血小板计数参考测量程序及测量不确定度评定方法
作者：廖全兰 周永杨 祝毅
【摘要】目的：探讨血小板计数参考测量程序测量人血血小板的测量不确定度评定方法。方法：实验室按照国际血液学标准化理事会（ICSH）提出的血小板检测方法和国家卫生部发布的《WST 244-2005血小板计数参考方法》现行标准，建立血小板计数参考测量程序并对样品进行检测，识别并分析测量不确定度的来源，量化不确定度分量，计算其合成不确定度、扩展不确定度，并对测量不确定度进行评估。结果：本文中人新鲜全血样本中的血小板平均值为231×109/L，其合成不确定度为4.2/L，扩展不确定度为8.4/L。结论：本综合实验室评定了基于血小板计数参考测量程序的测量不确定度，证明其可以满足血小板参考测量能力的需要。
【关键词】血小板计数；参考方法；参考测量；不确定度
血小板计数是临床上诊断和鉴别止血和血栓性疾病的重要依据，血小板的动态变化可以提供许多有用的信息，是临床上最为常见的检测手段，有助于临床诊断和用药治疗。2001年国际血液学标准化理事会发布了红细胞/血小板比值法进行血小板计数的方法[1]，随后国家卫生部出台了《WST 244-2005血小板计数参考方法》行业标准[2]，要求血小板计数必须溯源至参考方法才能保证其结果的可靠性和准确性。
医学参考测量实验室的工作必须保证其提供的结果可以溯源至现有的最高级计量学等级，并保证其提供的计量服务可满足医学要求[3]。由于采用红细胞/血小板比值法这一间接方法对血小板进行计数，在实际测量过程中影响因素众多，因此正确识别测量过程中的不确定度来源，客观评估各不确定度分量在测量过程中的影响，提高PLT测量结果的准确性和可靠性，是医学参考测量实验室质量管理中的重要内容。
本文中血小板按照《WST 244-2005血小板计数参考方法》上的参考方法进行测定。血小板测量不确定度按照GUM的原则和方法进行评定[4]，其中所有不确定度分量均依据《JJF 1059.1-2012测量不确定度评定与表示》进行评定[5]，按照《CNAS-CL54检测和校准实验室能力认可准则在血细胞分析参考测量领域的应用说明》的要求进行讨论[6]。
一、材料与方法
1. 主要仪器：流式细胞仪FC-500（美国贝克曼库尔特有限公司），10μL、100μL和5mL移液器（RAININ），1000mL容量瓶（ASONE）。其中流式细胞仪由生产商出具检定报告，移液器由深圳天溯计量测试股份有限公司进行检定。
2. 主要试剂：无水磷酸氢二钠（Na2HPO4）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）购买于国药集团化学试剂有限公司，纯度均为分析纯。牛血清白蛋白（BSA）购买于上海西宝生物科技有限公司。白细胞分化抗原CD41和CD61购买于贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司。
3. 血液样本：本公司持有健康合格证的志愿者的新鲜血液，用一次性使用真空采血管收集（江苏康健医疗用品有限公司）。血液加入抗凝管后，管内剩余空间至少占试管体积的20%。样本置于22℃±4℃条件下应在3h内完成测试，避免血液凝血和红细胞溶血出现。
4. 测量原理和方法：（1）本参考测量程序采用间接法计数血小板。即用荧光标记PLT后，用流式细胞仪检测红细胞和PLT的比值，同时用单通道阻抗原理的半自动细胞计数仪准确计数RBC，用RBC除以RBC和PLT的壁纸得出PLT的计数值。（2）首先将EDTA抗凝血标本用无菌缓冲液进行预稀释，再用特定的荧光抗体对PLT进行染色。溶液中已染色的血小板被稀释成计数浓度，用流式细胞仪检测血小板和红细胞，根据荧光强度和散射光强度将阈值设在可从RBC中区分PLT的位置，以检测出RBC和PLT的比值。用RBC的计数值除以RBC/血小板的比值计算出PLT计数值。
5. 血小板测定步骤：（1）稀释液的配置方法：①将1.15g Na2HPO4加到约750ml去离子水或蒸馏水中并使其溶解。②将210mg KH2PO4，8.0g NaCl，200mg KCl和1.0g BSA的混合物中加入去离子水或蒸馏水至1000ml，保存于4℃~8℃条件下。③用低附着性的平均孔径在0.20~0.25μm之间的滤膜过滤，室温下保存在密闭的聚乙烯塑料瓶中。（2）测量步骤的顺序：①用移液器加5μl充分混匀（至少轻柔颠倒标本管8次）的血标本于100μl已过滤的PBS-BSA稀释液中。②加5μl CD41抗体和5μl CD61抗体染液，在室温18℃~22℃、避光条件下放置15分钟。15分钟后，加4.85ml PBS-BSA稀释液制备成1:1000的稀释标本，轻轻颠倒混匀以保证PLT和RBC充分混匀。③将准备好的样本放入流式细胞仪中进行检测。用流式细胞仪检测时，应至少检测到5000个信号，其中PLT应多于1000。流式细胞仪的设定必须保证每秒计数少于3000个信号。如果同时收集到RBC散射光的信号和血小板的荧光信号应被视为RBC-PLT重叠，计数结果将分别被计入RBC和PLT。④使用Z2粒子计数仪对原血中RBC数目进行计数。
6. 建立数学模型：血小板计数参考方法测量新鲜人血血小板的计算公式如下：
式中：
PLT表示血小板计数；
RBC表示红细胞计数；
D1表示收集RBC散射光的信号；
D2表示收集RBC散射光的信号和血小板PLT荧光信号RBC-PLT重叠部份；
D4表示收集血小板PLT荧光信号。
7. 识别不确定度的来源：分析实际操作过程中，血小板计数的不确定度如图1所示主要包括9个来源：（1）方法重复性引入的相对不确定度urel，rep；（2）红细胞数计数引入的相对不确定度urel，RBC；（3）收集RBC散射光的信号引入的相对不确定度urel，D1；（4）收集RBC散射光的信号和血小板PLT荧光信号RBC-PLT重叠部份引入的相对不确定度urel，D2；（5）收集血小板PLT荧光信号引入的相对不确定度urel，D4；（6）100μL移液器引入的不确定度uVp1；（7）10μL移液器引入的不确定度uVp2；（8）5mL移液器引入的不确定度uVp3；（9）1000mL容量瓶引入的不确定度uVflask。血小板计数测量不确定度的计算公式如下：
……（3）
图1. 不确定度评定鱼骨图
二、结果与分析
分析不确定度的来源之后，通过A类评定和B类评定将其量化。方法重复性引入的不确定度和收集到的RBC、RBC-PLT重叠部分、PLT信号所引入的不确定度采用A类评定计算其相对标准不确定度；试剂配置过程中引入的不确定度采用B类评定将其量化。
表1. 参考方法测量重复性引起的不确定度依据
1. 参考方法重复性测试引入的不确定度（urel,rep）：取1份健康人新鲜血液样本，按照上述检测步骤重复检测12次，测试计算结果如表1所示。测试结果的不确定度采用贝塞尔公式法进行计算。按照公式4计算出PLT均值为231×109/L。随后将其带入公式5，自由度为n-1，计算样品实测值的标准差，表征测得值的分散性。根据公式6和7最终求得其相对标准不确定度urel,rep。具体数据详见表5。
2. 红细胞数计数引入的不确定度（urel，RBC）：红细胞计数测量不确定度分量包括5个方面：（1）方法重复性引入的相对不确定度urel，frep；（2）加样体积引入的相对不确定度urel,Vsample；（3）稀释体积引入的相对不确定度urel,Vdiluent；（4）计数体积引入的相对不确定度urel,Vreaction；（5）仪器引入的相对不确定度urel,fc。计算得出urel，RBC为0.0139。该来源于《红细胞计数测量不确定度评定报告》。
3. 收集RBC散射光的信号引入的相对不确定度（urel，D1）：取1份健康人新鲜血液样本，按照上述检测步骤重复检测12次，测试计算结果如表2所示。测试结果的不确定度采用贝塞尔公式法进行计算。按照上述公式进行计算最终求得其相对标准不确定度urel, D1。具体数据详见表5。
表2. 测量重复性引起的不确定度依据
4. 收集RBC散射光的信号和血小板PLT荧光信号RBC-PLT重叠部份引入的相对不确定度（urel，D2）：取1份健康人新鲜血液样本，按照上述检测步骤重复检测12次，测试计算结果如表3所示。测试结果的不确定度采用贝塞尔公式法进行计算。按照上述公式进行计算最终求得其相对标准不确定度urel，D2。具体数据详见表5。
表3. 测量重复性引起的不确定度依据
5. 收集血小板PLT荧光信号引入的相对不确定度（urel，D4）：取1份健康人新鲜血液样本，按照上述检测步骤重复检测12次，测试计算结果如表4所示。测试结果的不确定度采用贝塞尔公式法进行计算。按照上述公式进行计算最终求得其相对标准不确定度urel，D4。具体数据详见表5。
表4. 测量重复性引起的不确定度依据
6. 100μL移液器引入的相对标准不确定度（uVp1）：100μL移液器校准证书显示，其扩展不确定度为0.12μL（k=2），校准引入的标准不确定度为0.12/2=0.0600μL。实验室的温度在22±4℃内变动，该影响引起的不确定度可通过估算该温度范围和体积膨胀系数来进行计算，水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1，因此产生的体积变化为±（100×4×2.1×10-4）=±0.0840μL，假设温度变化按矩形分布，则温度引入的标准不确定度为0.0840/ 3 =0.0485μL。移液器引入的标准不确定度为uVp1= 0.06002+0.04852 =0.0772μL，相对标准不确定度urel,Vp1为0.0772/100=0.000772μL。
7. 10μL移液器引入的相对标准不确定度（uVp2）：根据厂家提供的移液器说明书中可知，10μL移液器的准确性0.01μL，符合均匀分布，所以移液器加样体积引入的标准不确定度为：
。若实验室的温度在22±4℃内变动，该影响引起的不确定度可通过估算该温度范围和体积膨胀系数来进行计算，水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1，因此产生的体积变化为±（10×4×2.1×10-4）=±0.00840μL，假设温度变化按矩形分布，则温度引入的标准不确定度为0.00840/ 3 =0.00485μL。移液器引入的标准不确定度为uVp2 = 0.005772+0.004852 =0.00754μL，相对标准不确定度urel,Vp2 =0.00754/10=0.000754μL。
8. 5mL移液器引入的相对标准不确定度（uVp3）：根据厂家提供的移液器说明书中可知，5mL移液器的准确性30μL，符合均匀分布，所以移液器加样体积引入的标准不确定度为：
。若实验室的温度在22±4℃内变动，该影响引起的不确定度可通过估算该温度范围和体积膨胀系数来进行计算，水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1，因此产生的体积变化为±（5000×4×2.1×10-4）=±4.200μL，假设温度变化按矩形分布，则温度引入的标准不确定度为4.200/ 3=2.425μL。移液器引入的标准不确定度为
uVp3 = 17.3202 + 2.4252 =17.489μL，相对不确定度urel,Vp3=17.489/5000=0.00350μL。
9. 1000mL容量瓶的不确定度（uVflask）：按照1000mL容量瓶的计量标准，在20℃时，A级容量瓶的容量允差为±0.3mL，容量变化符合三角分布，因此容量瓶的校准不确定度为uVflask=0.3/ 6=0.122mL；与微量移液器相似，温度的标准不确定度为utemp=0.485mL，因此A级1000mL容量瓶的合成标准不确定度为uc, Vflask= 0.1222+0.4852 =0.500mL，相对合成标准不确定度为urel, Vflask=0.0005。
表5. 血小板参考测量数据及不确定度
10. 计算合成不确定度和扩展不确定度：将上述各不确定度分量按照相对不确定度进行合成。
合成不确定度乘以95%置信水平下的包含因子（k=2）可以得到扩展不确定度。以本文中的实验样品为例，其血小板平均值PLT=231×109/L，其合成标准不确定度uc=4.2/L，则扩展不确定为8.4/L，血小板计数表示为：（231±8.4）109/L（k=2）。
三、结论
本文建立在血小板计数参考测量程序的基础上探讨全血血小板计数测量不确定的评定方法。本测量不确定度的评定按照GUM的原则和方法进行评定，其中主要讨论了方法重复性、仪器和试剂配制所带来的不确定度分量，其分量评定均依据《JJF 1059.1-2012测量不确定度评定与表示》进行。采用间接法——红细胞/血小板比值法对血小板进行测量，在实际检测过程中，红细胞计数引入的不确定度分量相较其他分量而言对血小板的测量结果影响较大。通过不确定度的评定可以了解测量过程中各分量对结果的影响程度，加强实验室的实际检测中重要环节的质量控制，提高血小板计数的准确性和可靠性。
参考文献
International, C.F.S.I. and S.O.L.H. International, Platelet counting by the RBC/platelet ratio method. A reference method. American journal of clinical pathology, 2001. 115(3): p. 460-464.
中华人民共和国卫生部, WST 244-2005 血小板计数参考方 [S].
中国合格评定国家认可委员会, 医学参考测量实验室认可准则：CNAS-CL07: 2018[S].
Guide to the expression of uncertainty in measurement (GUM) [S].
国家质量监督检验检疫总局, JJF 1059.1-2012测量不确定度评定与表示[S].
中国合格评定国家认可委员会, 检测和校准实验室能力认可准则在血细胞分析参考测量领域的应用说明：CNAS-CL54: 2014[S].
