血液学指标在α-地中海贫血筛查中的临床应用价值

作者：谢屿平  曹颖平  祝先进  周文娟  卢娉霞

【摘要】目的：分析福建省不同地区α-地中海贫血（α地贫）的基因类型与构成比，比较相应的血液学表型特征，探讨平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白量（MCH）、血红蛋白量（Hb）、红细胞分布宽度/红细胞计数（RDW/RBC）对该地区α地贫初筛的价值。方法：通过Gap-PCR法检测α地贫缺失型突变，反向点杂交法检测非缺失型突变位点，对α地贫基因型进行分型确定，并分析确诊的α地贫患者血液学数据，通过分析ROC曲线确定本地区α地贫的最佳截断值，分析血液学指标在α地贫中的筛查价值。结果：纳入的772例α地贫患者中，共发现16种基因突变类型，以--SEA/αα缺失型突变521例最为常见（67.49%）。与对照组相比，同性别不同分型的患者MCV、MCH、Hb之间的均值差异均有统计学意义，而RDW/RBC值在男性患者中标准型和HbH病2组与对照组相比差异有统计学意义，女性α地贫患者中仅有HbH病组与对照组差异有统计学意义。MCV＜81.25fl、MCH＜27.30pg、Hb男性＜128.5g/L，Hb女性＜123.5g/L为本实验室α地贫的最佳截断值，具有较高的特异性与敏感性。结论：由于地域异质性以及各个医院设备环境的不同，不同实验室应建立适宜本地区的α地贫初筛截断值。今后本实验室可选择MCV＜81.25fl、MCH＜27.30pg、Hb男性＜128.5g/L、Hb女性<123.5g/L作为临床筛查α地贫初筛值。

【关键词】地中海贫血；α地中海贫血；平均红细胞体积；平均红细胞血红蛋白量；ROC曲线

地中海贫血是全球最大的单基因遗传病之一，根据突变基因的不同可以分为α地中海贫血与β地中海贫血^{[1, 2]}。α地中海贫血（αThalassemia）是由于α珠蛋白基因突变或缺失，使α肽链的合成速率降低或不能合成，导致α链与非α链数量的不平衡，不能合成正常的血红蛋白。临床上表现为溶血性贫血，疾病的严重程度与临床分型和突变的α基因数量相关^{[3,  4]}。地中海贫血与地域有关，福建省地处我国东南沿海，与地中海贫血高发的广东、江西两省相邻，从人群的交流和迁徙，还有地域等因素上推断福建省地中海贫血的基因携带率和患病率都相对较高。然而福建省对于α地贫的研究报道相对较少，且没有建立适宜本地区的α地贫血液学筛查截断值，现对福建地区α地贫的基因检测结果以及血液学特征进行分析，以了解当地的α地贫特征，并评估适宜本实验室的α地贫最佳截断值。

一、材料和方法

1. 病例资料：收集2015年1月至2018年1月期间在福建医科大学附属协和医院就诊发现的福建地区α地贫患者772例，以及体检中心健康对照者200例，所有研究对象或儿童家长均同意并签订知情同意书后纳入本实验。研究对象都来自福建各地区，包括有福州、宁德、龙岩、漳州、厦门、泉州、莆田、南平、三明纳入的α地贫患者中男性277例，女性495例，中位年龄34（2-87）岁；纳入的对照组为在本院体检的健康人，男性115例，女性85例，中位年龄36（2-80）岁。

2. 试剂与仪器：全自动核酸分子杂交仪（亚能生物技术有限公司，深圳），地中海贫血基因检测试剂盒购自深圳亚能生物有限公司，全自动血细胞分析仪（Sysmex XN2000，日本），梯度PCR仪（ABI公司，美国）。

3. 地贫基因检测：采用Gap-PCR法检测3种α地贫基因缺失位点（-3.7，--SEA，-4.2），用反向点杂交法检测α地贫常见的非缺失型突变位点，对地贫基因型进行分型确定。

4. 血常规检查：采用EDTA抗凝的真空无菌管采集2ml患者静脉血，混匀后，通过全自动血细胞仪（Sysmex XN2000）对患者的红细胞各个参数进行检测，检测的项目包括平均红细胞体积（Mean corpuscular volume，MCV）、平均红细胞血红蛋白量（Mean corpuscular hemoglobin，MCH）、血红蛋白量（Hemoglobin，Hb）、红细胞分布宽度（Red cell distribution width，RDW）、红细胞计数（Red blood count，RBC）等。

5. 统计学分析：通过查阅病史收集纳入病人的基本信息、实验室检查，将各项资料进行统计分析。 采用SPSS 10.0软件。呈正态或近似正态分布的计量资料以mean±SD表示，非正态分布计量资料以中位数来表示，多组间计量资料用单因素方差分析来比较，进一步两两比较采用Dunnett t检验。P＜0.05示差异有统计学意义。并绘制ROC曲线，评价血液学指标的最佳截断值以及相关的性能指标。

二、研究结果   

1.α地贫基因类型与构成比：本次分析的772例α地贫患者中，共发现16种基因突变类型，其中杂合子突变768例，纯合子突变4例。以--SEA/αα缺失型突变521例最为常见（67.49%），其次是-α3.7/αα缺失型突变80例（10.36%）与--SEA/-α3.7复合缺失型突变73例（9.46%）（表1）。

Table 1. The genotypes and composition ratio of α-thalassemia

2. 血液学指标MCV、MCH、Hb、RDW/RBC在α地贫患者中浓度情况：将α地贫患者按照临床分型分为静止型、标准型、HbH病与HbBart's病，与对照组相比，同性别不同分型的患者MCV、MCH、Hb之间的均值差异均有统计学意义（P＜0.05）。而红细胞分布宽度与红细胞计数比值（RDW/RBC）男性患者中标准型和HbH病两组与对照组相比差异有统计学意义，女性α地贫患者中仅有HbH病组与对照组差异有统计学意义（表2）。

3. 血液学指标在α地贫诊断中的价值：将α地贫与健康对照组按照性别分组，分析各项相关指标。以（1-特异度）为横坐标，灵敏度为纵坐标，将各指标的结果绘图，连接各点使之成ROC曲线分别如图1与图2所示，并计算每条ROC曲线的曲线下面积（receiver operating characteristic curve，AUC）以及各个相关指标，在约登指数最大（Youden’s index，YI）时找出最佳截断值（Cut-off值），并求出相应的灵敏度（Sensitivity，Sen）、特异度（Specificity，Spe）、阳性预测值（positive predictive value，PPV）、阴性预测值（negative predictive value，NPV）如下表3、表4所示。

Figure 1. ROC curve of α-thalassemia and health controls in males

Figure 2. ROC curve of α-thalassemia and health controls in females

Table 2. Materials of hematological parameters in different clinical types

Table 3. Performance assessment of related hematological parameters for diagnosis of α-thalassemia in males

Table 4. Performance assessment of related hematological parameters for diagnosis of α-thalassemia in females

三、分析与讨论

地中海贫血是全世界分布范围最广、受累人数最多的常染色体隐性遗传病^{[1, 5]}，最早发现于地中海沿岸，还好发于东南亚、非洲、中东、印度次大陆以及我国南方地区，南方地区以广西、广东、江西的发病率较高^[6-9]。福建省地处我国东南沿海，与地中海贫血高发的广东、江西两省相邻，从人群的交流和迁徙，还有地域等因素上推断福建省地中海贫血的基因携带率和患病率都相对较高。然而福建省对于地中海贫血的研究报道相对较少，且没有大范围的流行病学的调查研究报道。本研究对象是2015年1月至2018年1月期间在福建医科大学附属协和医院就诊发现的α地贫患者，作为省级三甲医院接收的患者基本上都是福建省的人群，其所收集的患者信息具有一定的地域代表性。α地贫患者根据同源染色体上α基因异常的情况以及临床严重程度的不同可分为静止型、标准型、HbH病与Hb Bart's病^[10]。1个α基因突变往往无明显的临床症状，称为静止型，2个α基因异常称为轻型或标准型，可有轻度贫血，3个α基因异常又称为Hb H病，表现为轻中度贫血，出现HbH和Barts带，4个α基因异常即胎儿水肿综合征，又称为Hb Bart's病^{[3, 4]}。其中以Hb Bart's病最严重，4个α基因都异常，不能合成α链，胎儿期无HbF，多余的γ链聚合成四聚体，4个α基因都缺失的胎儿多胎死宫内或在产后数小时内死亡^[11]。在本次分析的772例α地贫患者中，共发现16种基因突变类型，1个α基因异常的有-α3.7/αα、-α4.2/αα、αQSα/αα、αWSα/αα、αCSα/αα；2个α基因异常：-α3.7/αQSα、--SEA/αα、-α3.7/-α3.7、-α4.2/-α4.2、αCSα/αCSα、-α3.7/-α4.2；3个α基因异常：--SEA/-α3.7、--SEA/-α4.2、--SEA/αCSα、--SEA/αQSα、--SEA/αWSα，未检出4个α基因异常的患者。其中以--SEA/αα缺失型突变521例最为常见（67.49%），其次是-α3.7/αα缺失型突变80例（10.36%）与--SEA/-α3.7复合缺失型突变73例（9.46%）。与Luo等^[12]报道的福建北部地区α地贫患者构成比以--SEA/αα（82.67%）与-α3.7/αα（9.34%）为主相似，但比例有差异，该调查仅分析了186例α地贫患者，本次调查共772例患者，扩大了样本量，使统计学分析更有代表性。而邻近地区深圳的调查结果显示^[13]缺失型α-地贫以--SEA/αα、-α3.7/αα与-α4.2/αα为主，非缺失型α地贫以CS突变为主，本研究中的非缺失型突变以QS为主，2项统计有较大差异，可能由于地域差异，而移民城市深圳的居民来自全国各个区域而造成的基因构成复杂。

地贫的确诊需要地中海贫血基因检测，而在一些基层社区医院以及在一些医疗机构尚比较薄弱的偏远地区，无法开展基因检测，因而血常规检测就成了重要的筛查地贫的指标。在生理状况下，受雄激素、促红细胞生成素的影响，男女的血液学参数的正常水平就存在差异，因此，本研究将受检者按照性别分组，与对照组相比，同性别不同分型的患者MCV、MCH、Hb之间的均值差异均有统计学意义（P＜0.05），并且随着α基因异常个数的增多，相应的血液学指标呈下降趋势。而RDW/RBC比值在男性患者中标准型和HbH病2组与对照组相比差异有统计学意义，女性α地贫患者中仅有HbH病组与对照组差异有统计学意义。

AUC曲线下面积是一项能反映方法准确性的参数，取值范围在0.5-1，当取值超过0.9时，诊断的准确性较好^[14]。本研究中统计了MCV、MCH、Hb与RDW/RBC这4项指标，其中，MCV对男性α地贫诊断的准确性最高，AUC为99.6%，MCH对女性α地贫诊断的准确性最高，AUC为99.4%，RDW/RBC对α地贫的诊断性较低。从本文的结果可以看出，男性与女性临界值MCV与MCH的截断值差异不大，选择MCV<81.25fl时为最佳cut-off值，此时男性α地贫灵敏度96.5%，特异度100%，阳性似然比100%，阴性似然比95.0%，女性α地贫灵敏度93.9%，特异度100%，阳性似然比100%，阴性似然比96.6%。关于MCH，若是以筛查为目的，可以选择MCH＜27.30pg有很高的灵敏度。本研究的结果与目前国际常用的地中海贫血高危人群的筛查指标MCV＜80fl、MCH＜27pg^[15]有一定差异，由于人群异质性与医院仪器、检测方法等实验环境的不同，不同医院最适宜的cut-off值可能会有所不同，须根据结果选择适宜本地区的α地贫初筛值。Hb指标诊断价值也较高，男性α地贫AUC为93.5%，女性α地贫AUC为95.9%，而对α地贫的诊断性别影响较大，男性α地贫临界点＜128.5g/L，女性α地贫临界点＜123.5g/L，建议今后在以Hb作为α地贫筛查指标之一时，对不同性别应设定不同的筛查标准。因此本实验室可选择MCV＜81.25fl、MCH＜27.30pg、Hb男性＜128.5g/L，Hb女性＜123.5g/L作为临床筛查α地贫初筛值。

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