非小细胞肺癌患者SOX9表达与患者临床病理因素和预后的关系
作者：文洁 韩书山 陈志 张斌 山凤莲
【摘要】目的：通过检测肺癌组织中SOX9表达情况，分析SOX9在非小细胞肺癌中的表达与患者临床病理因素和预后关系。方法：利用生物信息学分析技术筛选出肺癌肿瘤干细胞中差异表达显著的SOX9基因后，首先收集40例我院非小细胞肺癌患者术后肺癌组织、癌旁组织及临床资料。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、免疫印迹实验（Western blotting）和免疫组化实验检测肺癌组织中SOX9表达水平。根据初步结果，再购买87份2004年6月~2009年6月收集的人肺癌组织组成的芯片（HLugA180Su06）扩大标本量（包含87份肺腺癌组织标本蜡块及患者临床及随访10年资料）行免疫组化染色分析患者临床病理特征及预后关系，并经Kaplan-Meier plot在线数据库验证。结果：SOX9在肺癌干细胞中的明显高表达。多数非小细胞肺癌组织中SOX9的mRNA、蛋白表达量均较配对癌旁组织明显升高（P＜0.05）。87份病例都检测到SOX9的表达，高表达占51.7%，随访10年仅32.1%存活。其中的78对肺腺癌及癌旁组织中，无论是定位胞质（χ2=55.617，P＜0.001）还是胞核（χ2=55.841，P＜0.001），SOX9均高表达。在有淋巴结转移（N1~N3）（χ2=6.998，P=0.008）；T分期为T3/T4（χ2=5.202，P=0.023）；临床分期高（Ⅲ/Ⅳ）(χ2=7.362，P=0.007）的患者胞浆SOX9表达明显升高。胞浆SOX9表达量随分化程度降低和临床分期升高而明显上调。胞浆SOX9高表达组的总生存时间明显缩短（P＜0.001），中位时间30个月。女性（χ2=7.878，P=0.005）患者胞核SOX9表达量比男性高；TNM分期较高（χ2=4.185，P=0.041）的患者胞核 SOX9 表达也较高，但预后分析中高低表达两组间并明显无差异（P＞0.05），中位生存时间均为39个月。胞浆SOX9表达水平（HR=2.414，P=0.022）、N分期（HR=1.451，P=0.044）是影响患者预后的独立危险因素。结论：1. SOX9可能是促进非小细胞肺癌发生的潜在功能基因。2. 肺腺癌细胞恶性程度与胞浆内SOX9表达量可能有关。3. 胞浆SOX9高表达是影响肺腺癌患者预后的独立危险因素，SOX9可作为肺腺癌患者各期预后的重要指标。4. 胞浆内SOX9表达水平可能是促进肺腺癌患者病情发展的主要因素。5. SOX9发挥作用的主要途径可能在细胞质内存在。6. 不同性别肺腺癌患者胞核SOX9表达水平不同。
【关键词】SOX9；非小细胞肺癌；肺癌干细胞；肿瘤标志物
在世界范围内，肺癌是首位常见的恶性肿瘤，且是肿瘤相关疾病的主要死亡原因之一[1]，发生率及死亡率仍处较高水平[2]。目前研究已明确肺癌的发病主要与基因突变、多种癌基因过度表达，以及肿瘤抑制基因失活等密切相关。尽管目前非小细胞肺癌已有诸多诊治方法，然而五年生存率也仅为4%~17%[4]，若患者能早发现、早诊断、早治疗肺癌，其获益与生存质量将有极大提高。近年来，SOX（sex determining regionY-box）家族基因主要编码的是一类与干细胞维持相关的转录因子，在胚胎发生中起着关键作用，同时也参与了许多成人组织的病理和生理过程[5-7]。SOX9基因属于SOX家族，位于17q23[8]染色体，最早发现于性别反 转疾病中，在谱系限制、终末分化和干细胞特性维持中作为干细胞相关转录因子发挥作用[5]。近年发现多种实体肿瘤中存在肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC），与正常干细胞类似，CSC具有自我更新能力，同时也可分化为异质肿瘤细胞，引起肿瘤的快速生长、诱导肿瘤的发生、转移、复发以及耐药等[9-11]。有研究认 为肺癌组织中可能存在肺癌干细胞（lung cancer stem cell，LCSCs）[12]，参与肺癌发 生发展的各个过程[9,13,14]。转录因子在干细胞生物学调控中具有重要作用，山中伸弥教授通过引入四种转录因子Oct3/4、SOX2、c-Myc和Klf4，从小鼠胚胎或 成人成纤维细胞中得到诱导多能干细胞，完成了多能干细胞（iPS）的诱导[15,16]。这些iPS细胞系随后被用于形成胚状体（EBs），且经诱导分化还功地生成了黑素 细胞[17]。SOX9作为一种与干细胞维持相关的转录因子，被陆续发现在多种实体恶性肿瘤中表达异常，被认为可能对于维持各类肿瘤干细胞的增殖、自我更新和致瘤能力[18,19]。因此我们推测SOX9基因可能是促癌发生的有效肿瘤干性相关基因。本研究检测了40例NSCLC及87例肺腺癌患者癌组织中SOX9表达情况。旨在通过分析肺癌组织中SOX9表达情况与非小细胞肺癌的临床病理因素和预后关系来进一步探讨SOX9表达情况与临床价值。
一、材料和方法
1. 标本来源及分组：（1）标本及资料来源：40例本院标本收集自在2019年1月~2019年12月于济宁医学院附属医院呼吸科及胸外科行肺癌根治性切除术的非小细胞肺癌患者术后肺癌组织及癌旁组织标本（取自距癌组织边缘大于5cm的正常肺组织）。所需扩大样本量及10年生存率来自向上海芯超生物科技有限公司购买的87份2004年6月~2009年6月收集的患者手术切除肺腺癌及癌旁组织组成的组织芯片（TMA）。（2）分组：将免疫组化所测SOX9染色总分[20]进行分组（SOX9染色总分=染色强度评分*染色阳性率评分）。分别为 a. 细胞浆：将＞4分为SOX9高表达组。b. 细胞核：以＞1分为抗体高表达组。
2. 纳入和排除标准：（1）纳入标准：所有的患者均经病理学确诊为非小细胞肺癌，遵WHO细胞分类法确定组织学类型；并根据第7版美国肿瘤研究联合会（AJCC）进行临床分期。（2）排除标准：（1）患其他肿瘤或风湿性疾病、甲状腺功能亢进等免疫相关性 疾病及治疗史；（2）继发性的肺癌患者或者再检查时发现合并有其他原发性恶性 肿瘤；（3）患者研究所需资料不全，或后期随访6个月失访等情况。
3. 主要仪器与试剂：采用9600型PCR仪（赛默飞世尔科技公司）；CFX96荧光定量PCR检测系统（美国Bio-Rad公司）；化学发光凝胶成像系统（美国Gene公司）。SABC法免疫组化检测试剂盒及抗体稀释液和DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物科技有限公司；PrimeScript RT Master Mix试剂盒和SYBR® Premix Ex TaqTM荧光定量试剂盒购自大连TaKaRa公司；兔（鼠）抗人SOX9 单克隆抗体、兔（鼠）抗人GAPDH单克隆抗和体HRP标记的羊抗兔（鼠）IgG多克隆二抗购于美国Abcam公司。
4. 检测方法：（1）标本临床资料采集：收取符合纳排标准患者术中切取的癌组织和距离癌组织5cm以上的癌旁正常组织，离体30分钟内及时初步处理并分装于不同冻存管中及时置于-80℃冰箱中保存备用。同时分出用于病理检测的组织。40例患者临床病理资料由电子病历系统及电话查询。购买的芯片中包含患者临床病理信息及10年生存情况相关资料，合格资料87份。（2）标本检测：利用CFX96荧光定量PCR检测系统、PrimeScript RT Master Mix试剂盒及SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒进行qRT-PCR和免疫印迹实验检测收集的40对组织标本中SOX9 mRNA和蛋白表达水平，重复实验3次。所测SOX9 mRNA表达量数据结果用2-ΔΔCt法进行计分析算，以β-actin数据为内参。计算公式为：ΔΔCt=[（样本Ct目的基因－样本Ct内参基因）－（对照组Ct目的基因－对照组Ct内参基因）]。
免疫印迹实验结果则用Image J软件对条带进行灰度扫描及结果判读。用苏木精-伊红（HE）染色确定各组织标本蜡块的病理诊断。
注：目的基因SOX9及内参基因β-actin的引物由广州市锐博生物公司设计并合成。详细目的基因及内参引物序列信息见表1。qRT-PCR反应体系见表2。
表1. SOX9及β-actin基因引物序列及产物片段大小
注：F为上游引物，R为下游引物。平台为Primer Premier 5.0软件
表2. 反应体系组成
5. 统计学方法：采用SPSS 22.0、GRAPHPAD Prism 6.0等软件对数据结果进行分析，采用X2检验分析肺癌组织与癌旁组织之间SOX9蛋白的表达差异、SOX9蛋白表达情况与临床病理因素间的差异。Kaplan-Meier和Log-rank检验进行生存预后分析，Cox分析进行危险因素分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
二、研究结果
1. 生物信息学分析：本课题组开始前，经基因表达谱芯片分析技术完成成球细胞（肺癌干细胞）与贴 壁细胞内表达差异基因的筛选，结果显示多种基因在肺癌干细胞中高表达（图1），其中SOX9在球体细胞中的表达较高（图2）（其他差异基因未发表，因此暂不公开）。
图1. 差异表达基因聚类热图 图2. 差异表达基因火山图
2. SOX9在非小细胞肺癌组织及癌旁组织中的表达：（1）40例本院标本验证：患者详细临床病理特点如表2.2.1，患者病理类型中肺腺癌有31例（77.5%）。样本组织内SOX9的表达情况检测结果可以发现，多数非小细胞肺癌组织中SOX9的mRNA、蛋白表达量均较配对的癌旁组织中表达量有显著地升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）（图3A，B）。免疫组化分析示SOX9在肺癌组织内表达水平明显高于癌旁组织（图3C）。
表2.2.1 非小细胞肺癌患者的一般临床资（n=40）
图3. SOX9在肺癌组织中的表达
A：定量qRT-PCR检测SOX9在肺癌组织和配对癌旁组织的mRNA表达（n=40，*p＜0.05）；B：Western blot检测SOX9在肺癌及癌旁组织的表达；C：免疫组化 分析SOX9在肺癌组织和癌旁组织中表达（样本与B图中的N2，T2来自于同一位患者，SOX9抗体1:400稀释度随机取点截图）。
图4. 病例组织制作组织芯片
A图示组织芯片HE染色阵列（0.4X）；B图示组织芯片SOX9免疫组化染色阵列（Enlivision法0.4X）；C图示HE染色结果（×200）; D图示SOX9免疫组化染色结果（×200）。
（2）87份肺腺癌临床标本芯片的SOX9表达情况：患者临床资料如下表2.2.2-1，组织样本行HE染色和免疫组化染色（图4），87份肺腺癌组织标本均检测到SOX9蛋白高表达。根据分组，SOX9高表达组有45例，占51.7%。随访患者10年有28例患者存活，生存率为32.1%。（表2.2.2）在排除脱靶病例后对剩余78组肺腺癌及癌旁组织进行分析，可见78对肺腺癌及癌旁组织中，无论是定位胞质（χ2=55.617，P＜0.001）还是胞核（χ2=55.841，P＜0.001），SOX9在肿瘤组织中均高表达。（表2.2.2-2，2.2.2-3）
表2.2.2-1 87例肺腺癌患者临床一般资料
表2.2.2-2 SOX9（细胞浆内）在肺腺癌及癌旁
注：p＜0.05差异具有统计学意义
表2.2.2-3 SOX9（细胞核）在肺腺癌及癌旁组
注：p＜0.05差异具有统计学意义
3. 细胞浆内SOX9的表达量与癌患者临床病理因素的相关性：卡方检验分析结果显示：在有淋巴结转移（N1~N3）(χ2=6.998，P=0.008)；T分期为T3/T4（χ2=5.202，P=0.023）；临床分期高（Ⅲ/Ⅳ）（χ2=7.362，P=0.007）的患者胞浆SOX9高表达增高。其余方面的差异无相关性（P＞0.05）。（详见表2.3）
表2.3 SOX9表达与肺腺癌患者临床病例因素的关系
4. 细胞浆内SOX9表达与病理恶性程度、临床分期相关性：免疫组化染色结果与病理分级对比，如图5所示，高分化组织、中分化组 织、低分化组织中的胞浆SOX9表达量随分化程度降低而明显上调。同时统计了 肿瘤组织中胞浆SOX9阳性表达率，发现随分化程度降低，胞浆SOX9的阳性表达率有增高趋势。但低分化组与中分化组间的差异没有统计学意义（P＞0.05）。将免疫组化结果与临床分期对比，如图6所示肺腺癌患者临床分期越高，癌组织中的胞浆SOX9表达量越高。
图5. 肺腺癌患者SOX9蛋白表达与病理分级对比
图6. 非小细胞肺癌患者SOX9蛋白表达与临床分期对比
5. 细胞浆内SOX9表达水平与肺腺癌患者预后情况的关系：经Kaplan-Meier生存分析法及log-rank统计检验行单因素分析（表2.5），胞浆SOX9高表达的患者中位生存时间短于低表达组。并且总生存时间高表达组 明显低于低表达组，差异有统计学意义（P＜0.001）。生存曲线详见下图7。同时通过Keplan-merier Plotter数据库验证，结果相一致。（见图 8A、B）。
表2.5 细胞浆内SOX9高表达组与低表达组
注：已删失16（47.1%）低表达，4（8.9%）高表达，该估算限于最大生存时间。 P (Sig.) =0.000，可以认为两组病人的生存率有差异。a. 因部分仍存活无数据显示
图7. （胞浆）SOX9 高表达与低表达组肺腺癌患者的总生存期对比曲线
图8. Keplan-merier Plotter数据库验证SOX9与患者预后关系
6. 细胞核内SOX9的表达增加与肺腺癌患者临床病理因素的关系：卡方检验分析显示（表2.6），女性肺腺癌患者胞核SOX9的表达水平比男性患者明显增高（χ2=7.878，P=0.005）；TNM分期较高（Ⅲ/Ⅳ）的患者胞核SOX9表达显著升高（χ2=4.185，P=0.041）。
表2.6 SOX9表达与肺腺癌患者临床病理因素的关系
注：p<0.05 差异具有统计学意义
7. 细胞核内SOX9表达水平与肺腺癌患者预后情况的关系：进一步采用Kaplan-Meier生存分析法和log-rank统计检验分析见表2.7。胞核内SOX9高表达的患者与低表达组中位生存时间及总生存时间与低表达组 间均并无差异（P=0.154）。生存曲线详见下图9。
表2.7 胞核内SOX9高表达组与低表达组肺腺癌患者的生存情况
图9. （胞核）SOX9高表达与低表达组肺腺癌患者的总生存期对比曲线
注：已删失13（39.4%）低表达，7（15.2%）高表达，该估算限于最大生存时间。P（Sig.）=0.154，可以认为两组病人的生存率无差异。
8. 影响肺腺癌患者生存期的临床病理因素的单因素及多因素分析：单因素Cox分析结果：胞浆SOX9表达水平（HR=2.703，P=0.001）、病理分级（HR=1.965，P=0.007）、淋巴结转移（HR=1.748，P＜0.001）和TNM分期（HR=1.701，P=0.001）是影响肺腺癌患者预后危险因素。Cox多因素生存回归分析表明评估肺癌患者预后的独立危险因素有胞浆SOX9表达水平（HR=2.414，P=0.022）、N分期（HR=1.451，P=0.044）。（详见表2.8）
表2.8 影响肺腺癌患者生存期的单因素及多因素分析
注：p＜0.05差异具有统计学意义
三、分析与讨论
近些年研究表明包括肺癌在内实体肿瘤中存在肿瘤干细胞（CSC）。CSC被称为肿瘤的“起始细胞”，极少数的CSC即可诱导肿瘤的发生[21]。CSC因其具有较强迁移及运动能力在肿瘤细胞浸润、转移、扩散、恶化中起到关键促进作用[22-24]，同时CSC还被认为是肿瘤复发的“种子细胞”，CSC的存在也是肿瘤耐受放化疗的重要机制[11]。肿瘤干细胞受多种基因（如Oct4、SOX2、FOX01A和Nanog）或者信号通路（如Wnt/β-catenin、Notch、Shh和PTEN）调控，以维持其多能干性特征。SOX9作为一种与干细胞维持相关的转录因子，具有维持各类肿瘤干细胞的增殖、自我更新和致瘤能力[18-19]。许多研究表明，SOX9的过度表达可通过多种机制诱导组织发育途径的失调，参与多种癌症的发生和进展，包括结直肠癌、前列腺癌和乳腺癌等[25-28]。本研究通过生物学信息分析发现SOX9在成球肿瘤干细胞中显著高表达。而后进行了临床肺癌组织标本验证SOX9表达上调现象。这与以往研究一致。为了进一步的研究SOX9表达量与肺腺癌患者临床病理特征的关系，本研究利用包含87份肺腺癌组织蜡块的组织芯片，扩大了研究样本，发现结果一致：无论胞浆还是胞核内SOX9均高表达。进一步分析发现临床分期越高，胞浆SOX9上调越明显，且预后明显缩短。相反，细胞核SOX9并不影响患者预后。另外，细胞核SOX9表达增高还表现出与患者性别有关系。具体意义还需进 一步扩大样本或结合扩展探究其是否与性别相关激素差异等有关系。以往研究发现肺腺癌中SOX9在人类NSCLC的各个阶段都是上调的，并且临床分期越高上调程度越明显[29]。本研究结果与之相符，也支持了SOX9可能作为识别肺癌患 者中具有更严重疾病亚群的生物标记物的观点。胞浆内SOX9高表达和肿瘤淋巴结转移密切相关，提示SOX9过度表达促进了非小细肺腺癌的远处转移。上皮间质转化（epithelial tomesenchymal ransition，EMT）是一个诱导静止的贴壁细胞获得迁移能力的发育过程，并与增强的干细胞特性相关。大多数肿瘤细胞的EMT过程是细胞失去分化的过程。EMT致使CSC中E-cadherin等粘附分子表达降低而容易诱发肿瘤的转移[30]。表明SOX9的过度表达可能通过诱导EMT促进肿瘤的转移[31]。因许多信号通路参与了EMT介导的转移，包括TGF-β、Notch和WNT等通路[32-34]。因此利于进一步探究SOX9发挥作用的途径。随着分化程度的降低（即恶性程度增加），胞浆SOX9的表达量有明显增高的趋势。上皮间质转化在胃癌干细胞的出现中起着关键作用[35]，胃癌的发生是上皮细胞在上皮间质转化过程中的去分化后获得间充质干细胞特征。因此，我们认为不同分化程度的肺癌组织可能在一定程度上反映了肿瘤干细胞的数量。肺癌组织中SOX9免疫组织化结果支持了这个观点。因SOX9蛋白在细胞质和细胞核的表达不同预后结果不同，我们推测SOX9可能主要在细胞质内发挥作用。比如SOX9可能是通过Wnt/β-catenin途径促进EMT，从而促进NSCLC的转移影响预后等[36]。但SOX9在细胞质中有较多的下游效应分子，它也可能是通过其他途径或相关蛋白分子起作用，目前研究并不明了，因此我们还需要做更多深入的研究来论证此种观点。
综上，SOX9基因在肺癌的发生发展中可能起着促癌基因的作用，也可为肺癌发展阶段的有价值标志物。本研究中因样本量较少，关于随着分化程度的降低（即恶性程度增加），SOX9的表达量有明显增高的趋势这项结果未能得出统计学上的意义。但今后将继续进扩大样本量，行更多更深入的关于NSCLC进展的分子机制的研究，以期为肺癌的诊断、治疗及预后判断提供新的靶点。
四、结论
SOX9在肺癌组织中呈异常高表达状态，提示SOX9是促进非小细胞肺癌发生的潜在功能基因。随肺腺癌分化程度降低或者临床分期越高，胞浆SOX9表达量有增高趋势，且总生存期明显缩短。提示肺腺癌恶性程度及进展与胞浆内SOX9表达量可能有关系，提示SOX9可作为肺腺癌患者各期预后的重要指标。另外，胞浆内SOX9的表达水平或可能是促进肺腺癌患者病情发展的主要因素，即其发挥作用的主要途径可能在细胞质内存在，此为进一步研究具体机制提供了方向。另外，研究发现不同性别肺腺癌患者胞核SOX9表达水平不同，具体意义还需进一步扩大样本或结合扩展探究其是否与性别相关激素差异等有关系。
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