外周血外泌体非编码RNA检测在肺癌诊断与治疗监测中的临床价值

作者：吴 静 沈佐君

癌症的早期发现可以显著降低癌症患者死亡率并延长患者生命，为此 很多研究者致力于探索新技术以检测肿瘤的早期迹象。癌症生物标志物广 泛存在于生物体内，例如DNA、mRNA、酶、代谢物、转录因子、蛋白 质和细胞表面受体，以及体液中发现的整个肿瘤细胞。它们可用于风险评 估、诊断、预后、预测疗效和疗效观察。尽管肺癌死亡率在下降，但大多 数患者仍被诊断出患有晚期或转移性肺癌，导致治疗效果不佳^[1]。因此， 如果在出现临床症状之前能够早期检测到癌症，这可能是降低癌症死亡率 的有效手段。尽管肺癌的基础研究颇受重视，治疗方案和新药开发不断地 更新，但患者的预后并不令人满意。目前临床上迫切需要找到能预测手术 后肺癌复发的生物标志物，以改善患者的预后。越来越多的研究表明，各 种细胞释放的外泌体可以用作不同细胞之间的信息交换的介质，外泌体 miRNA参与肺癌的发生和发展并发挥各种作用^[2]。研究结果表明，外泌体 miRNA可以用作肺癌的早期诊断和预后标志物，但它们在肺癌患者中的 确切作用仍然需要进一步研究^[3]。

癌细胞中外泌体分泌的增加和失调与肿瘤发生发展相关。外泌体 miRNA生物标志物在许多癌症中发挥着重要作用，例如鼻咽癌，肺癌和 结直肠癌^[4]。最近的研究显示，在所有人体体液中检测到外泌体miRNA， 可用作肺癌检测的非侵入性生物标志物。外泌体与肺癌的发生密切相关， 肿瘤来源的外泌体可通过调控多种途径参与肺癌的发生和发展，如增强肿 瘤血管生成和血管通透性、参与上皮-间充质转化和促进化疗耐药，这些 证据表明外泌体在肺癌的发生发展中起着至关重要的作用，为非小细胞肺 癌的治疗提供了新的前景，有待进一步研究。

一、外泌体miRNA作为肺癌的诊断生物标志物

近年来，研究人员高度关注外泌体miRNAs作为癌症检测和筛查的诊断 生物标记，研究外泌体miRNAs的功能及其作为癌症生物标记物的潜力。临 床工作者观察了病例组与对照组血浆、血清或肺泡灌洗液中外泌体miRNAs 的表达水平，期望找出具有临床价值的差异。

在该领域的早期研究中，Cazzoli等人分析了肺 腺癌患者、肺肉芽肿患者和健康吸烟者血浆外泌体 miRNAs的表达水平。作者通过PCR验证发现外泌体 miRNAs（miR-378a、miR-379、miR-200b-5p和miR139-5p）可以用于区分肺癌患者和健康人群，外泌 体miRNAs（miR-151a-5p、miR-154-3p、miR-200b5p、miR-629、miR-100和miR-30a-3p）可以区分肺 腺癌患者和肺肉芽肿患者^[5]。6种失调的血浆外泌体 miRNAs（miR-19b-3p、miR-21-5p、miR-221-3p、 miR-584-5p、miR-425-5p和miR-409-3p）可以将 肺腺癌患者与健康志愿者区分开来。在训练、测试和 外部验证阶段，受试者工作特征曲线下的面积分别为 0.72、0.74和0.84。此外，除miR-584-5p外，所有已 鉴定的miRNAs在肺腺癌组织中均显著上调^[6]。其他相 关证据来自Jin等人的研究，作者认为肺腺癌患者血 浆外泌体miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和 miR-361-5p的变化显著，而miR-10b-5p、miR-15b5p和miR-320b在鳞状细胞癌患者中是特异性的。作 者还评估了这些miRNAs在非小细胞肺癌、肺腺癌和肺 鳞癌分类中的准确性，得到的受试者工作特征曲线 下的面积分别为0.899、0.936和0.911^[7]。在训练、检 测和外部验证阶段进行了qRT-PCR，4种外泌体miRNA （miR181a-5p、miR-21-5p、miR-106a-5p和miR93-5p）组合可用于肺鳞癌检测，训练、测试和外部 验证阶段4个miRNAs的受试者工作特征曲线下的面积 区域分别为0.795、0.827和0.914^[8]。 

与血浆样本类似，在许多对人体的研究中，也对 血清来源的外泌体中miRNAs的表达水平进行了研究。 三种外泌体miRNAs组合（miR-106a-5p、miR-20a-5p 和miR-93-5p）在男性肺鳞癌患者中具有有效的诊断 价值（受试者工作特征曲线下的面积=0.832）。有趣 的是，目前报道了三种miRNAs的组合在区分肺鳞癌和 肺血肿时也具有高度准确性，并指出受试者工作特征 曲线下的面积值为0.900。与健康对照组相比，肺腺 癌患者的血清外泌体中miR-140-5p表达水平增加^[9]。 最近的一项研究报告显示，与健康对照组相比，非 小细胞肺癌患者外泌体miR-17-5p的表达明显上调。 对于外泌体miR-17-5p，作者获得的受试者工作特征 曲线下的面积为0.746。当miRNA与CEA、CYFRA21-1和 SCCA这三种已知的诊断非小细胞肺癌的血液学标志物 联合使用时，受试者工作特征曲线下的面积值上升至 0.844^[10]。一个有意义的研究结果是，在早期阶段， 早期非小细胞肺癌患者的血清外泌体miR-126水平与 对照组相当，而晚期非小细胞肺癌患者的血清外泌体 miR-126水平显著降低。外泌体miR-126甚至可以区 分健康对照和早期非小细胞肺癌患者，并且比血清中 检测到的miR-126数量更显著^[11]。 

在早期非小细胞肺癌患者血清中4种miRNAs(miR21-5p、miR-141-3p、miR-222-3p、miR-486-5p)组 合和2种miRNAs（miR-146a-5p、miR-486-5p）组合 表达水平显著升高。上述4种血清miRNAs与2种血清 外泌体miRNAs联合可用于早期非小细胞肺癌患者的诊 断，受试者工作特征曲线下的面积可达0.960，敏感 性为85.42%，特异性为92.50%^[12]。 此外，研究发现肺癌患者血清外泌体miR-106b 含量高于健康志愿者，miR-106b水平与TNM分期和淋 巴结转移相关。细胞系中外泌体miR-106b的含量非 常高，能增强肺癌细胞的迁移和侵袭能力，还能增 加细胞系中转移相关蛋白（MMP-2和MMP-9）的表达^[13]。 尽管研究人员对与肺癌早期检测相关的外泌体 miRNA谱感兴趣，但据我们所知，只有Poroyko等人使 用测序研究了小细胞肺癌、非小细胞肺癌和健康对照 中的血清外泌体miRNA表达量。该研究表明，不同类 型的癌症患者、肿瘤携带个体和对照个体之间的外泌 体含量是不同的。在癌症患者和对照组中，目前已经 鉴定出17个不同表达的miRNAs^[14]。肺腺癌患者血清外 泌体miR-7797的表达量最高和miR-98-3p的表达量最 低。当两种miRNAs联合使用时，诊断效果更好（受试 者工作特征曲线下的面积=0.816）。作者还在体外证 明，增加A549细胞中miR-7797的表达可以抑制肺癌 细胞的增殖^[15]。

有研究人员从非小细胞肺癌患者和非肿瘤患者 血浆和肺泡灌洗液中分离出外泌体，然后分析外泌体 miRNAs的表达量。该研究首次比较了血浆和肺泡灌洗 液中的外泌体数量，证明两组患者的血浆外泌体数量 都高于肺泡灌洗液，血浆外泌体中miRNAs的含量明显 高于肺泡灌洗液。作者认为血浆中有两种特异性的外 泌体miRNAs（miR-126和miR-144），肺泡灌洗液中有 两种特异性的外泌体miRNAs（miR-302a和miR-302c）^[16]。同样，肺腺癌患者肿瘤组织和肺泡灌洗液中外泌体 miR-126和let-7a水平较高^[17]。其他相关证据来自Berta 等人的工作，作者开辟了一种方法，将胸腔液和灌洗 液中的外泌体miRNAs作为一种尚未探索的生物标志物 来源。具体来说，肺腺癌是通过miR-1-3p、miR-144- 5p和miR-150-5p这三个外泌体miRNAs进行特异性诊断 的。作者还评估了miR-1-3p、miR144-5p和miR-150- 5p的诊断能力，得到的受试者工作特征曲线下的面积分 别为0.914、0.939和0.925^[18]。

二、外泌体miRNA作为肺癌的预后生物标志物

骨髓瘤、肝癌和前列腺癌患者血液中的外泌体 miRNAs检测结果显示了识别患者预后方面的临床相关 性。外泌体miRNAs谱也可以为肺癌的监测提供可靠的 见解。事实上，在肺癌中，使用外泌体miRNAs作为临 床重要的生物标志物在其预后和预测潜力方面仍然相 对有限。 

miR-21在肺腺癌患者胸腔灌洗液中显著升高，并 预测患者存在较差无病生存期^[19]。非小细胞肺癌患者 血浆外泌体miR-23b-3p、miR-10b-5p、miR-21-5p水 平升高。将这三种外泌体miRNAs与临床变量结合后， 受试者工作特征曲线下的面积从0.88上升到0.91^[20]。 类似的发现表明，非小细胞肺癌患者的外泌体miR-21 和miR-4257水平明显高于健康对照组。作者还报道了 非小细胞肺癌患者中血浆外泌体miR-21和miR-4257的 表达水平与无病生存期显著相关。5个新发现的血浆外 泌体miR-151a-5p、miR-10b-5p、miR-192-5p、miR106b-3p和miR-484也显示了预后价值^[21]。肺腺癌患者 血浆中外泌体miR-484显著升高，术后显著降低^[22]。 另一个有趣的结果是，与使用免疫治疗的部分缓解患 者相比，进展性疾病患者的外泌体has-miR-320d、 has-miR-320c和has-miR-320b的表达量显著升高^[23]。 血清外泌体miRNAs谱也可能是监测治疗结果的有 效生物标志物。在此背景下，与铂耐药的晚期非小细 胞肺癌患者相比，铂敏感患者的miR-425-3p表达水 平明显降低，但两组的外泌体miR-425-3p水平仍高 于健康对照组。在顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞中也 发现了同样的现象。此外，作者还发现非小细胞肺 癌患者的外泌体miR-425-3p水平越高，其无进展生 存期越差^[24]。血清外泌体miR-216b的检测能力优于 CEA、CYFRA21-1和SCCA，血清外泌体miR-216b与CEA、 CYFRA21-1和SCCA联合使用的受试者工作特征曲线下的 面积值为0.84~0.925。此外，术后组miR-216b下调的 患者（57.1%）发生了淋巴结转移^[25]。

三、外泌体lncRNAs作为肺癌的生物标志物

在过去的几年里，已经广泛证明外泌体不仅包含 miRNAs，而且还包含长链非编码RNA（lncRNAs）。越来 越多的研究表明，外泌体可以在多种情况下稳定，在 免疫应答、转移、耐药等方面发挥关键作用，这也为 非小细胞肺癌的治疗提供了新的治疗靶点。到目前为 止，也有研究专注于分析外泌体中的lncRNAs。

 它与健康志愿者相比，非小细胞肺癌患者的外泌 体MALAT-1表达水平更高。此外，研究团队在体外实验 中证实，在非小细胞肺癌细胞系中敲除MALAT-1后， 抑制了肿瘤细胞的生长和增殖，促进了肿瘤细胞的凋 亡^[26]。同样，非小细胞肺癌患者外泌体lncRNA GAS5表 达下调。此外，肿瘤体积较大、TNM分期较晚的非小细 胞肺癌患者外泌体GAS5表达水平较低。外泌体GAS5的 受试者工作特征曲线下的面积为0.857，当lncRNA与CEA 结合时，受试者工作特征曲线下的面积增加到0.929。 值得注意的是，外泌体GAS5可用于鉴别I期非小细胞肺 癌患者，其受试者工作特征曲线下的面积为0.822^[27]。 肿瘤组织和非小细胞肺癌细胞系中外泌体DLX6-AS1的 表达水平显著升高。此外，患者中DLX6-AS1的高表 达与晚期非小细胞肺癌患者的疾病分期、淋巴结转移 阳性、肿瘤分化差有关。作者报道外泌体DLX6-AS1 的受试者工作特征曲线下的面积为0.806，敏感性为 77.5%，特异性为85.9%^[28]。非小细胞肺癌患者和早期 小细胞肺癌患者血清外泌体lncRNA TBILA和AGAP2- AS1水平均高于健康对照组，并注意到术后这些外泌 体lncRNAs水平下降。值得注意的是，这两种外泌体 lncRNAs与CFRA21-1联合在非小细胞肺癌诊断中表现 出了令人满意的诊断结果^[29]。 近期的一项研究发现，肺鳞癌患者血浆外泌体 SOX2-OT水平显著升高。SOX2-OT诊断鳞状细胞癌 的AUC值为0.815，灵敏度和特异性分别达到76%和 73.17%，表明其具有有效诊断能力。此外，外泌体的 SOX2-OT水平与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移密 切相关。研究者还注意到肺鳞癌患者术后血浆外泌体 SOX2-OT水平显著下降^[30]。

四、外泌体circRNAs作为肺癌的生物标志物

近年来的研究表明，外泌体环状RNA可以用作癌 症的诊断生物标志物。到目前为止，有3项研究集中 于血浆外泌体中环状RNA的表达，其中2项是关于肺 腺癌，另1项是关于肺鳞癌。在早期肺腺癌患者血浆 外泌体中，has-circ-0001492、has-circ-0001346、 has-circ-0000690、has-circ-0001439的表达水平 较高，其中has-circ-0001492的表达水平最高。事 实上，研究结果显示肺腺癌患者血浆中外泌体hsacircRNA-0056616水平明显高于对照组。另外，在绘 制血浆外泌体hsa-circRNA-0056616水平ROC曲线及对 肺腺癌淋巴结转移的诊断价值时，得到曲线下面积 为0.812，临界值为0.394，敏感性为0.792，特异性为 0.810^[31]。肺癌患者血浆外泌体中has-circ-0014235 和has-circ-0025580表达增加。Has-circ-0014235和 has-circ-0025580的AUC值分别为0.8254和0.8003^[32]。

五、展望

临床诊断采用有创检测往往会对肿瘤患者造成伤 害，因此，迫切需要开发无创、有效的检测方法。然 而，miRNAs、lncRNAs和circRNAs在各种疾病中的作用 需要准确定义，才能确定它们是否可以作为非侵入性 生物标志物。例如，外泌体miR-21在肺癌、胃癌、 肝癌和其他癌症中是不受调控的。这意味着它的紊乱 不能单独与某一特定疾病相关，也不能作为一种特定 的生物标志物。

外泌体作为肺癌生物标志物的技术和生物学挑战 包括生物样本的收集和存储、抗凝血剂的类型和样本 的处理时间。与样本异质性相关的许多遗传、生理和 环境因素都会影响外泌体的分析。我们需要注意的 是，地理位置、民族特征和饮食习惯可能在不同程度 上影响肺癌患者miRNAs、lncRNAs和circRNAs的表达。 外泌体miRNAs和lncRNAs在肺部疾病中的作用取 得了进展。然而，只有一小部分相关研究将这些发现 应用于临床试验或临床治疗。目前外泌体的研究热点 主要集中在潜在的生物标志物上，我们也在致力于探 索外泌体在诊断和预后方面的潜力。我们相信，在不 久的将来，不仅会看到外泌体在特定疾病中的应用， 而且还会看到外泌体在靶向治疗中的发展。

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