结核病实验室诊断新技术研究与临床应用前景及进展
结核病自发现以来一直是全球关注重要的公共健康问题之一，严重危害人类的生命安全。据世界卫生组织（WHO）2019年全球结核报告，2018年约有1000万新发结核病患者，而其中约145万例患者治疗无效死亡。在这些病例中，男性患者的比例明显高于女性和儿童。为控制结核病的流行，WHO于2015年提出了“终止结核病策略”，该策略的目标是与2015年相比，2035年结核病导致的死亡人数下降95%，发病人数下降90%。但是随着艾滋病的流行，使结核病的控制难度不断增加，据报告显示8.6%的结核病患者同时感染艾滋病病毒。此外，多重耐药及利福平耐药结核（MDR/RR-TB）的出现且逐年增多，为结核病的治疗和控制带来新的挑战。
中国是结核病高负担国家，新发病例数列全球第二。根据国家十三五结核病防治规划《国务院办公厅关于印发“十三五”全国结核病防治规划的通知》：报告肺结核患者和疑似肺结核患者的总体到位率达到95%以上。病原学检查阳性肺结核患者的密切接触者筛查率达到95%。肺结核患者病原学阳性率达到50%以上。耐多药肺结核高危人群耐药筛查率达到95%以上。所有地市级定点医疗机构具备开展药敏试验、菌种鉴定和结核病分子生物学诊断的能力。所有县级定点医疗机构具备痰涂片和痰培养检测能力。东中部地区和西部地区分别有80%和70%的县（市、区）具备开展结核病分子生物学诊断的能力。但是长期以来，结核病的常规实验室诊断手段仍然主要依赖于抗酸染色、培养等，这些方法阳性率低、特异性差及耗时长，不利于结核病的快速诊断。因此，为有效控制结核病，有必要寻找新的标志物和新型的结核病实验室诊断手段。本文从结核分枝杆菌菌种鉴定新进展、结核分枝杆菌药敏方法新进展、结核病免疫学诊断方法新进展以及各种组学用于结核病诊断的进展等方面予以综述。
一、结核分枝杆菌菌种鉴定方法进展
1. 双色荧光原位杂交测定法（FISH）：荧光原位杂交(FISH)是一种利用标记有荧光分子的短互补探针来定位和检测特定靶DNA或RNA序列的细胞遗传学技术。双色荧光原位杂交测定法（FISH）用于检测培养物中的结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌复合群和相关病原体，敏感性和特异性都达到100%【1】。
2. MALDI-TOF MS：质谱技术作为一种快速的微生物检测技术，能有效的鉴定临床常见快生长以及慢生长的分枝杆菌。鉴定结核分枝杆菌到复合群水平的准确性达100%；66%的菌株可以鉴定到分枝杆菌到种水平；29%的菌株可以鉴定分枝杆菌到群的水平【2】。MALDI-TOF MS对MGIT阳性培养液直接进行分枝杆菌菌种鉴定，用0.1%SDS洗涤1次后第一次检测准确性为89.2%，重复检测准确性达100%【3】。
3. 分子生物学方法：2017年版结核病诊断标准中规定在具备胸部影像学疑似结核病特征的条件下，且患者具有疑似结核病的临床表现的情况下，结核分枝杆菌核酸阳性可作为结核病的确诊条件。16S rRNA是用于细菌菌种鉴定的常用的DNA标记物，可快速鉴定许多细菌到种，但是16S rRNA不能区分结核分枝杆菌复合群中的种。而临床上常用IS6110作为分子靶标，IS6110单独在结核分枝杆菌复合群中发现，且有多个拷贝数，常用于结核分枝的鉴定。IS6110用于结核分枝杆菌菌种鉴定与培养法和AFB染色法相比，具有较高的诊断敏感性和特异性【4】。
（1）Xpert MTB/RIF Ultra：XpertMTB/RIF是一种以半巢式实时定量PCR为技术基础，同时检测结核分枝杆菌和利福平（rifampicin，RIF）耐药的检测方法，不仅结果准确可靠，且结果报告时间短（通常在2h以内）。传统的核酸扩增试验步骤繁琐，实验条件要求高，需要在标准的核酸扩增实验室内进行，而XpertMTB/RIF把PCR扩增和检测过程全部整合到了一个封闭反应盒内，加入样本后，整个反应过程在反应盒内完成。Xpert MTB/RIF Ultra是2017年WHO推荐使用的新一代检测方法，用来替代XpertMTB/RIF。Xpert MTB/RIF Ultra可提高痰涂片阴性结核患者和肺外结核的检出率，使用2个不同的多拷贝结核分枝杆菌靶标（IS6110和IS1081），敏感性较XpertMTB/RIF大大提高，同时也可以改善RIF耐药检测。性能评价结果显示Xpert MTB/RIF Ultra比Xpert MTB/RIF 检测结核杆菌的敏感性提高，尤其在HIV感染合并结核性脑膜炎的病例中，MTB/RIF Ultra检出率大大提高，但特异性有所降低，而两者检测利福平耐药性能相似【5】。
（2）FluoroType MTBDR检测：该方法将线性指数PCR技术（LATE-PCR）和特异性探针技术进行了结合。FluoroType MTBDR最终显示的内容是熔解曲线，曲线的形状则与野生型或突变型相对应。此外，FluoroType MTBDR是一套开放的系统，可通过用于判读熔解曲线的学习软件来识别特定的突变。有学者研究证明FluoroTypeMTBDR检测在涂阳和涂阴标本中检测结核分枝杆菌复合物的敏感性为98%和92%【6】。
（3）CRISPR-MTB测试具有很高的灵敏度，几乎具有单拷贝灵敏度，与Xpert MTB/RIF相比，所需的样品量更少，并且标本周转时间更短。CRISPR-MTB测试多种类型样品比培养物和Xpert MTB/RIF表现出更高的整体诊断效能。作为肺和肺外结核的新诊断技术具有巨大的潜力【7】。
二、结核分枝杆菌药敏方法进展
1. MALDI-TOF MS对结核分枝杆菌进行药敏检测（MBT-ASTRA）：该方法基于分枝杆菌在加有抗菌药物的情况下检测生长情况判断是否耐药。与标准的药敏方法相比，MBT-ASTRA能准确检测175/177结核分枝杆菌和65/66非结核分枝杆菌的药敏。MBT-ASTRA检测结核分枝杆菌药敏的标本周转时间与标准药敏方法没有区别，但检测非结核分枝杆菌时可以提前一周【8】。MALDI-TOF MS法对分枝杆菌菌种鉴定与抗酸染色和培养完全一致，检测基因为mce3B基因，8种药物的耐药性是检测45种染色体突变。MALDI-TOF MS法对临床分离株药敏检测中，敏感性和特异性分别为83%和100%。在对临床痰涂片阴性的标本进行结核分枝杆菌直接检测中，核酸MALDI-TOF MS法比COBAS方法更敏感（61.9% vs. 46.6%），失败率更低（11.3% vs. 26.3%）【9】。
2. Xpert MTB/RIF Ultra的临床应用：与表型药敏实验结果相比较，Xpert MTB/RIF Ultra检测结核分枝杆菌对利福平的耐药性具有非常高的敏感性（70.7%~96.2%）和特异性（84.0%~99.6%）。与DNA测序技术相比，具有非常高的敏感性（92.7%~98.1%）和特异性（99.6%~100%）【10】。
3. 全基因组（WGS）测序在MTB耐药性及其预测中的作用：全基因组测序技术（Whole genome sequencing，WGS）和生物信息学分析（Bioinformatics analysis）由于能够快速详尽地得到耐药细菌的特征，也能更加精细地判断不同菌株间的进化关系，逐渐成为更加有效的技术手段，为耐药性研究提供了有效的帮助。WGS完整地描述了结核分枝杆菌耐药株的基因组特征，能够较为完整地了解耐药基因的突变情况。一些耐药基因的存在如rpoB和rpoC基因突变导致利福平耐药，KatG和inhA基因的突变导致异烟肼耐药，dfrA-thyA双缺失与对氨基水杨酸耐药性相关。有研究人员收集了10290个结核分枝杆菌临床菌株，遍及6大洲，16个国家。随后针对这些菌株进行了4种一线抗结核药物（异烟肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺）表型药敏检测和WGS分析。最后以表型药敏结果为金标准，评估WGS数据能否准确预测结核杆菌临床菌株的药敏信息。结果显示：异烟肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺的WGS耐药性预测的灵敏性分别为97.1%、97.5%、94.6%和91.3%，特异性分别为99.0%、98.8%、93.6%和96.8%【11】。
4. 二代测序：分为基于BD MGIT960早期培养物的二代测序和直接检测临床样本的二代测序。临床样本直接测序关键影响因素之一是DNA的提取效率。直接对痰标本进行二代测序可以在5天内获得结果，比MGIT测序法最多可提早24天，比表型药敏试验最多可提早31天【12】。研究表明直接检测临床标本的二代测序所获得的测序深度与抗酸染色阳性程度没有明显相关，所检测的24个样本中，20个样本直接检测样本与培养后样本所预测的耐药突变相同。与表型药敏结果存在一定的差异，主要与未知的耐药机制有关【13】。
三、结核病免疫学诊断方法进展
1. γ-干扰素释放试验（IGRAs）用于结核病诊断新进展：IGRAs的原理是当机体内被结核菌抗原致敏的效应T细胞，在体外受到相同抗原的刺激（在APC细胞辅助下）后，会分泌大量的γ干扰素。通过IFN-γ的检测来判断结核感染的情况。IGRAs试验灵敏度高，特异性高，快速简便，是一种值得推广的检测方法，为潜伏性感染和活动性结核的辅助诊断，阴性结果对排除结核感染有一定的帮助。IGRAs试验用于筛查潜伏性感染时不受卡介苗接种的影响，但不适用于流行病学筛查。但是IGRAs预测哪些患者将来进展为活动性结核病的方面的应用较少。最近的一个大样本研究评估IGRAs和TSTs显示在低发病率国家，IGRAs和TST的阴性预测值＞99%，但阳性预测值仅为3%-4%【14】。下一代IGRAs发展前瞻需考虑以下几个方面：增加预测潜伏性感染到活动性结核的能力；能够检测结核分枝杆菌感染的临床阶段；监测潜伏感染或结核病的治疗效果；增加新抗原（如Rv3873、Rv3879和Rv3615）及增加更多细胞因子（IP-10，MCP-2，MIG等）来提高IGRA的敏感性。此外，随着结核分枝杆菌的菌量增加，结核特异性的CD8+ T细胞更容易检测到。CD8反应可以初步区别活动性与潜伏感染，与治疗效果相关【15】。
2. 免疫分子用于结核病诊断新进展：在活动性结核病患者体内结核分枝杆菌特异性单阳性TNF-α+和双阳性IFN-γ+/TNF-a+CD4+T细胞的比例显著高于潜伏性感染者和未感染者。此外，表达IL-17的CD4+T细胞（主要为单阳性IL-17+和双阳性IL-2+/IL-17+表型）的频率在活动性结核病患者中高于其他两种组。分枝杆菌特异性CD4+T细胞的数量和功能特征在结核病感染和未感染结核的儿童之间以及潜伏和活动性结核病之间存在显着差异【16】。细胞因子和可溶性粘附分子谱和生物标志物用于治疗监测再治疗涂阳肺结核患者。复治期间，IFN-γ、IL-2、IL-7和可溶性CD54水平以及IL-2/IL-10和IFN-γ/IL-10比率呈上升趋势，可作为复治是否有效的血清指标【16】。IP-10和RANTES的组合可能被用作诊断和治疗监测肺结核中的生物标志物。肺结核患者血浆IP-10和RANTES水平显着高于健康对照组，IP-10和RANTES的组合在训练组中的AUC为1.0时表现最佳。响应治疗时，IP-10和RANTES均显着水平在6个月内减少【17】。
四、各种组学用于结核病诊断的进展
当前结核病实验诊断面临的主要挑战有，区别潜伏感染和活动性结核困难，难以预测哪些潜伏感染患者将来可能发展为活动性结核以及缺乏监测结核病治疗的有效指标。近年来，各种组学的发展在这些方面取得了一定的进展，具有较好的临床应用前景，成为近年来的研究热点。
1. 转录组学用于结核病诊断进展：转录组学用于预测潜伏感染发展为活动性感染。对无症状结核分枝杆菌感染患者的HIV阴性南非病例对照研究中，包含BATF2、GBP5和SCARF1的新型三基因转录特征在90天内进展为活动性结核的阳性预测值为23%。在一项333例HIV阴性结核病患者的新英国队列中，中位随访时间为346天，这一特征获得了50%的阳性预测值和99.3%的阴性预测值。而同一队列中的外周血干扰素γ释放测定仅实现了5.6%的阳性预测值【18】。GBP5、DUSP3和KLF2基因对活动性结核病具有高度诊断性，可以对活动性结核病进行有效诊断，并在多个独立队列中得到验证，同时具有诊断和监测治疗反应的潜在临床应用【19】。
2. 蛋白组学用于结核病诊断进展：无标记定量蛋白质组学鉴定为用于区分肺结核和潜伏感染的新型血浆生物标志物。有研究建立了由α-1-抗胰凝乳蛋白酶（ACT）、α-1-酸性糖蛋白1（AGP1）和E-钙粘蛋白（CDH1）组成的诊断模型，诊断肺结核与潜伏感染的敏感性为75.0％和特异性为96.1%【20】。
3. 代谢组学用于结核病诊断进展：使用非靶向质谱法对结核病患者血浆进行代谢组学分析，揭示用于诊断新生物标志物4'-甲酰基-4'-甲基-5'-胆甾-8-烯-3α-醇与12（R）-HETE或胆固醇硫酸盐结合具有＞70%的灵敏度和＞90%的特异性，用于区分结核病患者和对照组或社区获得性肺炎患者。这些新的单独或组合使用的血浆生物标志物，特别是12（R）-HETE和4'-甲酰基-4'-甲基-5'-胆甾-8-烯-3'-醇对于结核病的快速和非侵入性诊断有意义【21】。
五、结核病实验诊断新技术应用前景展望
在结核分枝杆菌菌种鉴定方面，各种快速鉴定方法，特别是分子生物学方法以及MALDI-TOF MS具有较好的应用前景，Xpert MTB/RIF Ultra在国外已获得批准用于临床检测，提高了结核分枝杆菌的检测灵敏度，特别是在检测脑脊液、胸水等标本中的结核分枝杆菌时取得了非常好的效果。尽管宏基因组测序在感染性疾病病原学检测中发挥了越来越重要的作用，特别是在突发和新发传染病检测方面优势明显，但在结核病检测方面还面临一些挑战。在结核分枝杆菌药敏方面，分子药敏的应用将会越来越广，除了基于PCR的各种分子药敏检测技术外，核酸质谱技术检测结核分枝杆菌对抗结核药物的耐药性也将会得到很好的应用，特别是基于纯培养的全基因组测序技术在结核分枝杆菌分子药敏的检测方面更加具有非常好的临床应用价值，前景广阔。免疫学检测方法，特别是基于CD8反应的检测在区别潜伏感染与活动性感染方面取得一定的进展，值得期待。除此之外转录组学、蛋白组学及代谢组学在区别潜伏感染和活动性结核，预测哪些潜伏感染患者将来可能发展为活动性结核以及监测结核病治疗效果方面取得了一定的进展，但仍需进一步研究数据支撑，有望应用于临床。
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