临床微生物检测技术体系的完善与前沿方向

2019年末，新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情爆发并随之席卷全球，严重威胁着人类的健康。作为一种新发传染性疾病，对引发疫情的病毒的及时分离、鉴定成为全球科学抗击COVID-19疫情的先导条件，凸显出临床微生物检测技术作为精准识别传染性疾病的重要性。在此基础上，通过新冠病毒核酸检测技术在全国范围内广泛实施“应检尽检”和“愿检尽检”的防控策略，是中国及时有效控制COVID-19疫情的“精准利器”。由此可见，临床微生物检测技术在应对重大公共卫生事件中发挥着重要作用——预警监测是应对重大公共卫生事件的第一道防线，而完善的临床微生物检测技术体系是实现准确“预警监测”的基础保障。

同时，感染性疾病也是一种常见的影响人类健康的疾病，各种社区/医院获得性感染广泛存在于临床各科患者之中，抗感染药物成为临床应用最广泛的药物之一。然而，由于抗感染药物的不合理使用，对抗感染药物的多重耐药与泛耐药等问题日益加重，成为全球性公共卫生问题。对引发感染的病原体的早期识别，是减少盲目经验性用药、降低广谱抗感染药物使用比例、实现通过精确合理化用药，减缓、遏制耐药性发展的前提——而对病原体的早期识别，也有赖于完善的临床微生物检测技术体系建设。准确、快速是临床实践对于病原体检测的要求。随着检测技术的快速发展，除了涂片、染色、分离、培养、药敏等传统方法以外，基于PCR原理进行延伸的第二代测序（Next generation sequencing，NGS）技术、将实验平台缩小至芯片的微流控技术等新的检测手段不断涌现——新技术的发展在保证检测的敏感性的同时，能够降低假阳性，而且大幅度提升检测速度，得到临床医务工作者的“青睐”。值得注意的是，传统的形态学检验、培养仍然是临床微生物检测技术的基本功，是病原体识别和鉴定的金标准，不应该因新技术的发展而被轻视或遗忘。本文将对现今临床微生物检测的新技术进行述评，明确前沿方向，以期不断改进、优化、完善临床微生物检测技术体系，更好地契合临床实际需要。

一、高通量测序技术

高通量测序技术，即第二代、第三代测序技术，区别于传统的Sanger末端终止法测序^[1]，可实现一次并行几十甚至上百万个DNA分子克隆进行测序，是研究遗传组学的基石手段。第三代测序技术正处于不同的研发和应用阶段，并呈现出各自的优点与缺点。目前临床实际应用的以NGS为主，比较成熟的NGS平台有454焦磷酸测序、Illumina/Solexa、SOLiD等，均包括模板预备、测序、成像和数据分析四个环节。其中，独特的模板预备是NGS实现高通量的关键所在：在该过程中，待测序的不同模板附着或固定于固体支持物表面，各自独立被测序而互不干扰，即使是极大通量模板也可同时进行测序，从而达到提高效率、缩短时间的目的^[2]。

既往对于病原微生物分子层面的分析多集中在少数靶点，而借助NGS的高通量技术，可直接针对样本中所有核酸进行无偏性测序；在此基础上，结合病原微生物数据库及生物信息学工具，分析样本中含有的可能病原微生物序列，大幅度缩短检测周期^{[3, 4]}。

由于检测过程中使用了PCR技术，NGS具有传统核酸检测的优点，其应用补充了传统的Koch法则，可检测难培养、罕见或新发病原微生物，并可同时检出多种病原微生物信息。基于此，对检出的非预期病原体不应轻易视为污染，若这些非预期病原体的存在符合临床诊断，则可考虑基于该病原体的药物全覆盖治疗——不仅避免漏诊，也可成为预防院感爆发的一道重要防线^{[3, 5]}。同时，NGS不仅可确定病原微生物的种类，还有可能对耐药基因进行快速检测，例如Zankari等利用Illumina平台对含4个菌种的200分离株进行全基因组测序，并对耐药性进行预测，发现预测结果与临床表型的符合率高达99.74%^[6]。

遗憾的是，进行全基因组测序时，对样本的处理过程繁琐，成本较高，尤其是在检测耐药基因时，需要已知的耐药性基因决定子，因此无法检测新的或非特异的耐药性，而且也无法提供MIC值^[7]，此外，NGS需要超过常规的数据量来检测病原体的毒力与耐药性，因此在临床实践推广中仍存在一定的问题^[4]。

二、微流控技术

微流控技术并非特异性应用于临床微生物检验，它是一种交叉学科技术所形成的新兴分析化学研究平台，可实现对于纳克甚至皮克级的微量液体进行化学反应的操控，从而极大提升反应效率，且降低耗材成本。而基于微流控技术形成的微流控芯片又被称为“芯片上的实验室”，即将生化反应所需的基本操作单位结合于小芯片上，让反应依照预先设计的程序逐步进行，例如连续进行核酸提取、纯化、PCR、跑胶等操作^[8-10]。以真菌的鉴定为例，既往传统的对于临床微生物检验需要经过培养、PCR、酶联免疫分析等多个步骤，根据菌种不同可能需要花费2-10天不等的时间，而应用微流控芯片则可将时间缩短至1-2小时之内^[11]，可见其效率之高，已经成为“即时检验”的首选。

微流控技术在微生物检验方面主要应用于对核酸和蛋白质的检测，覆盖非常广泛，现有报道的相关病原体探索包括：（1）细菌：如大肠杆菌、沙门氏菌、金葡菌等；（2）真菌：白色假丝酵母菌等；（3）病毒：H1N1、HIV-1、寨卡病毒、诺如病毒等^{[9, 11, 12]}。2019年暴发的SARS-CoV-2也有应用的报道^[13]。微流控技术在自动化、高效率、污染小、高通量、低检测成本等方面优势极为明显；但同时，微流控芯片设计与制作工艺非常复杂，成本昂贵，现阶段还不能广泛地服务于临床实际，相信随着各项研究的深入，该技术可得到进一步改进、优化、完善，从而在临床实践中普及应用。

三、形态学检验技术

长期以来，微生物形态学观察是对于可能感染病原体早期诊断的基础手段，也是检验技术人员的基本功。目前形态学检验的临床实践主要是在光学显微镜或电子显微镜下对病原体结构进行观察描述，发现特征性结构，从而作出实验室判断。对于有细胞形态的病原体，通常是使用光学显微镜，而针对病毒的形态学观察则需要高分辨率的电子显微镜。不少病毒如新疆出血热病毒、冠状病毒、呼肠孤病毒、诺如病毒等均在电镜下最先发现，因此，电镜也成为临床检测病毒的手段之一^{[14, 15]}。除此之外，电镜还能够发现如附红体、细菌等微生物结构上的特征性表现^{[16, 17]}。但是电镜观察对于操作人员技术要求高，而且设备昂贵，灵敏度低，检测病毒时对于病毒颗粒滴度要求高，难以在临床普及，临床更倾向于选择抗原抗体检测、核酸检测等相对便捷、特异的手段。

尽管如此，形态学检验因其直观、快捷等特点，仍然是临床对多种细菌、真菌、寄生虫、朊病毒等病原体的诊断手段之一^[18]。未来有可能通过优化高精度观察仪器，简化繁琐的检验流程，提高观察灵敏度，从而扩大形态学观察的应用覆盖范围，推动临床微生物早期诊断的发展。

四、展望

21世纪，临床微生物检测体系机遇与挑战并存。一方面，全球面临着细菌真菌耐药的重大公共卫生威胁，而临床微生物检测是抗微生物药物合理使用的前提条件；另一方面，COVID-19的全球大流行迫使临床微生物检测体系对大型新发突发不明原因传染病的致病微生物精准识别作出能力提升。从某种意义上说，临床微生物检测体系既面临细菌真菌耐药的“常态化”威胁，又应具备以COVID-19疫情为代表的“战时”重大公共卫生事件的应对能力，不断健全与完善临床微生物检测体系是未来应对“平战结合”的必经路径。

作为病原体识别和鉴定的关键手段，临床微生物检测是抗感染药物合理使用的前提，也是应对重大公共卫生事件的“利器”，具有非常重要的作用。随着科学技术的发展，临床微生物检测实践也在逐渐发生改变。一方面，尽管目前受制于技术发展阶段而呈现出硬件或软件成本过高，第二代或第三代测序、微流控等前沿技术尚不足以服务临床实践，但随着技术进步与可及性、可负担性提高，这些技术势必会逐渐平面化、普及化，拥有极为广泛和令人期待的应用前景。另一方面，传统的微生物检验手段，尤其以形态学观察为代表的“基本功”，也不应被轻视和遗忘；虽然电镜对于病毒诊断的作用被部分取代，但通过对细胞学特点、微生物形态特征的直观观察，有助于临床对病原体进行早期诊断。故应强化检验技术人员对常见病原体形态学掌握的熟练程度，优化形态学检验的报告模式^[19]，同时还需积极开发新技术，应用到形态学检验中，提高其早期诊断的敏感性，扩大其适应面。

参考文献

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