国产飞行时间质谱Autofms1000在丝状真菌快速鉴定中的应用

作者：封松利  李越峰  牛亚静  孙苛苛  刘美丽  赵高岭

【摘要】MALDI-TOF MS在微生物的鉴定中发挥着重要的作用，被临床上广泛应用，特别是在细菌和酵母菌的鉴定中应用更为普遍。近年来随着质谱技术的发展和丝状真菌前处理方法的不断优化，商业数据库的不断扩充和优化，MALDI-TOF MS在丝状真菌的鉴定中的研究日益增多，充分显示了其在丝状真菌鉴定方面的优势。本研究通过多基因座测序技术确定了70种244株丝状真菌的名称，并利用MALDI-TOF MS进行鉴定分析，与测序结果比对，MALDI-TOF MS的种水平鉴定准确率为95.49%，属以上水平鉴定准确率为98.77%，充分体现了MALDI-TOF MS在丝状真菌鉴定种的优势，操作简便、快速、准确率高，通量高，有望成为多基因座测序技术的替代方法。

【关键词】MALDI-TOF MS；丝状真菌；快速鉴定

近年来，随着激素、免疫抑制剂和广谱抗生素在临床上的广泛使用，免疫功能低下人群数量不断增加，由真菌引起的侵袭性真菌感染越来越多，遍布临床各个科室，发病隐匿，进展迅速，临床表现缺乏典型性，早期诊断困难，病死率高，严重影响人类的健康和生活。目前真菌的鉴定主要还是依靠形态学鉴定为主^[1]，对真菌的准确鉴定与操作者的经验和工作年限密切相关，由于真菌形态特征复杂多变，且易随环境的变化而表现不同的形态特征，加之临床上抗真菌药物的使用使真菌的鉴定更加困难；分子生物学方法虽然检测的准确性高，但操作复杂对人员操作要求高，且有些特殊的丝状真菌仍无法检测和鉴定。快速、准确的真菌鉴定方法成为临床诊断和治疗的关键要素^[2]。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，缩写MALDI-TOF MS）技术是近年来迅速发展起来的一种新型软电离质谱技术，以其操作简单、快速、鉴定准确率高、通量高的优势，成为临床微生物鉴定的生力军，并实现对丝状真菌的快速、准确的鉴定^[3-6]。本研究通过多基因测序的方法确定临床菌株的种名，应用MALDI-TOF MS的方法完成鉴定，从而评价MALDI-TOF MS在丝状真菌快速鉴定中的应用价值。

一、材料与方法

1. 材料：2017-2019年临床分离的丝状真菌样本，及CICC的丝状真菌菌株。

2. 仪器：全自动微生物质谱检测系统Autof ms1000（郑州安图生物工程股份有限公司）；离心机（Sigma），质谱样本预处理试剂（郑州安图生物工程股份有限公司），质谱样品处理基质溶液（郑州安图生物工程股份有限公司），霉菌培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），沙保罗琼脂培养基（郑州安图生物工程股份有限公司），微生物质谱鉴定仪用校准品（郑州安图生物工程股份有限公司），Fungi Genomic DNA Extraction Kit（Solarbio）。

3. 方法：（1）菌株接种培养方法：在生物安全柜中将菌株转接于沙保罗琼脂培养基上，封口膜密封平板后放入霉菌培养箱中25-28℃培养3-7天。（2）菌株测序：菌株培养后取适量菌体，利用试剂盒提取DNA，由北京睿博生物公司完成测序工作。（3）MALDI-TOF MS鉴定方法：取沙保罗培养基培养的菌株的菌体，悬浮于1ml 75%的乙醇中，涡旋震荡1-2min，静置约5min，13000rpm离心2min，弃去上清，重新离心1min，用移液器吸取剩余的上清液，自然晾干10-15min，加入30-50ul裂解液1，用移液器吹打直至菌体裂解。取1ul裂解液点于靶板上，每个样本点2个靶点，同时在靶板上制备校准位点（点1ul微生物质谱校准品），自然晾干，干燥后取1ul HCCA基质覆盖，干燥后置于质谱仪内检测。

4. 数据统计与分析：鉴定完成后统计鉴定结果及最高鉴定分值，并与多基因座测序结果比对计算准确率。鉴定分值符合质谱种水平判断标准且与测序结果名称一致的为准确的种水平鉴定，鉴定分值符合质谱属水平判断标准且与测序结果名称一致的为准确的属水平鉴定。

二、 结果与分析

1. 所分析菌种种类及数量：本研究共研究了244株菌种的分析（表1），包括烟曲霉（22）、黄曲霉（18）、黑曲霉（27）、构巢曲霉（11）等曲霉菌，橘青霉、寄生曲霉、草酸青霉，产黄青霉等青霉菌，互格交链格孢霉，卷枝毛霉、总状毛霉等毛霉属菌株，米根霉、小孢根霉，匍枝根霉等根霉属菌种、哈茨木霉、里氏木霉、长梗木霉等木霉属菌种，及犁头霉、横梗霉，拟青霉属等70种真菌。

表1. MALDI-TOF MS鉴定结果统计表

2. MALDI-TOF MS鉴定结果分析：MALDI-TOF MS鉴定结果如表1所示，本研究中所分离70种菌种得到准确的鉴定，在曲霉、青霉、根霉、木霉、镰刀霉等属真菌鉴定中，MALDI-TOF MS都能快速完成鉴定。在曲霉菌的鉴定中，除了部分聚多曲霉和杂色曲霉外其他曲霉的鉴定都在种水平，主要原因为这两种曲霉的图谱相似性较高，易混鉴定；青霉菌、拟青霉菌的鉴定结果相对较好，仅歧皱青霉鉴定为属水平，其他菌株都能准确鉴定至种水平；木霉、毛霉、根霉、犁头霉等菌株由于前处理效果较好，图谱稳定，鉴定效果比较好；特别需要提出的是出芽短梗霉，由于该类菌株在培养过程中产生粘液等次生代谢物，在前处理的时候需要特殊的处理，促使菌体蛋白的释放，完成鉴定。

通过将MALDI-TOF MS鉴定结果与测序结果比对，鉴定分值符合质谱种水平判断标准且与测序结果名称一致的为种水平鉴定，鉴定分值符合质谱属水平判断标准且与测序结果名称一致的属水平鉴定，其中种水平鉴定准确性为95.49%（233/244），属水平以上鉴定准确性为98.77%（241/244），误鉴定1.22%（3/244）。主要为杂色曲霉和聚多曲霉,杂色曲霉和聚多曲霉的图谱相似度较高，易混鉴定。

三、讨论

MALDI TOF MS在丝状真菌快速鉴定中的应用近年来成为很多学者所关注的热点。丝状真菌MALDI-TOF MS鉴定的主要影响因素包括前处理方法、数据库的覆盖度及丝状真菌的成熟程度^[2-4]等，不同的前处理方法和菌株的成熟程度会影响菌体蛋白的释放率，建库所用的图谱，及数据库的质量和鉴定结果，本研究应用厂家推荐的前处理方法及菌株培养时间，得到较高的鉴定准确率。与其他研究者的结果一致^[7-11]。数据库的覆盖度也会直接影响菌株的鉴定结果，自然界中丝状真菌种类复杂，但基于MALDI TOF MS丝状真菌商业数据库中的菌种数量有限，通过建立自建库可以提高数据库的覆盖度，从而提高菌株的鉴定准确率^[12-13]，A. Alanio等人构建了28种曲霉的数据库，并鉴定了124株临床分离株和16株环境分离株，种水平鉴定138株，鉴定率为98.6%，由于所构建的数据库中包含了新生和成熟菌落的图谱，临床分离株的成熟程度不影响鉴定结果[8]。McMullen等鉴定了临床分离的43个属319种的真菌，证明数据库的扩充可以提高真菌的鉴定率，在曲霉鉴定中的正确率为93.6%，仅有10株菌被误鉴定，与表型分析相比，MALDI-TOF MS能够快速的鉴定真菌，并且错误的鉴定是比较少见的^[14-15]，为了提高MALDI-TOF MS的鉴定准确性，需扩展MALDI-TOF MS数据库中每个物种的菌株数量，以涵盖物种内部的变异性[16]。

本研究利用多基因座测序的方法确定菌株的名称，MALDI-TOF MS鉴定结果与多基因座的结果差异不大，与其他研究的结果一致^[8，15-18]，与测序方法相比，MALDI-TOF MS更适合常规临床实验室工作流程，更利于在临床实验室的普及和提高。Wigmann, É. F.等构建了藤仓镰刀霉复合群中菌种的数据库，鉴定了80多种非参考菌株的鉴定，鉴定准确率为94.61%；MALDI-TOF MS是一种用于在FFSC内鉴定和区分物种的合适且准确的技术，也是多基因座测序技术（MLST）的创新，省时的替代方案^[19]。

本研究中关系较近的菌种聚多曲霉和杂色曲霉的鉴定效果不好，由于它们的图谱相似度较高易混鉴定。对于关系比较紧密的丝状真菌如何用MALDI-TOF MS准确的鉴定还需要进一步的研究，需重点关注前处理方法的优化、数据库的构建及算法的完善方面，以求达到准确区分的目的。Elizabet D’hooge等研究了黑色组曲霉，证明MALDI-TOF MS能够区分巴西曲霉，A. brunneoviolaceus、黑曲霉、新黑曲霉、塔宾曲霉等^[20]。Mohammad T. Hedayati等研究了黄曲霉和米曲霉的MALDI-TOF MS鉴定，揭示构建自建库对于黄曲霉和米曲霉的成功鉴定是很有必要的^[21]。

最近的研究表明MALDI-TOF MS对菌种的复合群中各种菌株的鉴定区分及分型也有巨大的潜力，主要问题在于对前处理方法的优化，以得到更多的菌株蛋白信息^{[11, 19-21]}，及利用特征峰的差异性进行算法的优化而达到正确分型的目的^[22]。另外近来的一些研究表明随着抗真菌药物的使用，部分真菌对相应药物的敏感性有所下降，并已有学者研究了进行MALDI-TOF MS在真菌药敏中的应用价值^[23-24]。相信在不久的将来MALDI-TOF MS在丝状真菌的鉴定、分型、药敏中会发挥越来越重要的作用。

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