化学发光试剂性能检测与朗道试剂比较分析评价及临床应用价值
作者：张 云 王 迁 易昊禹
【摘要】目的：评估新产业生物H-FABP发光试剂的检测性能，并与朗道试剂进行比对分析，同时，探讨H-FABP检测在急性心肌梗死早期诊断、治疗及预后中的临床应用。方法：对H-FABP试剂的空白限、定量检出限、精密度、线性等性能进行评估。对收集的共400例（其中疑似心肌梗死患者血清300例、表面健康者血清100例）临床样本与朗道H-FABP试剂进行比对，用统计学方法分析相关性及阴阳性符合率，并对差异样本进行分析验证。分别采用新产业生物H-FABP、hs-cTnI、cTnI、CK-MB及Myo试剂检测疑似心肌梗死患者血清300例（按发病时间到就诊时间先后分为0~3h、3~6h和＞6h组），统计分析其灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值。结果：新产业H-FABP试剂LOB为0.191ng/mL，LOQ为0.443ng/mL，精密度＜5%，在0.450~360ng/mL范围内呈线性，性能全面优于朗道H-FABP试剂。临床样本比对与朗道试剂的相关性良好，R2为0.9519，样本总体符合率为97.25%，其中11例差异样本经第三方试剂检测及临床诊断信息分析，新产业生物检测结果更加符合临床。在H-FABP的临床应用方面，AMI患者胸痛发作3h内，H-FABP+hs-cTnI联合检测的诊断敏感性为84.2%（其中H-FABP为74.2%，hs-cTnI为56.6%），在AMI的早期诊断中敏感性明显优于传统心梗三项cTnI+CK-MB+Myo（66.4%）联合检测，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：新产业生物H-FABP试剂性能优于主流厂家朗道试剂；样本检测结果与临床诊断更加符合；其中H-FABP+hs-cTnI两项试剂联合检测在AMI的早期诊断中优于传统心肌三项cTnI+CK-MB+Myo，对于AMI患者的诊断、治疗及预后具有非常重要的意义。
【关键词】急性心肌梗死；心脏型脂肪酸结合蛋白；心肌标志物；性能评估
急性心肌梗死（Acute myocardial infarction，AMI）是由心肌组织持续严重缺血引起的心肌急性坏死，是世界范围内最常见的死亡原因。据统计，我国患者人数已经高达200万，且以每年50万的速度递增[1-3]。患者发病后，典型症状为剧烈而持久的胸骨后疼痛、恶心、呕吐和心律失常等，病情进展迅速，未及时处理，致残及致死率极高，虽然患者及时通过溶栓或冠状动脉介入治疗后，症状可以得到有效缓解，但死亡率仍然高达11.9%[4]。因此，对于急性心肌梗死患者，早诊断、早发现和早治疗具有积极的意义和价值。目前，临床上对于急性心肌梗 死诊断，以冠状动脉造影检查为确诊急性心肌梗死的“金标准”，但是该方法有一定的创伤性、风险性，该方法难以重复检查，很难作为主要和常用的检测方法[5]，常用的临床诊断指标主要包括心电图、心肌酶谱、心肌肌钙蛋白（cTn）、肌红蛋白（Myo）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）和超敏肌钙蛋白（hs-cTn），但早期 诊断灵敏度均较低。心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）是近年来发现的一种新型心肌标志物，凭借极高的检测灵敏度、更好的心肌特异性以及优异的的动力学性能，日益受到关注和重视[6-8]。目前H-FABP检测方法主要包括免疫比浊法、乳胶凝集法及免疫化学发光法等，以朗道的免疫比浊法为主。
本研究旨在评估新产业生物开发的心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）检测试剂的诊断性能，与朗道试剂进行性能比对，探讨H-FABP检测在急性心肌梗死 早期诊断中的临床应用，为AMI早期诊断提供参考和依据，使其更好地应用于AMI的早期诊断、治疗及预后。
一、对象与方法
1. 对象：收集因胸痛发作前往医院就诊的疑似心肌梗死患者样本300例，表面健康人群100例。最终确诊AMI的患者样本206例，非AMI样本94例。所有患者临 床表现及各项检查结果均符合急性心肌梗死相关临床诊断标准。AMI组男性144例，女性156例，年龄39~76岁，平均年龄（59±8）岁。非AMI组男性54例，女性46例，年龄37~78岁，平均年龄（61±7）岁。两组患者在年龄、性别等基本资料方面差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。
2. 试剂与配套仪器：试剂及配套仪器见表1。
3. 方法：（1）空白限及定量检出限评估：按EP文件方法评估试剂的空白限（limit of blank，LoB）和定量检出限（limit of quantitation，LoQ）。（2）精密度及准确度评估：[9-10]检测5水平浓度的临床血清样本，每天平行检测双管，平行检测20天，计算CV值；将浓度为300ng/mL（允许偏差为±20%）的心脏型脂肪酸结合蛋白的校准品A加到血清样本B中，所加的A与B之间的体积比为1:9，重复测定三次，计算回收率。（3）线性及线性范围评估：使用理论浓度为360ng/mL浓度样本和0.45ng/mL浓度样本进行等浓度间隔稀释得到6个不同浓度水平的样本，每个浓度样本重复检测3次，计算每个浓度均值。计算其线性，线性回归方程Y=aX+b。（4）干扰及交叉分析：查阅文献可知临床上常见的干扰物质以及预期测试最高浓度如表2所示。
表2. 干扰物质以及预期测试最高浓度
分别向低值样本和高值样本的试验组添加干扰物获得测定样本C1，对照组中添加相同体积储存液溶剂获得测定样本C0。每个样本重复测试三次，计算测试结果均值。
根据公式（1）（2）计算干扰率：
（5）它与朗道试剂性能比对以朗道试剂的性能参数为参照，对新产业生物H-FABP试剂空白限、定量检 出限、精密度及批间批内差等进行评估比较。（6）相关性分析：对收集样本分别进行新产业生物和朗道H-FABP试剂进行检测，用统计学方法分析检测结果的相关性。（7）差异样本第三方试剂（南京诺尔曼）检测及临床信息分析对差异样本进行第三方试剂进行检测，并根据临床诊断信息进行分析比较。（8）H-FABP+hs-cTnI联合检测在临床上的应用对收集的疑似AMI的300例患者按发病时间到就诊时间先后分为 0~3h、3~6h和＞6h组，分别采用新产业生物hs-cTnI、H-FABP、cTnI、CK-MB及Myo试剂检测，统计分析其灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值。
4. 统计学分析：采用SPSS19.0统计学软件对本次研究所得数据进行分析处理，计算试剂性能指标空白限、精密度、参考范围，心肌标记物各单项指标及联检指标灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。计数资料采用χ2检验，量值相关性统计分析采用GraphPad Prism 6线性回归模式分析，P＜0.05为差异具有统计学意义[11]。
二、研究结果
1. 空白限及定量检出限评估结果：由表3可知，新产业生物H-FABP试剂检测3个零浓度分析物样本，LOB值为0.191ng/mL。由表4及图1可知，当CV=20%时，对应的浓度为0.443ng/mL，此时的浓度作为新产业生物H-FABP试剂的定量检出限。
表3. 空白限评估
表4. 定量检出限评估
图1. 低值血清浓度与CV值关系
2. 精密度及准确度评估结果：由表5和表6结果可知，新产业生物H-FABP试剂五水平不同浓度的精密度评估CV值均在5%范围内，回收率为101.05%，在（90.0% ~110.0%）范围内。
表5. 精密度评估
表6. 准确度评估
3. 线性及线性范围评估结果：由表7及图2结果可知，新产业生物H-FABP试剂在0.45~360ng/mL之间呈线性，其相关系数R2为1。
表7. 线性及线性范围评估结果
图2. 线性及线性范围评估结果
4. 干扰及交叉分析结果：由表8结果可知，胆红素、血红蛋白、脂肪乳剂、类风湿因子、人抗小鼠抗 体、抗核抗体、阿司匹林、心得安及小肠型、肝脏型脂肪酸结合蛋白对新产业生物H-FABP试剂基本无干扰（见表8）。
5. 与朗道试剂性能比对：由表9结果可知，新产业生物H-FABP试剂检测时间短，灵敏度高，线性范 围宽，整体性能优于朗道。
表9. 性能比对汇总
6. 相关性分析结果：由表7可知，新产业生物与朗道H-FABP试剂样本比对阳性符合率为96.86%，阴性符合率为97.61%，总体符合率为97.25%。由图3可知，新产业生物试剂与朗道试剂相关性良好，R2=0.9519，P＜0.01。
表10. 新产业生物与朗道阴阳符合率
图3. 相关性分析
7. 差异样本第三方试剂检测及临床诊断分析结果：由表10及11可知，差异样本中5例样本新产业生物H-FABP试剂检测阳性 而朗道检测阴性，6例样本新产业生物H-FABP试剂检测阴性而朗道检测阳性，重复检测，结果同前。11例不符样本使用第三方试剂南京诺尔曼检测，其检测结果阴阳性与新产业生物一致；临床诊断信息显示，5例新产业生物阳性朗道阴 性样本均有心脏疾病相关的症状，6例新产业生物阴性朗道阳性样本诊断信息均为一些干扰性疾病，会对H-FABP试剂检测结果造成影响（见表10，表11）。
8. hs-cTnI与H-FABP联合检测临床应用分析结果：由表12及图4可知，胸痛发作时间到就诊时间＜3h、3~6h及＞6h组，H-FABP+hs-cTnI联合检测灵敏度分别为84.2%、90.7%及94.2%，均高于单项及传统心梗三项cTnI+CK-MB+Myo联合检测，特别是胸痛发生3h内，差异在显著（P＜0.05），且特异度、阳性预测值及阴性预测值均处于中上游水平。
表12. hs-cTnI与H-FABP联合检测分析结果（%）
图4. 灵敏度比较结果
三、讨论
急性心肌梗死是一种极其凶险的冠状动脉疾病，每年有许多病人因不能及时诊断治疗而死亡，临床研究表明，从冠状动脉急性闭塞至心肌透壁性坏死大约为6h，在该时间窗内使冠状动脉再通可挽救濒临坏死的心肌[12]。症状发生后1h内进行再灌注治疗，死亡率只有1.6%，而6小时内进行再灌注治疗患者死亡率升高到6%[13]。因此，心肌梗死发病早期及时诊断和治疗，是降低患者病死率和改善预后的关键。临床上AMI的诊断主要依据临床表现及一些辅助检查，如心电图、心肌酶学的检查等。但约有25%~50%的AMI患者缺乏典型的临床症状及特异性的心电图改变，从而给AMI的及时诊断带来一定困难，因此心肌损伤标志物的检测对诊断尤为重要。
心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）是一种可溶性的脂肪酸转运蛋白，在心肌发生损伤后能够迅速释放入血，1~3h即可检出，4~6h达到峰值，20~30h恢复至正常水平。其动力学曲线与肌红蛋白相似，但特异性更高，可作为AMI诊断的早期标志物，也可作为治疗改善预后的监测标志物[14]。心肌肌钙蛋白（cTn）由于具有高度的心肌组织特异性，是目前公认的最优的AMI确诊标志物[15]，但受到传统检测方法的效能限制，胸痛发作后3~6小时才开始被检出，缺乏早期敏感性，且从发病到治疗浓度一直高居不下，难以成为改善预后的监测标志物。近年来，随着检验方法的不断革新和技术手段的不断进步，肌钙蛋白检测具备了更高的敏感性和更低的检测限。尽管如此，新一代超敏检测系统在AMI早期诊断特别是0-3小时、微小心肌损伤检测、合理筛查心血管事件高危患者等方面的检测灵敏度依然较低。
本研究结果表明，深圳市新产业生物医学工程股份有限公司自主研发生产的 心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）测定试剂盒（化学发光法）具有优异的检测性能。空白为0.191ng/mL，定量检出限为0.443ng/mL，精密度小于5%，在0.450~360ng/mL范围内呈线性，优于朗道H-FABP试剂的空白限0.747ng/mL、定量检出限3.49ng/mL、线性范围0.747~120ng/mL。与朗道比对的总体符合率为97.25%（n=400），其中11例差异样本使用第三方南京诺尔曼H-FABP试剂检 测，检测结果阴阳性与新产业生物一致，对样本临床诊断信息进行分析，发现其中5例新产业生物检测阳性而朗道检测阴性样本均存在心脏损伤相关的症状，极大概率存在心肌细胞损伤及H-FABP的释放，且朗道检测结果均在4mg/mL~6mg/mL之间，即截断值附近，结合朗道H-FABP试剂空白限及定量检出限均较高，与截断值区分较小，说明其与临床诊断信息不符；其余6例新产业检测生物阴性而朗道检测阳性样本经过分析，发现高血压高血脂、肠胃炎、类风湿性关节炎、贫血、肾衰竭等均会对朗道H-FABP试剂检测结果造成影响，同时结合三方试剂验证情况，以及新产业试剂的干扰及交叉分析结果，说明该样本均为正常样本。以上结果均表明表明新产业生物的H-FABP试剂检测结果更为准确。
我们对差异原因进行分析：首先两个厂家所使用的抗体针对的位点可能存在一定差异；其次，最主要的原因可能是检测平台和反应体系的差异，朗道试剂使用的免疫比浊法检测原理为光的透射（或散射），若样本存在溶血、脂血、黄疸、总蛋白含量过高等都将影响检测结果，而化学发光法具有高度灵敏性的发光反应技术，不受溶血、脂血、黄疸等的影响，不但操作简单、方便，而且结果准确、可靠。同时，第三方南京诺尔曼H-FABP发光试剂检测结果与新产业生物检测结果一致也充分说明了发光方法学的优势；且部分差异样本集中在参考范围截断值附近，参考范围的设置以及试剂的性能均可能造成结果的差异，特别是朗道试剂的定量检出限比较接近截断值，而此浓度对应CV为20%，更容易造成低值样本检测灵敏度低的缺点；同时，朗道试剂的参考范围评估的样本均为欧洲人群，而我们试剂评估样本均为中国大陆地区人群，更有针对性。以上结果均证明新产业生物的H-FABP发光试剂较朗道的H-FABP比浊试剂性能更优。
在H-FABP的临床应用方面，AMI患者胸痛发作3h 内，H-FABP+hs-cTnI联合检测诊断敏感性为84.2%（其中H-FABP为74.2%，hs-cTnI为56.6%），在AMI的早期诊断中敏感性明显优于传统心梗三项cTnI+CK-MB+Myo（66.4%）联合检测，差异具有统计学意义（P＜0.05）。而在胸痛发作3~6h的中期和大于6h的末期诊断时，H-FABP的敏感性不再具有明显优势，但H-FABP+hs-cTnI联合检测诊断敏感性依然优于hs-cTnI以及传统心肌三项cTnI+CK-MB+Myo联合检测。H-FABP在AMI患者发病3h内含量急剧上升，检测敏感性最高，特异性良好，作为早期诊断指标，优于其他诊断因子，诊断时间窗短，可作为改善预后的监测指标；hs-cTnI具有较长的诊断时间窗，敏感性在3h后呈逐渐升高趋势，且特异性高，作为中后期检测指标更优；因此H-FABP和hs-cTnI的联合检测将形成时间窗上的优势互补，灵敏度及特异度均优于传统心肌三项cTnI+CK-MB+Myo，更利于临床AMI患者的诊断、治疗及改善预后。
四、结论
综上所述，新产业生物的心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）测定试剂盒（化学发光法）性能优于主流厂家朗道试剂；且样本检测结果与临床诊断信息更加符合；H-FABP+hs-cTnI的联合检测将形成时间窗上的优势互补，灵敏度及特异度均优于传统心肌三项cTnI+CK-MB+Myo，对于临床AMI患者的诊断、治疗及改善预后具有非常重要的意义。
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