MALDI-TOF飞行质谱在临床微生物鉴定和药敏检测中的应用

作者：刘佳玉 张樱 罗燕萍

【摘要】临床微生物学实验室在感染性疾病的病原学诊断及临床治疗中起着关键作用，尤其是对来自特殊人群的微生物的鉴定，微生物种类的鉴定可以指导抗生素的选择，在药敏试验的帮助下，临床医生可以有效地选择抗菌药物，及时控制感染。因此，一种快速、准确的对抗菌药物的敏感性检测方法对于抗感染治疗至关重要，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技术可以有效、准确地识别不同培养条件下的大量临床微生物分离株。本文详细论述了MALDI-TOF MS的产生背景以及标本的前处理和工作流程，介绍了MALDI-TOF MS在临床微生物鉴定和分型、病原微生物的毒力分析以及细菌耐药检测中的应用，并对目前存在的局限性和在未来临床常规工作中的应用前景进行了探讨。

临床微生物实验室的主要任务是协助临床医生诊断和鉴别各种感染性疾病，指导临床及时合理地用药，而病原微生物的培养往往需要较长的时间，容易耽误患者的及时治疗，因此，感染菌种快速准确地鉴定是决定患者能否及时得到治疗的关键^[1]。质谱（mass spectrometry，MS）通过分析分子离子的质量-电荷比（m/z）来识别和量化分子，能够分析任何电离敏感的生物分子，于1975年首次应用于细菌鉴定^[2]。近年来，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技术对临床标本中微生物的鉴定得到了有效应用。MALDI-TOF MS通过检测微生物特异性的指纹谱图，再与数据库进行匹配分析，从而确定微生物的类型。MALDI-TOF MS的出现减少了大量分析前的工作，是一个快速、高效、低成本且高通量的系统，能够在一小时内完成鉴定，比传统的24-72小时节省了大量时间，不仅可应用于肠杆菌^[3]、葡萄球菌^[4]、肠球菌和β溶血性链球菌等常见菌的鉴定，还使厌氧菌的鉴定得到了提升^{[5, 6]}，快速为临床医生提供用药依据，对自身免疫性疾病或免疫功能低下的个体至关重要^[7]。

一、样本前处理及应用

目前临床常见的大多数革兰阴性菌都可以在固体琼脂培养基上生长，然后选择一个单独的菌落，直接涂在MALDI靶上作为薄膜进行鉴定。而革兰阳性细菌、奴卡菌、分枝杆菌和大多数的酵母样真菌等，使用直涂靶板不能有效破坏其细胞壁，通常需要多步提取方法来保证质量，主要原因和获得谱图与数据库的质量以及技术的局限性有关。对某些临床急诊病例，可以直接从生物样本中直接进行病原体的鉴定，但许多类型的体液可能需要纯化或分离后进行鉴定。

二、MALDI-TOF MS在细菌鉴定中的应用

1. MALDI-TOF MS对血培养阳性瓶直接鉴定细菌的应用：MALDI-TOF MS可直接用于血培养（Blood Cultures，BD）的细菌分离物的鉴定[8]，有研究对584个阳性BCs进行了测试，结果发现562个BCs中含有独特的细菌种类^[9]。然而，当BC中存在混合菌种时，MALDI-TOF MS只能识别出一种细菌，有可能出现误识，并且其无法识别绿藻链球菌、肺炎克雷伯菌和流感嗜血杆菌等。直接分析肉汤血培养时，人体血液成分会产生干扰或噪声光谱。因此，预处理对减少干扰、浓缩细菌具有重要意义。对于革兰阳性菌或肠杆菌类似的生长较快的微生物，在绵羊血琼脂培养基接种后，孵育2-3小时得到的薄菌落层即可在1分钟内进行鉴定，这种方法称为全细胞质谱（Whole Intact-cell MS，WCMS），是一种通过MALDI-TOF MS获取微生物蛋白谱数据的方法。单个细菌或酵母菌落中的微生物作为薄膜直接涂在MALDI靶板上。然后将1µl的HCCA基质溶液（50%的乙腈和2.5%的三氟乙酸配制在超纯水中）滴在涂片上，可以用于大多数细菌蛋白的提取，用于MALDI-TOF MS分析。而有些细菌被多糖或包膜层包裹，例如分枝杆菌和某些酵母菌，很难使用基质溶液获得其内部蛋白质，建议采用乙醇-甲酸（FA）萃取法对这些样品进行高质量的光谱分析，将细菌在300µl纯水中重悬，与900µl纯乙醇混合，用涡流井在数秒内灭活微生物。高速离心2分钟，仔细去除上清液。加入20-50ul70% FA混匀，再加入等量的纯乙腈，涡旋混匀数秒。高速离心2分钟形成细菌颗粒，将1µl上清液涂抹在MALDI靶上。待风干后，用1µl HCCA基质溶液覆盖样品进行检测，这样能够使酵母的鉴定效率得到很大提高^[10]。对于有些微生物生长较为缓慢甚至需要48小时以上的厌氧培养，MALDI-TOF MS可以直接对去除蛋白和培养基等的阳性血瓶进行检测，从而缩短病原体的鉴定时间。

2. MALDI-TOF MS在其他细菌阳性液体样本中的应用：除阳性的血液培养外，临床仍有些其他液体样本需要进行微生物的鉴定，MALDI-TOF MS在大肠杆菌鉴定中的灵敏度为104-105 CFU^{[11, 12]}。但是，该方法的灵敏度主要取决于样本的类型，例如尿液样本可以直接用于细菌鉴定，尿液样本经流式细胞仪检测确认细菌的存在后，取阳性尿液样本4ml，2000g离心30s，去除白细胞和上皮细胞后使用15500g离心5min，收集细菌，使用FA提取细菌蛋白进行MALDI-TOF MS鉴定^[12]。有文献报道使用MALDI-TOF MS快速鉴定细菌性脑膜炎患者脑脊液（CSF）中的病原体，并且使用500ul脑脊液即可进行微生物学诊断，在CSF中加入100µl 13%的SDS，涡旋10s后13000g离心2min，沉淀使用1µl纯水重悬，13000g离心，使用FA提取细菌蛋白后使用MALDI-TOF MS进行鉴定^[13-15]。

三、MALDI-TOF MS在分枝杆菌鉴定中的应用

近几十年来，得到确认的分枝杆菌已超过190个，致病性结核分枝杆菌复合体（MTC）导致结核病（TB）引起的公共卫生问题遍布全球，2016年有10,400,000人感染结核病，1,700,000人死于结核病。许多非结核分枝杆菌（NTM）也是公认的病原体，免疫功能低下的人更容易感染^[16]。由于结核分枝杆菌生长缓慢，不同的菌种使用常规生化鉴定耗时较长，菌落形成后生化反应完全需要7-21天不等，而MALDI-TOF MS比传统方法更加快速、准确和经济，一般在菌落形成后仅需数小时的样本制备就能得到相同的结果，能够提高分枝杆菌的鉴定水平。与此同时，分枝杆菌的灭活是样本处理的关键问题之一，Bruker质谱仪系统使用95℃加热30min的灭活方法，而bioMe rieux质谱仪系统使用硅珠在70%乙醇中以3000 rpm/min的速度涡旋10-15min的方法进行灭活。硅珠在纯乙腈涡旋1min或在70%乙醇中涡旋10-15min。在涡流造成的机械破坏后，样本依次用等量的70% FA和纯乙腈处理。将1µl提取物滴在MALDI靶板上，干燥后用1µl HCCA基质覆盖即可使用MALDI-TOF MS进行鉴定^[17]。对于谱图数较少的一些NTM容易造成数据库的不可靠，仍需进一步研究补充^[18]。近年来开发的一种新的用于表型药敏的MALDI-TOF MS分析法-MALDI Biotyper药敏试验快速测定法（MBT-ASTRA）可用于NTM物种和结核分枝杆菌复合体成员的分析^[19]。

四、MALDI-TOF MS在真菌鉴定中的应用

1. MALDI-TOF MS在丝状真菌鉴定中的应用：Becker等人使用MALDI-TOF MS正确识别了95.4%的丝状真菌分离菌^[20]，Gautier等人对曲霉菌病、镰刀菌病和毛霉菌病患者身上分离的菌株进行了鉴定，建立了2832个参考谱图，可应用于347种霉菌，提高了霉菌的鉴定能力。并且从1107株（98.9%）临床霉菌分离物中鉴定出1094株，对应107个不同种，甚至优于形态学鉴定（78.2%）^[19]。丝状真菌有多种培养和提取方法，如肉汤培养法和庆大霉素氯霉素琼脂板培养法都广泛应用于微生物实验室，通常在27℃下培养72h，收集部分菌丝并使用FA提取，向样本中加入300µl纯水和900µl乙醇，充分混匀后使用13000g离心10min，取上清，风干1h。干燥后的样本使用20-50µl70% FA孵育5min，加入等量的乙腈孵育10min，将样本点在MALDI板子上进行鉴定。对于丝状真菌的鉴定，MALDI-TOF MS似乎比生物化学技术更加准确，且更容易、更快、更便宜，并且可用于近源物种的鉴定。

2. MALDI-TOF MS在念珠菌鉴定中的应用：近几年来，免疫抑制剂的使用和肿瘤患者放化疗造成免疫损伤使得真菌感染呈持续上升趋势，其中白色念珠菌感染是血源性真菌感染的主要病原体^[21]，每年全球约有7,280万患者因酵母菌致病，病死率约为33.9%^[22]。目前临床常用的鉴定的酵母菌的方法主要有显色培养法和生化鉴定仪，但是这两种方法都耗时较长，并且显色培养法的结果判定易受主观因素的影响。MALDI-TOF MS的应用使得念珠菌的药敏试验从至少24h缩短至3-6h，样品制备仅需孵育、离心、提取和点样，每个菌株只需要15min，并且可以同时取得耐药结果，大大缩减了临床工作。因此，基于MALDI-TOF MS的方法凭借其敏感性和特异性等方面的优势以及其快速准确等特点注定将替代传统技术。

五、MALDI-TOF MS在抗生素敏感性检测中的应用

在完成致病微生物的鉴定后，抗生素敏感性试验（Testing for antibiotic susceptibility，AST）对指导抗生素的使用同样有重要作用，尽管MALDI-TOF MS在微生物的鉴定中的使用越来越多，但常规AST仍然主要依赖传统和分子技术^[23]，如纸片扩散法、稀释法（包括琼脂和肉汤稀释法）、抗生素浓度梯度法（E-test法）以及PCR等，而MALDI-TOF MS引入不久后也被应用于AST。原则上，任何通过化学衍生物使抗生素失活而导致质谱峰偏移的耐药机制都可以被检测到，例如碳青霉烯酶是内酰胺类抗生素的内酰胺环水解酶，许多碳青霉烯酶几乎能识别所有的水解内酰胺，而且大多数都能抵抗普通β-内酰胺酶抑制剂的抑制^[24]。另一种观察菌株对特定抗生素或一类抗生素耐药性的方法是分析目标分子，这些分子经过修饰后可产生耐药性。MRSA可能是PBP2α，是转肽酶家族的一个亚群，是细菌细胞壁合成所必需的，然而，PBP2α的大小使得它无法进行快速简单的质谱分析^[25]。单个核糖体蛋白，使菌群对抑制蛋白质生物合成的抗生素（如链霉菌素）具有抗性，例如大肠杆菌30s核糖体蛋白中S7的缺失，这些核糖体蛋白的突变导致耐药性可能被快速和简单的质谱分析检测出来。

六、讨论

MALDI-TOF MS是一种新兴的微生物鉴定技术，具有高通量、低成本、高精度等优点，对于常规临床微生物检验有重要作用。其鉴定的标本可以来源于BCs阳性、尿液或其他体液，以及琼脂平板和肉汤培养基等生长的菌株。已有大量研究证明了其可靠性和准确性，但目前其应用仍存在一些局限，例如，MALDI-TOF MS不适用于区分志贺菌（Shigella）和大肠埃希菌（E. coli）^[26]，百日咳博德特菌（Bordetella pertussis）和支气管炎博德特菌（B. bronchiseptica），木糖氧化无色杆菌（Achromobacter xylosoxidans）和ruhlandii无色杆菌（A. ruhlandii），诺氏拟杆菌（Bacteroides nordii）和salyersiae拟杆菌（B. salyersiae）。肺炎球菌（pneumococci）、绿色链球菌（viridans streptococci）也容易被MALDI-TOF MS错误鉴定。阴沟肠杆菌复合体是一组包含6种相近的物种，他们具有相似的耐药性模式，目前也尚不能区分^[27]。此外，有些菌株中有一小部分具有非常相似的遗传背景或广泛的中间多样性，无法通过质谱信号加以区分，难以获得可信度较高的鉴定结果。微生物鉴定的精度很大程度上取决于数据库条目的数量，对于丝状真菌鉴定的局限性也主要由于参考的谱图，因此，为了提高数据库的性能，必须不断地对参考数据库进行更新，谱图的不断更新和升级以及样本的富集优化能够大幅提高鉴定的效率和效果。数据库的进一步完善可以快速识别抗生素耐药性特征和耐药性，也可以直接识别尿液样本和BCs中的病原体。该技术在未来的诊断实验室中具有重要的应用前景。在抗生素敏感性检测中，标志物的选择和背景是检测的关键因素，即蛋白质中的氨基酸序列和翻译后修饰与个体抗性的关联，以及该标志物表达合成的稳定性。例如，MRSA和KPC的生物标记只对特定类型的耐药菌株有效，阴性结果并不能证明其缺乏耐药。综上所述，MALDI-TOF MS在临床的应用有广阔的前景，同时亦存在一些局限性，需要进一步完善。

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