重组和染色体联会所必需的基因，缺乏将导致减数分裂阻滞、无精子症和不育症。Sha等^[11]在2例无精子症兄弟新发现TEX11突变（2653G → T, in exon 29，GenBank accession number，NM_031276），为同一外显子的错义突变（W856C），但其母亲没有携带；患者的睾丸活检组织学揭示减数分裂阻滞，在精曲小管中没有减数分裂后的圆形精细胞和成熟精子，TEX11在精原细胞强表达和精母细胞弱表达，但是在支持细胞和间质细胞没有表达。Okutman等^[12]检测2例无精子症患者，发现X连锁黑色素瘤抗原家族B4（melanoma antigen family B4，MAGEB4）基因突变，为单碱基替换（c.1041A＞T）和非终止突变，导致C-羟基端增加24个氨基酸；功能试验没有发现影响mRNA稳定性、蛋白细胞内定位以及与其他MAGE蛋白的同型或异型二聚体化，增加的氨基酸影响特有蛋白与MAGEB4配偶体之间的互相作用。

3. 在睾丸特异表达的新发基因突变：Fakhro等^[13]报道5个在NOA患者睾丸特异显著表达的、有害的、与疾病分离的隐性变异（CCDC155、NANOS2、SPO11、TEX14和WNK3），小鼠功能研究证明这些基因在精子发生中发挥作用。在75例NOA患者中，有5.3%携带这些新发现的基因隐性变异，8.0%携带既往报道的NOA基因有害变异，13.3%患者存在遗传学病因，而可生育的对照组则为0；说明WES可以发现NOA患者的一部分遗传学病因（家族性＞50%，散发性＞10%）。Araujo等^[14]在6例NOA患者鉴定出7个基因的潜在致病变异，鉴定出2个已知与无精子症相关的DMRT1基因变异c.671A＞G（p.（Asn224Ser））和 REC8基因变异c.91C＞T（p.（Arg31Cys）），发现的新变异包括已知中等证据、与精子发生障碍有关的TEX15和KLHL10，有限证据的DNMT3B和TEX14，迄今为止没有证据、有希望成为候选基因的SYCE1L。

4. 在睾丸和卵巢均可发挥作用的新发基因突变：He等^[15]发现DMC1基因的纯合错义突变（NM_007068.3: c.106G＞A，p.Asp36Asn）为1个家族NOA和POF患者表型的共同异常，导致DMC1基因修改的H3TH基序中保守的天冬氨酸残基与天冬酰胺发生置换，从而引起蛋白错误折叠。研究证实患者精曲小管内缺乏精子，精子发生阻滞于减数分裂前期Ⅰ期的偶线期。Jaillard等^[16]报道1例POF先证者和1例NOA患者弟弟，鉴定出STAG3纯合错义变异，STAG3编码姊妹染色单体分类所需的减数分裂黏连蛋白复合物的成分。

5. 影响信号转导过程的新发基因突变：泛素特异肽酶26（Ubiquitin-Specific Peptidase 26，USP26）基因定位于X染色体，编码去泛素酶，主要在睾丸表达，在精子发生期间控制蛋白质转换和调节雄激素受体（Androgen Receptor，AR）的泛素化水平，因此影响AR信号传递。Arafat等^[17]发现唯支持细胞综合征（Sertoli cell-only syndrome，SCOS）患者发生USP26变异，在高度进化的、保守的氨基酸引起p.P469S，其可能是SCOS的原因。文献报道USP26的34个单一变异、14个群集变异与男性不育症有关，对于泛素化活性检测中，22个变异中有1个变异、3个突变中有1个群集被发现是有害的；对于AR功能效力中，6个变异中仅有1个被发现是有害的；因此，USP26与男性不育症的相关性仍有疑问。Clavijo等^[18]检测NOA和少精子症血亲患者各2例，鉴定出1个整体转录因子TFIIH亚单位3（general transcription factor TFIIH subunit 3，GTF2H3）的非同义变异，定位于12号染色体（12chr：124144111 T＞C，p.Ser222Pro），在NOA兄弟为纯合突变，而少精子症兄弟为杂合突变，致病机制为导致精子发生所必需的维生素A信号传导缺陷。

6. 引起NOA和先天性白内障共患病的新发基因突变：无精子症和先天性白内障（congenital cataract，CC）共患病发病几率为1/165000～1/500000。Milunsky等^[19]报道1例28岁上述疾病患者，智力正常但牙齿排列异常，Xp23.13出现微缺失、NHS（Nance-Horan syndrome）基因全部缺失、SCML1和RAI2两基因的连续缺失；此为首次报道NOA/CC共患病、SCML1基因连续缺失病例，SCML1转录物唯一的表达于睾丸，推定为致病基因。Tan等^[20]新发现2例家族性NOA/CC共患病血亲兄弟病例携带2个功能缺失TDRD7突变c.324_325insA（T110Nfs*30）和 c.688_689insA（p.Y230X），组织学分析确定精曲小管内成熟精子缺失，Tdrd7基因受损小鼠准确的重复了人类所患异常。TDRD7为常染色体隐性遗传。

7. 其他与NOA相关的新发基因突变：Ramasamy等^[21]新发现神经元PAS-2结构域（neuronal PAS-2 domain，NPAS2）外显子14的非同义突变（chr2：101592000 C＞G），可能为致病性突变，3例纯合突变兄弟呈现NOA，其母亲、另1弟弟、1妹妹为杂合突变而生育孩子。Colombo等^[22]发现2个NOA兄弟为1个无义突变和1个单核苷酸缺失（导致TEX15基因过早产生终止密码子）的杂合子，分别为c.2419A＞T、p.Lys807*和c.3040delT，p.Ser1014Leufs*5，在6个家庭成员中仅在1个等位基因鉴定出这个突变，其中3例男性使妻子自然怀孕。Arafat等^[23]报道TDRD9的一个4bp缺失移码突变并发外显子跳读，其为一个优势对数计分（Lod Score）3.42的致病突变，患者睾丸活检组织细胞中蛋白阳性，但突变不引起女性不孕症。TDRD9敲除小鼠证实该基因参与长散布元素-1逆转录转座子的静默作用。Kasak等^[24]检出2例NOA/SCOS兄弟携带范科尼贫血互补组M（FANCM，Fanconi anemia complementation group M）的复合杂合子功能缺失（loss-of-function，LoF)变异、1个母系遗传移码变异p.Gln498Thrfs*7（rs761250416）和1个既往没有报告的剪接变异（c.4387-10A＞G），后者来自父亲、导致过早出现终止密码子以及截短的蛋白，FANCM定位于支持细胞和精子发生细胞伴有增高的强度；2例NOA患者携带独立FANCM纯合无义变异p.Gln1701*；rs147021911和p.Arg1931*；rs144567652；证实FANCM的等位基因隐性LoF变异引起无精子症，FANCM致病性变异致使家族性乳腺癌和卵巢癌增加一倍风险。鼠功能研究和人类单细胞RNA测序资料证明，BRDT、CHD5、MCM9、MLH3和ZFX可以视为NOA/重度少精子症强有力的候选基因^[25]。

四、WES在OA遗传学诊断中的应用

OA在不育症患者中约占7%～10%，根据梗阻部位分为附睾梗阻、输精管梗阻、射精管梗阻、睾丸内梗阻等类型。OA占无精子症患者的40%，30%的OA患者存在遗传因素，然而大多数潜在的遗传学病因仍然是未知的。先天性双侧输精管缺如（congenital bilateral absence of the vas deferens，CBAVD）是一类特殊的输精管梗阻并且是OA的一个重要原因，其所致OA男性中80%由囊性纤维化跨膜转导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）基因突变引起。CFTR和黏附G蛋白耦合受体G2（adhesion G protein-coupled receptor G2，ADGRG2）基因确定是CBAVD最重要的致病基因，均为OA遗传学病因的研究热点。

1. 关于CFTR基因的新发突变：Yang等^[26]收集2个CBAVD家系、各2例患者，排除编码附睾和输精管道特异的ADGRG2变异，但是鉴定出CFTR的复合杂合变异，家系1为NM_000492.3:c.1210-33_1210-6GT[13]T[5]和c.4056G＞C；p.Gln1352Cys，家系2为c.592G＞C；p.Ala198Pro和c.3717G＞A；p.Arg1239=；直接测序证实c.1210-33_1210-6GT^[13]T^[5]（即已知的IVS8-T5-TG13）为引起CFTR外显子9跳读的致病变异、由先证者母亲遗传；p.Gln1352Cys和Ala198Pro为罕见或新发现，预计有害；p.Arg1239=是同义变异、定位于外显子的末端，预计改变剪接模式。

2. 关于ADGRG2基因的新发突变：Patat等^[27]报道CFTR阴性CBAVD患者携带ADGRG2的3个蛋白截断半合子突变，即c.1545dupT（p.Glu516Ter）、c.2845delT（p.Cys949AlafsTer81）和c.2002_2006delinsAGA（p.Leu668ArgfsTer21），可以引起X连锁遗传CBAVD。Nazli等^[28]检测2例OA不育症兄弟和2例可生育家庭成员，新发现X连锁基因ADGRG2的无义变异c.2440C＞T（p.Arg814*），其导致一个关键跨膜结构域的、截断204个氨基酸的蛋白；Adgrg2敲除雄性小鼠的精子减少是由于梗阻所致，ADGRG2突变男性患者引起OA，精子发生继发性重度减少，人类与基因敲除小鼠表型一致。

Pagin等^[29]分析包括2个孪生兄弟在内的8例输精管缺如患者，新发现6个截短ADGRG2基因突变，即c.251C＞G（p.Ser84*）、c.1013delC（p.Pro338Hisfs*4）、c.1460delG（p.Gly487Alafs*9）、c.2096dupT（p.Phe700Ilefs*29）、c.2473C＞T（p.Arg825*）和c.1731_1839+373del（p.Asn578Thrfs*12），其为一个影响外显子21最后5个碱基和整个外显子22的596个碱基对缺失；8例患者中有5例携带1个杂合CFTR突变，属于偶发；当超声证实双侧肾脏存在时，ADGRG2截短突变的几率为26%，而肾脏状态不明时，几率为6.1%。Wu等^[30]新发现2例CBAVD兄弟携带ADGRG2的半合子LOF突变c.G118T：p.Glu40*，导致ADGRG2第3个外显子过早平移终止，突变患者的近端附睾组织没有探测到ADGRG2的mRNA和相应蛋白，ADGRG2表达局限在人类输出管道的无纤毛上皮细胞顶端膜上，这与既往小鼠研究一致。

3. 导致附睾梗阻的新发突变：Askari等^[31]鉴定出导致家族性附睾梗阻的、CLDN2获得功能的错义突变c.481G＞C；p.Gly161Arg，在家系中符合X连锁遗传模式；闭合蛋白-2（Claudin-2）二聚体和四聚体排列不仅减少，并且通过单一残基替代而显著的变异，这个氨基酸替代很可能形成一条聚合不连续链，其导致上皮细胞之间的紧密连接破裂。此错义变异很可能是血睾屏障破裂的原因，错位的上皮细胞阻塞输精管道而引起OA。

4. 其他导致OA的新发突变：Yang等^[32]在2例CBAVD患者鉴定出2个错义变异（c.G1709A，p.C570Y和c.A2968G，p.K990E），p.C570Y定位于G蛋白耦合受体（G protein-coupled receptor，GPCR）蛋白水解结构域，其对于自体溶解是必须的，而p.K990E位于N端片段、能够调控黏附GPCR活性。

五、无精子症患者明确遗传学病因的临床意义

对很多不明原因不育患者缺乏明确有效的治疗方案，通过遗传学检测，可以使部分无精子症患者明确病因，尽可能找到精子发生障碍的真正原因，有更加明确的遗传学诊断。无精子症的基因检测及明确诊断有助于临床决策和避免不必要的外科或者医学治疗，对于睾丸精子回收几率提供预测，基因异常最常见于重度精子发生受损，可以借助于体外受精-胚胎移植或者卵胞浆内单精子显微注射等辅助生殖技术进行治疗；考虑到通过该技术存在将基因异常传递给子代的风险，针对特发性不育症患者，为了提高治疗的安全性和成功率、降低遗传风险，诊断已知的和发现潜在的基因因素是重中之重^[33]。

将WES技术应用于无精子症的遗传学病因诊断，拓宽了基因突变在该病发病机制中发挥重要作用的认知范围，不仅对于无精子症潜在的病理生理学研究带来曙光，而且为临床上更有效的和精准的诊断和治疗提供了基础。

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