血清同型半胱氨酸参考测量程序的建立及应用

作者：王晓建  陈佳祎  王宏喜  贾全  王茜  陈丰娟  王琳琳 付红伟  刘希

【摘要】目的：本文期望建立同位素稀释高效液相色谱串联质谱法（ID-LC/MS/MS）测定人血清同型半胱氨酸的参考测量程序，并利用其对九强生物常规测定系统进行量值溯源，通过完整溯源链传递，保证常规方法测定结果的准确性。方法：筛选色谱和质谱条件，以及前处理优化，建立同型半胱氨酸ID-LC/MS/MS参考测量程序，依据ISO17511规定建立HCY量值溯源体系，用建立的参考测量程序对常规检测系统进行量值溯源。结果：测定血清样品同型半胱氨酸的线性范围为1~80μmol/L。重复性精密度和复现性精密度的RSD分别小于1.72%和2.90%。测定血清型参考物质SRM1950和SRM1955的偏倚小于0.82%和1.81%。参考测量程序与工作校准品的相关性系数R2为0.9952，斜率为1.0099，工作校准品与产品校准品的相关性系数R2为 0.9984，斜率为1.005。结论：成功建立了ID-LC/MS/MS法测定人血清中同型半胱氨酸参考测量程序，并应用该方法对九强生物常规测定方法进行量值传递，从参考测量程序到常规检测系统，完成完整溯源链传递，保证了九强常规检测系统测定结果的准确性。

【关键词】同型半胱氨酸；液相色谱；串联质谱；量值溯源

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是蛋氨酸代谢产生的一种含硫氨基酸，80%的Hcy在血中通过二硫键与蛋白质结合，只有很少一部分游离同型半胱氨酸参加循环。Hcy水平与心血管疾病密切相关，是心血管疾病疾病发病的一个重要危险因子。因此，准确、高效地检测血液中Hcy水平具有重要意义^[1-4]。目前，用于Hcy检测的方法主要有酶循环法、气相色谱-质谱联用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、放射免疫分析法、高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）、全自动荧光偏振免疫法及液相色谱串联质谱（isotope-dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry，ID-LC/MS/MS）等^[5]。其中GC-MS和ID-LC/MS/MS，因其特异性强、灵敏度高、重复性好等被检验医学溯源性联合委员会（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）认定为参考测量程序^[6-8]。但设备昂贵且操作复杂、耗时较长。酶循环法检测快速，适用于全自动生化分析仪，无需样本预 处理。因此，本研究以ID-LC/MS/MS为比对方法，评价酶循环法测定血清Hcy水平的正确度，为临床常规检测血清Hcy的正确性提供依据；并通过与参考测量程序比对，调整常规检测系统，保证常规检测系统的测定结果与参考测量程序一致，以提高常规临床检测的质量。

一、材料和方法

1. 样本：美国国家标准和技术研究院（the National Institute of Standards and Technology，NIST）SRM1950和SRM1955有证标准物质，40份新新鲜人血清样本，6个水平的Hcy工作校准品。

2. 仪器与试剂：（1）仪器API5500三重四极杆质谱仪，配有电喷雾离子化源（ESI）以及 MultiQuant 3.0.3数据处理软件购自美国AB SCIEX公司。1260 Infinity高效液相色谱仪购自美国Agilent公司。Supelcosil CN（4.6×250mm，粒径5μm）氰基柱购自美国 Supelco公司。SQP型电子分析天平购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。Eppendorf移液器购自德国Eppendorf AG公司。1-15PK型高速冷冻离心机购自德国sigma公司。BE-3100型混匀仪购自江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司。Milli-Q Reference A+型超纯水仪购自美国Millipore公司。HITACHI 7180全自动生化分析仪（日本日立公司）及配套试剂（酶循环法）、校准品。（2）试剂：Hcy-d8内标（纯度为99.5%）购自加拿大CDN Isotopes公司，DL-Homocysteine（纯度为95.6%）、DL-二硫苏糖醇（色谱级）和三氟乙酸（色谱级）购自美国Sigma公司，甲醇（色谱级）、甲酸（质谱级）和乙腈（色谱级）均购自美国Thermo Fisher公司。实验用水为一级水。

3. 同型半胱氨酸标准溶液与样品的前处理：（1）标准溶液的配制：按照Satterfield等人[8]的参考测量程序，精密称取干燥的DL-高胱氨酸标准物质适量，纯水定容至100mL容量瓶中，得到同型半胱氨酸浓度为100μmol/L的储备液。分别稀释得到同型半胱氨酸浓度为1、2、5、10、20、50、60、80μmol/L的系列浓度样本。称取适量的同型半胱氨酸同位素标记物，1.5%DTT定容至100mL容量瓶中，得到同型半胱氨酸标记物浓度为20μmol/L的内标工作液。（2）样本前处理：准确称取样本或标准物质50μL置于1.5mL离心管中，各加入50μL Hcy-d4标准工作液，再加入30μL还原剂二硫苏糖醇（浓度为10%），旋涡混合2min后室温平衡15min，再各加入270μL蛋白沉淀剂乙腈（含0.1%（v/v）甲酸和0.05%（v/v）三氟乙酸）溶液，涡旋混合2min后，静置15min后，再进行涡旋混合2min，以13,000g离心2min，膜过滤后，用于LC/MS/MS分析。

4. 色谱与质谱条件：（1）色谱条件：流动相A为0.1%甲酸甲醇溶液，流动相B为0.1%甲酸水溶液，流 速为0.5mL/min，进样量为5μL，柱温为30℃，梯度洗脱。

表1. 液相色谱洗脱条件

（2）质谱分析条件：以电喷雾电离源（ESI）正离子模式和多反应监测（MRM）模式分析，监测用于定量的离子转变为m/z136 → 90和m/z140 → 94。检测的离子化电压（IS）为5500V，雾化气（GS1）为50psi，辅助加热气（GS2）为50psi，气帘气（CUR）为35psi，碰撞气（CAD）为6psi，雾化温度（TEM）为550℃，去簇电压（DP）为60V，入口电压（EP）为10V，出口电压（CXP）为13V，碰撞能量（CE）为14eV。

5. 样本检测：检测SRM1950和SRM1955标准物质及6个浓度的工作校准品进行参考测量程序正确度、精密度等指标的确认。赋值及验证：使用同型半胱氨酸参考测量程序为工作校准品赋值后，使用工作校准品校准九强选定测量系统，与参考测量系统同时测定至少40例新鲜血清样本。将这组血清的测量值进行方法学比较的直线回归统计，要求相关系数≥0.975，斜率在1.00±0.03范围内，则赋值有效。工作校准品校准九强选定测量程序后为产品校准品赋值，使用产品校准品校准九强常设测量系统，与选定测量系统同时测定至少20例新鲜血清样本。将这组血清的测量值进行方法学比较的直线回归统计，要求相关系数≥0.975，斜率在1.00±0.03范围内，则赋值有效。

6. 统计学方法：采用Excel2007软件和Origin 8.1软件进行统计分析。以ID-LC/MS/MS作为比对方法，评价Hcy常规检测系统测量结果的正确度。采用常规线性回归分析法评价常规方法（酶循环法）与参考测量程序之间的偏倚。

二、结果

1. 同型半胱氨酸参考测量程序的确认：（1）同型半胱氨酸参考测量程序的线性：由同型半胱氨酸标准储备液和型半胱氨酸标记物储备液稀释得到系列型半胱氨酸工作标准溶液，保证每个工作标准液中同型半胱氨酸标记物的含量严格相同。在1.4的LC/MS/MS条件下，检测了方法的线性。在1~80μmol/L范围内方法线性良好，线性相关系数r=0.9999。采用3倍信噪比计算方法的检出限为26.5pg。（2）同型半胱氨酸参考测量程序的不精密度：为考察方法的不精密度，本研究考察了重复性精密度和复现性精密度两种，实验设计如下：一天内对同一浓度样本进行三次测定，每次测定三个平行样本，此为一个批次，得方法的重复性精密度；同一浓度样本按上述方法测试三个不同批次，得方法的复现性精密度。本研究共考察了6个浓度的工作校准品，其结果如表2所示。其中工作校准品的重复性精密度为 0.10~1.72%和复现性精密度为1.52~2.90%；表明方法精密度良好。

表2. ID-LC/MS/MS测定工作校准品中同型半胱氨酸浓度（μmol/L）

（3）同型半胱氨酸参考测量程序的正确度评价：用本研究建立的方法对NIST血清标准物质SRM1950和SRM1955（浓度Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）进行测量，其结果如表3所示。NIST标准物质SRM1950中血清同型半胱氨酸一个浓度的测量：测量值与证书标称值的相对偏差为0.82%，浓度值在NIST证书值的范围内。NIST标准物质SRM1955中血清同型半胱氨酸三个浓度的测量：测量值与证书标称值的相对偏差，低浓度样品为-1.26%，中浓度样品为-1.81%，高浓度样品为-0.51%，此三个浓度值均在NIST证书值的不确定度范围内。

表3. ID-LC/MS/MS法测定标准物质SRM1950和SRM1955

2. 同型半胱氨酸参考测量程序的应用：（1）同型半胱氨酸传递溯源链：用建立的ID-LC/MS/MS同型半胱氨酸参考测量程序对九强产品校准品进行量值溯源，量值传递溯源链见图1。（2）参考测量程序与主校准品线性回归分析图以同型半胱氨酸参考测量程序测量工作校准品，通过临床样本调值。参考测量程序与工作校准品临床样本测定结果线性回归分析见图2，回归曲线的斜率为1.0099，斜率在1.00±0.03内，相关系数R2=0.9952；工作校准品与产品校准品临床样本测定结果线性回归分析图见图3，回归曲线的斜率为1.005，斜率在内1.00±0.03，相关系数R2=0.9984，测定结果可比性较好，满足赋值要求。

图1. 同型半胱氨酸量值传递溯源链

图2. 参考测量程序与工作校准品线性回归分析

图3. 工作校准品与产品校准品线性回归分析图

三、讨论

血清中Hcy水平的变化是多种疾病诊断的重要指标，检测结果的准确性具有重要的临床意义。酶循环法检测试剂盒广泛应用于临床样本检测，为了保证样本结果的准确性，本研究参照JCTLM推荐的参考测量程序（ID-LC/MS/MS法）进行了色谱和质谱条件的优化建立了人血清同型半胱氨酸参考测量程序，并依据ISO17511文件建立了完整的溯源链，从而保证常规方法测定结果的准确性。

参考文献

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