双链DNA抗体水平和亲和力与SLE患者病程的关系以及对两种检测方法能力的影响
作者：田野 张云聪 冯珍如 闫惠平 张岩 张海萍 李佩 郑芳芳聂秋燕 刘晴 王晓宁 张国军 谭延国
【摘要】目的：探讨dsDNA抗体水平和抗体亲和力与SLE疾病活动性的关系，分析两种dsDNA抗体检测方法检出能力具有差异的原因。方法使用ELISA法和IIF法同时测定300例SLE和495例非SLE自身免疫疾病患者，以及300例健康人血清中的dsDNA抗体，然后进一步测定ELISA法检测为阳性样本的dsDNA抗体亲和力指数。结果：（1）SLE组dsDNA抗体水平和抗体亲和力指数分别显著和非显著地高于疾病对照组〔抗体水平：285.8（164.5～463.3）vs 172.9（135.3～200.1），（P=0.038）；抗体亲和力指数：32.3（19.2～50.7）vs 15.5（9.5～49.8）（P=0.169）〕，并分别与SLEDAI评分显著正相关（P=0.000，0.002）。（2）ELISA法和IIF法同时检测为阳性的样本，其dsDNA抗体水平和亲和力指数均分别显著高于单ELSIA法检测为阳性组〔抗体水平：355.6（236.1～547.1）vs 196.2（148.9～300.6），P=0.000）；抗体亲和力指数：33.1（23.5～52.7）vs 22.1（13.6～48.1），（P=0.024）〕。结论：dsDNA抗体水平及亲和力指数与SLE疾病活动性密切相关，这表明较高的抗体量和亲和力可能参与了疾病进程，可作为病程监测的指标。IIF法相比ELISA法，更倾向于检测出相对较高亲和力的dsDNA抗体。
【关键词】dsDNA抗体亲和力；dsDNA抗体水平；间接免疫荧光法；系统性红斑狼疮
双链DNA（dsDNA）抗体是系统性红斑狼疮（SLE）的特征性血清标志物，该抗体阳性为SLE的临床诊断标准之一，并用于SLE患者病情活动程度、肾脏受累和治疗监测的指标。抗体阳性的健康个体，将来发生SLE的风险也较高。我们先前的研究发现，酶联免疫吸附试验（ELISA）和间接免疫荧光法（IIF）检测dsDNA抗体，具有较好的互补性，联合两种方法可以较大程度地提升其在SLE患者中的检出率；在非SLE自身免疫性疾病dsDNA抗体阳性的个体中，ELISA法单独阳性的比例为66.7%（8/12），而SLE患者中这一比例为30.5%（50/164）[1]。基于上述发现，有必要进一步探讨ELISA法和IIF法对dsDNA抗体检出能力具有较明显差异的深层次原因，以及SLE与非SLE自身免疫性疾病患者血清中dsDNA抗体性质的异同。dsDNA抗体亲和力与SLE病情关系的相关研究提示我们，造成上述现象深层次原因是否与dsDNA抗体的亲和力有关[2-4]。为此，本研究使用ELISA和IIF法同时检测SLE和非SLE自身免疫性疾病患者血清dsDNA抗体，对ELISA法检测为阳性样本进一步测定其抗体亲和力指数，并评估dsDNA抗体水平和抗体亲和力指数与SLE疾病状态以及检测方法间的关系。
一、临床资料与方法
1. 一般资料：留取2014年5月到2015年6月于北京大学第一医院、首都医科大学附属复兴医院和北京佑安医院就诊患者血清样本共计1095例。其中SLE患者300例（以下称为LE组）。包括干燥综合征（SS）100例、类风湿关节炎（RA）98例、原发性胆汁性肝硬化（PBC）100例、小血管炎（SV）100例和97例包括OAID，包括结缔组织病、克罗恩病、特发性血小板减少性紫癜等在内的非SLE自身免疫性疾病患者共495例（作为疾病对照组，以下称为非SLE组），以及300例健康人作为健康对照组（HC），见表1。SLE的诊断依据1997年美国风湿病协会（ACR）的标准进行。其它自身免疫性疾病的诊断分别按相关指南进行。并对120例SLE患者的疾病活动度进行评分（SLEDAI2000评分标准）。SLEDAI评分≤4分患者被认为处于疾病稳定期，SLEDAI评分＞5分则处于疾病活动期。
表1. 样本信息
2. 试剂与仪器：ELISA试剂使用德国欧蒙公司的抗dsDNA-NcX抗体检测试剂盒，IIF试剂选用欧蒙公司的间接免疫荧光检测dsDNA抗体试剂盒。全自动酶标仪为爱得康公司ADDCARE500、荧光显微镜为奥林巴斯CX40。
3. 方法：非抗凝静脉全血分离血清后，置于-80℃冰箱保存待用。所有样本用ELISA和IIF法同时检测dsDNA抗体，然后进一步测定ELISA法检测为阳性样本的抗体亲和力指数。在保证实验环境和仪器处于最佳状态下，严格按试剂盒要求进行实验操作。
dsDNA抗体亲和力指数检测方法（尿素变性法）：对ELISA法检测dsDNA抗体为阳性的样本，重新用ELISA法进行测定，每个样本设立实验孔和对照空。加入稀释的血清样本温育后洗板1次，实验孔加入200微升尿素溶液，对照孔加入200微升洗液，作用10分钟后洗板，以洗脱掉实验孔中的低亲和力抗体。其余检测步骤同dsDNA抗体。抗体亲和力指数=A实验孔/A对照孔×100（A为吸光度）。
4. 统计学处理：采用SPSS19.0进行数据处理。偏态分布数据采用M（P25～P75）描述，使用Spearman相关性分析、直线回归分析。两样本间dsDNA抗体水平及抗体亲和力的比较采用两独立样本的秩和检验（Mann-Whitney U检验），以P＜0.05判断差异是否有统计学意义。
二、研究结果
1. dsDNA抗体水平及其亲和力指数在不同人群中的分布：dsDNA抗体阳性个体中，SLE组dsDNA抗体水平为285.8（164.5～463.3）IU/ml，显著高于非SLE组的172.9（135.3～200.1）IU/ml（P=0.038）（表2）；SLE组dsDNA抗体亲和力指数虽高于非SLE组，但差异不显著：32.3（19.2～50.7）vs 15.5（9.5～49.8）（P=0.169），见表2。明确为活动期的96例SLE患者，其dsDNA抗体水平为96.7（12.1～383.9）IU/ml，非常显著的高于24例非活动期患者的20.9（0.001～52.6）IU/ml（P=0.005）（表3）。
表2. SLE组和非SLE组dsDNA抗体水平和抗体亲和力指数比较（ELISA法检测阳性的病例）
表3. SLE活动期患者（96例）与稳定期患者（24例）dsDNA抗体水平的比较（IU/ml）
2. dsDNA抗体水平及抗体亲和力指数与SLE疾病活动度的关系：300例SLE患者中，有120例进行了SLEDAI评分。首先分析了SLEDAI评分与dsDNA抗体水平的关系。评估过SLEDAI评分的120例SLE病例中，有50例dsDNA抗体阳性，这50例患者SLEDAI分数与dsDNA抗体亲和力指数间呈显著的正相关关系。所有ELISA法测定为阳性的病例（共133例，包括SLE和非SLE患者在内），其dsDNA抗体水平与抗体亲和力指数间呈显著的直线正相关关系，具体见表4。
表4. SLEDAI评分、dsDNA抗体水平及抗体亲和力指数三者之间的相关性
3. ELISA法和IIF法对不同亲和力dsDNA抗体的检测能力：133例ELISA法检测dsDNA抗体为阳性的样本中，IIF法也阳性的为77例（ELISA和IIF法均阳性组），其抗体亲和力指数为33.1（23.5～52.7），IIF法阴性为56例（ELISA法单阳性组），其抗体亲和力指数为22.1（13.6～48.1）。ELISA和IIF法均阳性组dsDNA抗体亲和力指数显著高于ELISA法单阳性组（P=0.024）。就dsDNA抗体水平而言，ELISA和IIF法均阳性组为355.6（236.1～547.1）IU/ml, 显著高于ELISA法单阳组的196.2（148.9～300.6）IU/ml（P=0.000）。
三、分析与讨论
在SLE患者体内，作为抗原物质的dsDNA诱导并活化B淋巴细胞，进而合成致病性dsDNA抗体。该抗体与疾病的关系已被广泛研究[3-5]。检测dsDNA抗体最常用的方法是ELISA法和IIF法，由于ELISA法可以定量检测dsDNA抗体水平，便于观察治疗效果，故而被广泛使用。测定dsDNA抗体亲和力的方法有RIA法、色谱技术及ELISA法等，但以ELISA法最常用。本研究参照文献在ELISA法的基础上，采用尿素变性技术构建而成[6]。我们先前的研究显示，dsDNA抗体在SLE人群中的检出率（ELISA：42.3%；IIF：38%）非常显著地高于非SLE对照组（ELISA：1.2%；IFF：0.8%）和HC组（ELISA：0%；IIF：0%）[1]。本研究进一步分析了dsDNA抗体阳性的样本，其抗体水平和亲和力指数在不同人群中的分布状况。
dsDNA抗体阳性的患者中，SLE组dsDNA抗体水平显著高于非SLE自身免疫性疾病对照组，同时SLE疾病活动期dsDNA抗体水平也明显高于稳定期患者。抗dsDNA抗体水平增高则疾病活动程度（SLEDAI评分）有增加趋势，这点与先前的研究结果相符[7]。以上结果进一步印证了dsDNA抗体参与了SLE的病理生理，以及与SLE患者疾病活动性的紧密关系。
dsDNA抗体亲和力指数SLE组为32.3（19.2～50.7），同非SLE组的15.5（9.5～49.8）相比，虽然差异不显著（P=0.169），还是可以明显看出前者高于后者的趋势。之所以差异不显著，可能是非SLE对照组dsDNA阳性例数过少所致（6例）。另外，由于处于稳定期的24例SLE患者中，只有3例dsDNA抗体阳性，故没能够就活动期以及稳定期SLE患者dsDNA抗体的亲和力进行进一步比较。上述两部分内容需要增加样本量后进一步研究。
本研究显示，dsDNA抗体亲和力指数越高，通常SLE患者疾病越活跃；而且随着抗体水平的增高，dsDNA抗体亲和力也存在逐渐趋于成熟，这也印证了Suh-Lailam BB等的结果[4]。故临床工作中，在对dsDNA抗体进行定性和定量检测的同时，测定dsDNA抗体的亲和力指数也能从另一个侧面反映疾病的严重程度。
我们先前的研究表明，ELISA法与IIF法检测dsDNA抗体，对SLE的诊断具有较大互补性，即有相当比例的SLE患者，其dsDNA抗体只有ELISA法可以检出，或者只有IIF法可以检出。这其中ELISA法单独阳性样本比例在所有不一致的结果中占57.5%（50/87），而在所有入组样本中这一比例上升为61.1%（58/95）。两种方法检测结果出现差异的原因，可能是包被抗原（dsDNA）的种类、来源及流程存在差别所致，导致对不同亲和力的dsDNA抗体的检出能力不同[8-9]。本研究进一步证实，ELISA和IIF法均阳性的样本，其dsDNA抗体亲和力指数显著高于单独ELSIA法阳性样本。这与之前缺乏证据支持的观点IIF法检测dsDNA抗体，所针对的亲和力谱位于中、高亲和力的观点相符（通过大量的文献检索，并未找到相关文献）。也就是说，某些ELISA法检测dsDNA抗体单独阳性的SLE及非SLE自身免疫性疾病患者是因为体内抗体水平较低且为低亲力抗体所致。但对于非SLE个体，随着抗体水平的增加和抗体亲和力成熟，其致病性逐渐增强，有机会发展为SLE，这可能是dsDNA抗体阳性的个体将来发展为SLE的根源所在。
总之，尿素变性法检测dsDNA抗体亲和力指数切实可行。随着dsDNA抗体水平和抗体亲和力指数的增加，SLE患者疾病有变得活跃和趋于恶化的倾向。IIF法和ELISA法对dsDNA抗体亲和力谱具有不同的识别能力。
参考文献
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