孕妇血浆胎儿游离DNA的无创性产前检测的临床应用研究

临床常规的产前遗传学诊断都是通过绒毛膜取样或羊膜腔穿刺等有创性检测方法获得胎儿的样本，采用不同的检测方法对胎儿进行遗传学分析，然而这些有创性检测方法会导致1%的胎儿丢失率^[1-4]。许多年来，大量的研究致力于探索一种无创性、经济、快速、准确的产前诊断方法。早期的一些研究主要集中于从孕妇血液中分离胎儿有核红细胞^[5-8]。然而经过长期的研究发现，这种方法在应用过程中仍然存在很多不可避免的问题，例如胎儿细胞难以分离和分析、分离特异性较低^[9]。随着孕妇血浆中游离胎儿DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）的发现^[10]，借助各种分子生物学技术针对cffDNA进行胎儿染色体疾病、单基因遗传病以及妊娠相关疾病的无创性诊断很快成为了该领域的研究热点。基于 cffDNA的胎儿分析方法极大地促进了无创性产前检测（Non-invasive prenatal testing，NIPT）的发展，是近几年来发展迅速、并且受到广泛关注的临床检测方法。目前其临床应用主要包括对于高遗传风险孕妇的胎儿性别鉴定、胎儿RhD血型鉴定、染色体非整倍体疾病的大规模筛查以及某些单基因疾病的检测等^[11-14]，具有广阔的应用前景。本文将针对孕妇外周血中游离胎儿DNA在临床无创性产前检测中的应用进展进行简要综述。

一、CffDNA 的来源及生理特征

孕妇血浆中游离的DNA分子（cfDNA）主要由孕妇血液循环中的小片段的细胞外DNA组成。1997年Lo等[10]发现在孕妇外周血中存在胎儿游离DNA（cffDNA），随后的大量研究对胎儿DNA的来源及生理特征等进行了系统的分析。研究证实，cffDNA的来源有三个：

（1）胎儿细胞；（2）凋亡的胎盘滋养层细胞；（3）胎儿直接跨膜转运^[15-17]。目前认为cffDNA多数来源于胎盘，少部分来源于胎儿细胞以及胎儿DNA分子的跨膜转运^[15]。cffDNA最早可在孕4周的孕妇外周血中发现，并随着孕周增加而增加。实验证实在妊娠早期、中期、晚期，cffDNA在母血中占总游离DNA的比例分别是9.7%、9.0%和20.4%^[18-19]。Wang等^[20]研究显示cffDNA随着孕周的增加在孕妇血浆游离DNA的比例也随之增加，在10-21周之间，每周胎儿DNA的比例会增加0.1%，21周后每周以1%的比例增加。而随着孕妇的体重增加cffDNA比例会下降，当体重超过100千克，cffDNA的比例会低于4%，使检测出现失败。

Chan等^[21]发现cffDNA片段大小在193bp到313bp之间，而大多数母体DNA分子片段长度大于313bp，根据这一重要特点，可以依据DNA分子片段长度的差异，特异性富集片段长度小于300bp的DNA分子，从而达到高效富集cffDNA的目的。Li等^[22]利用从孕妇血浆中提取到的游离DNA进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳，然后参照DNA分子量标准分别切取DNA分子量为90~23,000bp等部位的凝胶，并回收其中的DNA片段，利用实时PCR（Real-time PCR）方法测定其回收的DNA含量及来源。但是此方法富集效率低并且极易受到母亲DNA的污染，难以临床推广。

2010年Lo等采用测序技术对孕妇血浆中胎儿全基因组进行分析，证实cffDNA片段能够携带胎儿整个染色体组的遗传信息^[23]，并且在分娩后能够迅速被机体清除，具有妊娠特异性。因此，对于cfDNA的分析在NIPT中具有巨大的应用潜能。

二、CffDNA在产前诊断中的应用

自从cffDNA发现以来，限制其在NIPT中应用主要障碍在于很难在大量的母体cfDNA背景中分辨出极微量的cffDNA。随着二代测序、定量PCR等DNA检测技术的发展，可以对母体血浆中的特定DNA序列进行准确的定量，这种方法即被用于利用母体cfDNA进行的NIPT^[24-27]。目前的应用主要包括常规的非整倍体疾病、父母携带相同等位基因的常染色体隐性遗传状态以及某些X染色体连锁状态检测^[28，29]。其中非整倍体检测目前被认为是较为先进的NIPT筛查方法，其假阳性率低于目前广泛使用的血清学筛查方法^[30]。

1. 胎儿性别鉴定：利用检测孕妇cfDNA中是否含有Y染色体特征序列的方法进行胎儿性别鉴定，是最早应用于临床的NIPT方法^[31]。胎儿性别鉴定对于指导妊娠具有重要的作用，可以检测胎儿性器官发育状态、并且可以有效避免严重的X染色体连锁性疾病的发生^[32-34]。研究显示，胎儿性别鉴定最早可在妊娠5-7周进行，其准确性可达95%-99%^[35,36]。对于X连锁性遗传病而言，一般为男性胎儿受累，如果能在孕早期确定胎儿性别，可以仅针对男胎作进一步的有创性诊断，可将有创性的产前诊断率降低一半^[37,38]。然而，对于胎儿性别鉴定仍有一些伦理学以及社会学上的争论^[39,40]。

2. 新生儿溶血性疾病：Rh阴性孕妇血浆中游离DNA的RhD基因检测是继性别鉴定较早应用于临床的无创产前检测方法。RhD血型阴性（RhD-）的孕妇所怀的胎儿RhD血型为阳性（RhD+）时，母体产生的RhD抗体会通过胎盘进入胎儿体内引起胎儿及新生儿溶血性疾病（Haemolytic disease of the fetus and newborn，HDFN）。由于RhD-的母体不携带RHD基因，NIPT可以用于检测胎儿体内是否携带遗传自父亲的RHD基因^[41,42]。丹麦研究者[43]采用real-time PCR对12,668例胎儿进行了RHD基因筛查，孕妇在孕25周时采集静脉血进行血浆游离DNA分离，结果显示该方法的筛查敏感性为99.9%（95% CI：99.7-99.9%），假阴性率为0.087%（95% CI：0.04-0.16%）。英国的研究发现，应用高通量技术对孕11周的孕妇进行RHD基因型检测从而指导抗D预防，其准确率可以满足常规检测的要求，并且通过这种检测避免不必要的抗D预防措施也受到了广大女性以及健康专家的欢迎。

3. 胎儿染色体异常的检测：胎儿染色体异常是产前诊断的主要目的，研究证明胎儿21三体发病率为1/800、18三体为1/6000、13三体为1/10000。染色体异常也是出生缺陷的主要原因。传统的筛查方案是由超声测量胎儿颈部透明带的厚度（NT）结合母血清标记物联合评估风险，高风险孕妇需要借助侵入性取样来确诊。传统筛查方法的假阳性高，而检出率约在60-90%，不同的筛查方案检出率差异较大。

2008年Fan等^[44]采用鸟枪法大规模平行测序技术（Massively parallel shotgun sequencing，MPSS）首次证明了孕妇血浆中游离DNA可以用于唐氏综合征（Down’s syndrome，DS）的 NIPT。此后大量的研究集中在了唐氏综合征无创产前检查的领域，NGS的高分辨率可区分孕有唐氏综合症患儿的母亲血浆中21号染色体的总量与孕有正常核型胎儿母血浆中21号染色体的总量的微小差异，并通过生物信息学技术分析其Z值，以3作为截断值，其特异性可达到100%，敏感性99%^[45,46]。同时研究指出，Z值仅与胎儿DNA占母血总DNA的浓度有关，当胎儿DNA浓度低于4%时将影响结果的准确性，而与孕妇的年龄、孕周无关^[47]。在一项由35个国际临床中心参与的前瞻性、双盲研究中，15,841例孕妇同时进行了NIPT和传统的唐氏筛查，结果显示NIPT对于唐氏综合征的检出率为100%，假阳性率为0.06%，阳性预测值为80.9%；而传统的筛查方案检出率为78.9%，假阳性率为5.4%，阳性预测值为3.4%。相对于传统筛查方案，基于cfDNA的NIPT方案具有高敏感性，低假阳性率，高阳性预测值^[48]。这一方法也可以应用于其他的常见的三体综合征以及性染色体数量异常疾病的 NIPT^{[49, 50]}，但是从目前的结果来看，其准确度不及唐氏综合征。

基于在染色体非整倍体检测中的应用，部分学者尝试采用相同的方法进行染色体微缺失/重复的检测。Chen等^[51]对1311例孕妇血浆DNA样本进行检测，在测序覆盖度为0.08×的情况，检出4例胎儿存在9.01-28.46Mb的缺失/重复，其敏感性和特异性分别是100%和99.92%。Srinivasan等^[52]选择11位孕有染色体核型异常胎儿的孕妇，采用MPS技术进行孕妇血浆中cfDNA测序分析。结果显示MPS可检测出所有的20三体综合征及染色体微缺失/重复，通过提高测序深度可以分辨100Kb以上的拷贝数变异。研究显示通过MPS可以较准确的检测出胎儿染色体微缺失/重复，但是目前仍不清楚其检测的具体极限，而且为了提高检测准确性必然需要增加测序深度，使检测成本也相应的增加，是否适合于临床应用，尚需后续进一步研究。

在临床研究中，偶尔会出现一些由多种因素导致的微小但不可忽略的不一致的结果，即出现一定的假阳性结果，因此NIPT对于非整倍体疾病的检测结果不可作为诊断依据。其中胎盘局限性镶嵌是导致假阳性结果的一个主要原因^[53]。由于目前应用于NIPT的检材是母体的总cfDNA，而cfDNA绝大多数是母源性的DNA，因此母体的染色体重排也会被检出^[54]。

4. 单基因疾病的检测：cffDNA的发现为无创性遗传病产前诊断提供良好的样本来源，近几年针对染色体非整倍体的检测取得了快速发展，但是对于单基因病的无创产前诊断的临床应用却进展比较缓慢。

早期单基因遗传病产前诊断仅局限于母血浆中父源突变等位基因的检测。2000年Amicucci等[55]首次在母血总DNA中检出父源性强直性肌营养不良蛋白激酶（DMPK）基因上的三核苷酸重复扩增序列，实现了常染色体显性遗传病的父源突变诊断^[55]。随后的研究采用不同的技术提高了父源突变检测的准确性，并完成了多个疾病的无创产前基因诊断。为了提高检测敏感性，Chiu等[56]利用突变特异性实时PCR（mutation-specific real-time PCR）技术设计了一种针对β地中海贫血最常见突变型41/42（-CTTT）的检测方案，并在100例孕妇中进行血浆游离DNA检测，经羊水检测证明该方法具有高的特异性和敏感性。并且在随后临床检测中成功通过无创检测在8例高危孕妇中检测到4例携带父源突变等位41/42（-CTTT）。Nasis等[57]对11例囊性纤维化高危孕妇进行了无创产前诊断，采用等位基因特异性PCR（allele-specific PCR，AS-PCR）方法成功从1例孕妇外周血游离DNA中检测到了父源突变D1152H。虽然这种具有较高的灵敏度和特异性，但是其只能用于父源突变导致的常染色体遗传病和父母突变位点不一致的常染色隐性遗传病的排除诊断，最终需要通过有创性的产前诊断进行确诊。而且针对不同遗传病的不同致病位点需要设计专门的检测方案，这大大限制了其在临床的应用。

随着数字PCR（digital PCR，dPCR）[58]和二代测序技术（Next generation sequencing，NGS）^[59]高灵敏度检测方法的快速发展，可以实现核酸的单分子计数，这意味着可以通过比较突变型与野生型（或正常型）等位基因的比例来判定胎儿是否遗传了来自母体的突变体等位基因。如果胎儿受到了影响，则孕妇血浆中突变体等位基因的拷贝数相对增加。最初报道的方法是基于dPCR技术，结合相对突变剂量（Relative mutation dosage，RMD）分析法，通过对孕妇血浆中的胎儿DNA子片段进行计数从而估算等位基因的比率^[33,58]。许多已经发表的关于RMD研究的文章已经证明，这种方法适用于常染色体隐性遗传以及X染色体连锁的遗传病的NIPT^[33]。2010年，Lo等^[23]报道了一种涉及全基因组测序并且包含大规模平行测序（Massively parallel sequencing，MPS）和相对单剂量（Relative haplotype dosage，RHDO）的分析方法，通过孕妇血浆游离DNA高覆盖度测序，共检测到45392个SNPs位点，得到了大约93.94%的SNP位点信息，借助RHDO分析方法获得胎儿基因型。其后，研究者对于RHDO分析法进行了大量更为深入的研究[60]。

随着二代测序技术的发展，大量研究借助MPS进行单基因遗传病的无创产前诊断。Papasavva等^[24]采用NGS靶向测序技术，筛选塞浦路斯人群中β珠蛋白基因上4个高杂合度SNP位点，通过测序分析34个孕妇血浆样本中，其中27例样本正确分析出是否存在父源突变等位基因，结合单倍型分析对10个家系中8个进行了无创产前诊断。New等^[61]采用靶向捕获测序的方法对14个先天性肾上腺皮质增生症（CAH）家系进行了无创产前基因诊断，通过靶向捕获CYP21A2基因序列结合单倍型分析，在19周前均获得了可靠的诊断结果。Ma等^[62]在二代测序基础上结合隐马尔可夫模型（Hidden Markov Model，HMM），对胎儿基因单倍型进行分析，结果显示其对于母源性等位基因判断的准确性为96.41%，父源等位基因的准确性达到97.81%。以上结果均显示靶向捕获测序结合单倍型性分析对胎儿基因型推断是可行的，相对于胎儿基因组直接测序更加高效，而且选用单倍型分析克服了根据不同突变位点设计诊断方案的局限性。

近期Lv等^[63]介绍了一种新的靶基因捕获测序的方法—环化单分子扩增和重测序技术（circulating single-molecule amplification and resequencing technology，cSMART），该技术采用Barcode标记的单分子扩增产物测序，避免了PCR扩增导致的等位基因比例的偏移，通过产物富集测序可精确计算孕妇血浆中DNA突变位点或SNP位点的比例。研究者通过cSMART成功对4个携带ATP7B基因突变的肝豆状核变性（Wilson Disease）家系进行了无创产前基因诊断。

这些新技术共同面临的挑战是如何能够准确地估算母血浆中cffDNA的比例，当cffDNA比例过低时会导致检测出现假阴性结果。怀有男胎的孕妇血浆中Y染色体序列的相对表达量即可直接用于确定cffDNA的含量，然而对于女性胎儿，由于其常规临床应用中没有一种通用的、可靠的胎儿DNA标志物，则很难对其胎儿部分DNA进行准确定量。此外，基于靶序列捕获测序的方法在捕获过程中对导致cffDNA比例出现偏差，而且二代测序过程中出现的测序误差均影响分析结果的准确性。再者这些新技术的检测价格昂贵，操作复杂，也限制了其在临床的应用。因此，在单基因遗传病的NIPT方法在临床上真正得到广泛应用之前，还需要克服很多技术方面和转化方面的挑战。

将NIPT方法引入到单基因疾病的检测过程中同样引发了与非整倍体疾病的NIPT相同的伦理学争议。一些人致力于传统的产前诊断方法，而另一些人则更倾向于NIPT。争议的内容主要为检测过程的简便性与安全性，如果NIPT被看作是常规的检测项目，则可能影响到孕妇的知情选择权，并且可能对孕妇检测造成心理压力等^[64]。

5. 胎儿全基因组分析：一些研究组通过父母基因型测序并且结合多种方法，将父母基因组与单胎胎儿基因组进行了比较，从而得出胎儿全基因组信息^[23,65]。这一进展使得仅通过一次检测即可进行多基因疾病诊断成为可能，但是由于这一技术及数据分析过程极其耗时且非常昂贵，短期内不会应用于临床实践。此外，这种方法的应用前景极为广阔，同时也吸引了许多的伦理学与社会学关注，必须正确的指引其未来的发展方向^[66,67]。

三、小结

基于孕妇血浆中的cfDN进行的更为安全的产前诊断分析方法在近几年得到了飞速的发展，已经应用于多种遗传疾病的临床检测^[68]。随着NGS技术的发展及其在产前诊断中的应用，使得利用cfDNA进行准确率较高的非整倍体疾病筛查也成为可能。一些试剂公司以及私立医疗机构在NIPT的使用及推广方面起到了重要的作用，同时也从中获得了很高的利益。目前面临的主要挑战是需要进一步加强基础设施建设以确保NIPT能够在公共医疗机构的产前保健部门安全有效地进行。同时还需要进一步研究以扩大检测的适用范围，从而使得具有单基因遗传病高发风险的家庭也能够进行NIPT。然而，对于操作的简便性、检测的安全性以及未来可能进一步扩大检测的适用范围等方面也产生了许多重要的伦理学争议，而这些争议需要在其进一步的临床应用发展过程中得到解决。

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