非小细胞肺癌生物标志物 检测方法在欧洲的发展趋势

作者:DDM
2021-12-16

编译: 王轲

校审: 赵晓涛

【内容提要】癌症驱动基因突变的发现带来以小分子抑制剂为主的靶向和免疫治 疗的发展,并引领了非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)治 疗方法的革新。如今,所有符合治疗标准的晚期NSCLC患者(以及数量呈增长 趋势的早期患者)需要快速、全面的生物标志物筛查,以选择靶向治疗、化疗或 免疫治疗的组合方案,而不是非选择性的化疗方案。为了避免重新进行活检,一 线治疗前进行的生物标志物检查应包括二线治疗需要的标志物;PD-L1表达检 测也应在开始治疗前进行。

癌症驱动基因的突变频率存在人群差异:EGFR基因突变在亚洲更常见,在欧 洲则是KRAS基因突变。除了已批准的一线治疗方法外,一些新兴的治疗方法正在 接受临床试验研究。世界各国对肺癌生物标志物检测的指导原则各不相同。但从 总体趋势来看,待检的靶点数量预计会增加,分子筛查策略也更加广泛。为了满 足诊断需求,目前已普及了单驱动基因突变的快速筛查技术。以DNA和RNA为基础 的下一代测序技术(next-generation sequencing,NGS)的发展使得人们能够 在一次检测中对一组基因进行分析;然而,周转时间 (turnaround times, TAT)仍然相对较长。因此,建 议在实施下一代测序技术的同时进行快速筛查技术。

在NSCLC生物标志物检测的发展格局中,下一步挑 战是探明靶向治疗原发性和继发性耐药机制。为此应 在癌症发生进展时的再次活检中进行更加全面的基因 检测,并可结合循环肿瘤DNA(circulating tumour DNA, ctDNA)检测,为指导二线或三线治疗提供重要信息。此 外,对肿瘤生物标志物检测的纵向研究可以深入了解 疾病过程中肿瘤的演变和异质性。我们总结了欧洲在 诊断和治疗过程中生物标志物检测的最佳实践策略。 目前肺癌仍然是全球癌症死亡的主要原因。2018 年,欧洲大约有38.8万例肺癌相关死亡,这一数字高 于结直肠癌和乳腺癌相关死亡数的总和。非小细胞肺 癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)约占所有肺 癌病例的84%,给全欧洲带来了巨大的社会和经济负 担。

根据精准医疗的原则,非小细胞肺癌的治疗格局 正在迅速转变以生物标志物为驱动的靶向疗法和与之 对应的分子诊断方法。“精准医疗”是指对于有某些 分子或形态学表型特征的癌症亚型,针对性地对这类 患者使用更有可能使其受益的治疗方法。目前研究表 明NSCLC与多种癌症驱动基因的突变有关,如表皮生 长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)、间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)、原癌基因酪氨酸蛋白激酶ROS(ROS proto-oncogene 1,ROS1)、B-Raf原癌基因(B-Raf proto-oncogene,BRAF)和神经营养性酪氨酸激酶受 体(neurotrophic tyrosine receptor kinase,NTRK) 等,并与选择最优治疗方案相关。新的NSCLC生物标 志物也不断出现,包括转染时发生重排(rearranged during transfection,RET)、肝细胞生长因子受体 (hepatocyte growth factor receptor,MET)外显 子14(exon 14,ex14)跳过突变和MET融合基因、 ERB-B2受体酪氨酸激酶2(receptor tyrosine-protein kinase erbB-2,ERBB2/HER2)、Kirsten鼠肉瘤病毒癌 基因(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, KRAS)外显子2 G12C、神经调节蛋白1(neuregulin, NRG1 )、成纤维细胞生长因子受体( f i b r o b l a s t growth factor receptor,FGFR)融合和点突变,以 及EGFR外显子20插入。此外,程序性死亡受体-配体1 (programmed death receptor ligand 1,PD-L1)和 肿瘤突变负荷(tumour mutational burden,TMB)的 检测可以预测肿瘤对免疫疗法的适用性。

已批准的和新兴的治疗方案数量不断增长,加上 分子生物学检测技术的快速发展,NSCLC的治疗格局正 在发生快速变化。这给生物标志物检测指南的制定和 实施带来了挑战。目前生物标志物检测是实现NSCLC精 准医疗的基础,但检测效果仍不理想。

在文中,我们概述了欧洲NSCLC的诊断和治疗格 局:过去十年里,NSCLC的驱动基因呈增长趋势。我们 全面概述了当前欧洲已应用的和正在研究的NSCLC生物 标志物,包括检测技术和最新研究进展,以及当前建 议的生物标志物检测实践指南。我们还讨论了新的进 展和对未来发展的影响。

一、 当前和最新的NSCLC生物标志物概览

NSCLC的体细胞突变可通过几种机制导致致癌性 激活,包括点突变、插入/缺失和重排。一般来说,指 导靶向治疗的突变通常根据突变机制分类,例如基因 重排(ALK、ROS1、RET、NTRK、EGFR1/2/3、NRG1)、 点突变、插入/缺失和基因扩增(如EGFR、BRAF、丝裂 原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)、KRAS、MET、ERBB2/HER2)。本文中 使用“靶向治疗”来表示针对敏感基因突变的治疗方 法,用“免疫治疗”表示针对免疫检查点蛋白(程 序性死亡受体1/程序性死亡配体1[programmed cell death protein 1/programmed cell death ligand 1, PD-L1)或细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4)的治疗方法。

TMB(肿瘤基因组每个编码区的非同义突变数量)被证 明可以预测免疫疗法的客观反应率和无进展生存期的 改善。总体来说,与没有敏感基因突变的患者相比,具有敏感基因突变的患者在接受靶向治疗的预后往往得到更好的改善。因 此,检测这些“靶点”的分子检测在NSCLC患者的诊疗过程中起着指导治疗 方案选择和影响患者预后的关键作用。表1提供了欧洲NSCLC当前和新出现 的生物标志物、它们人群频率和相关机构批准的靶向治疗的概况。

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二、NSCLC生物标志物检测指南

  1. 国际指南:NSCLC在不同人群中癌症驱动基因 的突变率可能不同,例如亚洲人群的EGFR突变率高于 欧洲人群,而KRAS的突变率低于欧洲人群。因此,不 同指南中驱动基因可能根据所在的地区有不同的优先级。

欧洲肿瘤内科学会( E uro p ea n Soc i et y for Medical Oncology,ESMO)发表的NSCLC临床诊疗指南 指出,分子亚型对于临床治疗决策是必要的,无论何 时都应尽可能地进行检测。对于晚期NSCLC患者,ESMO 建议检测EGFR和BRAF突变,分析ALK、ROS1和NTRK基 因重排,并检测PD-L1的表达。ESMO还建议在晚期非 鳞癌患者中常规使用下一代测序(next-generation sequencing,NGS)技术,并且多个基因组合的panel 基因组和仅含少数几个基因组合的panel相比,其额 外增加的成本通常可以接受。一般来说,目前,国际 共识是晚期NSCLC患者应检测EGFR、BRAF、ALK和ROS1 基因,并且在欧洲各国指南都对这些基因靶点批准作 为一线治疗方案(图1A)。ESMO、美国国立综合癌 症网络(National Comprehensive Cancer Network, NCCN)和泛亚洲(Pan-Asia)NSCLC指南推荐进行 PD-L1检测,同时NCCN额外推荐增添对NTRK的检测; 这两种生物标志物在欧洲都有已获批准的治疗方法。

对于新兴的生物标志物KRAS、MET、RET和ERRB2/HER2 突变,目前仅有NCCN、美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology,ASCO)和美国病理学 家学会(College of American Pathologists, CAP)/ 国际肺癌研究协会(International Association for the Study of Lung Cancer,IASLC)/分子病理学协会 (Association for Molecular Pathology,AMP)的指南 中建议纳入检测(图1B)。

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2. 国家指南:国际诊疗指南通常是区域性或各国 诊疗指南的基础,欧洲大多数病理学家和肿瘤学家主 要参考ESMO和NCCN指南。各国的诊疗指南需根据当地 的医疗模式和资源进行调整,反映各个国家的最佳实 践方案。因此欧洲各国的检测策略各不相同(图2)。 所有国家的诊疗指南都推荐检测EGFR、ALK、ROS1和 PD-L1,大多数国家推荐检测BRAF和NTRK。荷兰和瑞 典推荐检测KRAS、MET、RET和ERRB2/HER2等新兴生物 标志物。一般诊断策略是,先使用快速检测技术(如 单基因检测/多重基因检测、免疫组化、荧光原位杂交 [fluorescence in situ hybridization,FISH])对常见 的生物标志物检测之后,使用NGS进行额外的分子检 测,并可以根据临床指定要求或出于研究或试验的目的进 行。大多数欧洲国家指南中没有对TMB进行常规评估。

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NSCLC的另一项挑战是为了应对越来越多 的靶向药物,需要分子检测技术快速变化以 跟上步伐。然而制定新的诊疗指南和达成专家 共识需要时间,导致临床实践工作滞后于科学 发展进步。与那些只对生物标志物名单目录上 的基因进行单基因检测的国家相比,推荐采用 NGS方法并将其纳入医保体系的国家会更容易 在检测方案中增添新的基因。 有部分国家的诊治指南推荐纳入检测大量 生物标志物,但这不一定能在日常临床实践中 应用,尤其是受到报销方面的挑战。

三、NSCLC分子标志物检测的挑战

1. 欧洲分子生物标志物检测的进展现状: 在整个欧洲,分子生物标志物检测技术的覆 盖率有很大差异。例如在德国、意大利和西 班牙,晚期非鳞状NSCLC患者接受分子检测的 比例在65%~85%之间(2011-2016年),EGFR 的检测率从最低的中欧/东欧国家的65%(2014 年)到检测率最高的瑞士的79%(2014年)不 等。随着时代发展,分子检测的覆盖率不断 增加:瑞士的一项观察性研究表明,EGFR的 检测率从2009年的32%增加到2014年的79%。同 样,在五个国家(法国/德国/意大利/西班牙/ 英国)的研究发现EGFR检测率在2014-2017年 期间从71%增加到81%,KRAS检测率从38%上升 到59%。在瑞典,晚期非鳞状NSCLC患者的EGFR 检测率从2011-2012年的49%增加到2019年的 84%,由于在全国范围内推广NGS检测技术,包 括KRAS在内的新靶点的检测率可能与之相近。 对于一些欧洲国家诊疗指南推荐的较新的预测 性生物标志物(如BRAF和NTRK),检测率一 般低于较成熟的预测性标志物(如EGFR、ALK 和ROS1)。例如在德国,2015年至2019年间, BRAF的检测率为53%,而EGFR、ALK和ROS1的检 测率分别为72.5%、74.5%和66.1%。最新的ESMO 指南中增加了对NTRK基因检测的推荐,可见欧 洲国家的生物标志物环境仍在快速发展。然而 不可避免的是,临床实践中往往跟进会延迟。 2. 医疗资源和机构的障碍:在有限资源的医疗 环境中,肿瘤科和胸外科医生必须决定用何种方法为 肺癌患者检测哪些生物标志物。考虑到行政方面的因 素,比如监管部门对新药的审批、对检测试剂和方法 适用范围的审批(尤其是新兴生物标志物)和报销/医 疗保险范围,使得临床决策变得复杂。在欧洲,能否 报销是决定药物应用和检测可行性的关键因素,在靶 向疗法和分子检测的可行性方面,西欧和东欧/中欧之 间存在差异。报销的限制性被认为是阻碍中欧/东欧分 子检测应用的一个重要障碍,不利于按病人需要进行 检测。液体活检和组织活检两种检测方法在报销上的 国别差异又增加了一层复杂性。此外,如英国部分公 立卫生服务机构,不支持检测仍在临床试验阶段的一 部分靶点。

某些人群频率较低的生物标志物(如NTRK融合基 因)给检测策略带来特殊的挑战。传统的筛查策略通 常能降低成本,如先通过免疫组化技术进行筛选,再 对阳性标本进行测序。然而鉴于晚期NSCLC患者的肿瘤 组织标本数量往往有限,NGS可同时对多个基因测序 的优势被证明有其优势。事实上,对于同时检测四个 以上的目标基因,NGS通常比单基因检测更具有成本优 势。此外,这种策略可能有助于增加晚期NSCLC患者获 益的生命年。美国的一个模型比较了NGS检测策略(包 括EGFR、ALK、ROS1、BRAF、RET、MET和NTRK)与单基 因检测策略(EGFR和ALK)在NSCLC中的价值:如果NGS 策略比单基因检测策略增加10%,结果能多获得2630个 生命年,每一生命年可节约49~109美元。

(1)临床实践中的挑战(周转时间、检测复杂性 和反馈实验):临床周转时间(TAT)被认为是推广 分子检测的一个重要障碍:考虑到疾病发展的潜在风 险,肿瘤科/胸外科医生和患者可能不愿意等待检测结 果而推迟治疗。为了最大限度地减少TAT,分子检测最 好与病理学诊断在同一个医疗机构进行,并采用标准 操作程序(SOPs)。但这也取决于当地服务机构的医疗 水平,只有在足够多患者标本的地区才有可能配置相 应仪器设备,并对专业人员进行培训。测序技术的复 杂性可能会影响地区可行性。ASCO/CAP/IASLC/AMP指南 建议从收到标本到报告分子检测结果之间的TAT为10个 工作日;最近欧洲专家组建议分子检测的实验周期为5 个工作日。TAT的延迟可能导致靶向治疗的效果大打折 扣,例如在收到突变检测结果之前启动免疫治疗可能 令EGFR酪氨酸激酶抑制剂被用作二线药物而非一线。 反馈实验(reflex testing),即在组织学诊断 为晚期非鳞状NSCLC后,立即由病理科医生开具分子 检测单,这与由主治医生开具检测相比可以缩短治疗 开始的时间。反馈检测对于像NSCLC这样需要检测分 子标志物以即时对治疗方案开展决策的侵袭性肿瘤非 常重要。反馈实验有利于充分利用肿瘤组织标本(如 果同时对标本分析所有相关的生物标志物还能节约标 本),并提高分子检测的覆盖率。然而,这一筛查策 略受限于临床管理的复杂性,病理科可能无法获得足 够的临床信息来指导其诊断。CAP/IASLC/AMP建议,如 果检测策略中病理科与治疗团队直接沟通并公开顺 畅,病理科医生主导的反馈检测策略便是合理的。如 果反馈检测应用不当则可能会增加不必要的成本,并 且可能受到报销方面的限制(例如需要主治医生推 荐)。采用NGS进行反馈检测可以覆盖更广泛的生物标 志物,但可能需要更长的TAT,目前即使在理想情况下 也很难达到10个工作日。另一种解决方案是两阶段的 策略:PCR对单个基因的关键突变靶点进行快速检测, 然后是更广泛的NGS方案。但这种策略的标本利用率较 低,并且成本较高。

(2)生物标志物检测的分散式与中心式:在医疗 机构缺少相应设施的情况下,欧洲的许多病理科将分 子检测工作外包给独立的第三方实验室或公立医疗系 统内的地区检验中心。集中标本检测可以提高效率, 并通过SOP实现标准化。然而与院内实现分子检测相 比,外包的分子检测会带来额外的物流时间成本,对 TAT产生负面影响。此外,不同临床机构的分析前因素 有所不同,这可能会影响集中检测效果。虽然中心实 验室一般能满足指南中TAT的要求,但从检测申请到标 本送样之间也会产生延误;另外,如果中心实验室在 标本批量检测中制定标本最低数量的要求,可能会导 致标本数量少的地区出现延误。

欧洲各地使用外包分子检测实验室的情况差别很 大。例如,意大利等一些国家仍然主要在医院内部进 行分子生物标志物检测。其他如捷克则采用混合的方 法,建立一个由十个较大实验室组成的全国分子检测 网络。小的医疗机构对检测进行外包,大的医疗机构 则在内部进行检测。最后,如德国、瑞典、荷兰和英 国已经建立了集中的国家分子生物标志物检测网络, 以提高检测的覆盖率。随着NGS技术的应用越来越普 及,预计未来分子检测有更加集中的趋势,以简化标 本的高通量分析和数据管理。总体来说,集中化的高 通量分析可以提高检测治疗,能够提高检测效率并降 低成本。

(3)组织活检的限制:历史上,NSCLC分子检测 的另一个关键障碍是活检标本中肿瘤组织的数量。标 本采集和管理的提高意味着肿瘤组织的可获得性不再 是一项限制因素。对小活检的主动管理可能会增加分 子检测机会。早期的NGS技术需要使用较多的标本, 但随着技术的改进和分子检测靶点数量的增长使得天 平偏向于NGS而不是单项检测。

为了达到最佳的分子检测效果,标本取样方式最 好能考虑到任何导致肿瘤内异质性(肿瘤内的基因组 /生物学变异)和肿瘤间异质性(来自同一原发肿瘤 的多个小原发肿瘤或转移性结节的基因组/生物学变 异)的克隆进化,尽管这一点还未能实现。肿瘤内部 和肿瘤间的异质性被认为是导致治疗无效和耐药的关 键因素,针对耐药机制的治疗策略是未来改善临床预 后的重要因素。液体活检能实现肿瘤基因组的连续取 样,越来越多地用于检测肿瘤的克隆进化,有助于识 别肿瘤中产生可操作性突变以指导二线治疗手段。 (4)技术考虑因素:诊断的灵敏度、测试运行 时间、不同供应商提供的检测方法学性能上的差异, 以及对商业试剂盒亦或实验室自己开发试剂盒的偏 好,都会影响到实验的选择。表2总结了现有分子检 测技术的检测能力、敏感度和TAT。更进一步的考虑 因素是在肿瘤细胞比例低于推荐阈值的标本中,有 必要进行肿瘤细胞富集以提取DNA。不同技术之间的 cut-off值/评分系统也会有所不同,特别是对于没有 商业测试的新兴生物标志物。

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(5)报告和解释:准确报告生物标志物检测结果是至关重要的,报告 应及时完成,并能一眼得知生物标志物的状态以便将来使用。欧洲标准化委 员会已经为医学实验室制定了关键的报告标准,以减少不清楚的地方(ISO 15189);表3对这些进行了总结,并对报告结果增添了一些额外的考虑因素。 关于典型临床报告格式的指导意见在前文介绍。

随着NGS应用的增加,肿瘤科/胸外科医生需要接受适当的培训以解释临床 治疗的结果。最近的一项研究表明,肿瘤科医生对使用单基因检测的结果最有 信心,而对使用全基因组或全外显子测序的结果指导患者治疗方案最没有信 心。在调整后的模型中,基因组学方面的培训可以令医生对检测结果有更高的 信心。开发一个真实世界知识数据库可以帮助解决临床医生难以解释测试结果 的问题。

Table 3 Reporting criteria for medical laboratories

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(6)分子标志物突变的分类:为了在临床实践 中引入新的生物标志物来促进精准医疗实践,必须对 基因组学数据的报告和解释进行标准化。有一些工 作团队提出了分类的方案,以对生物标志物的突变 进行临床效用分配,并以此选择靶向疗法。ESMO分 子靶点临床可操作性量表(ESMO Scale of Clinical Actionability of molecular Targets,ESCAT)提供 了证据的评价标准,以确定标志物的优先级,并为患 者选择合适的靶向治疗方案。ESCAT根据靶点对患者 管理的影响,定义了6个级别的临床证据,从I级(可 用于常规临床决策)到X级(缺乏可操作性证据)。 AMP/ASCO/CAP指南根据体细胞突变在癌症诊断、预后 和/或治疗中的临床意义,将体细胞突变分为四个等 级,提供了基于证据的分类依据。精准肿瘤学知识库 (Precision oncology Knowledge base,OncoKB)定 义了四个级别的证据,以支持在某一型突变的适应症 中选择对应药物。最后,德国的MURIEL数据库也不断 更新,以提供关于基因组可操作性突变的统一临床建 议。

虽然生物标志物分类框架在理论上有可取之处, 但也存在其局限性。大量新出现的证据,特别是来 自NGS检测的证据可能会使分数迅速变化,而且往往 难以评估新发突变的相关性。此外,新型生物标志 物的证据基础在不同的适应症中有所不同。例如, KRAS(和NRAS)突变在NSCLC中具有潜在的预测预后 作用,KRASG12C抑制剂显示出治疗前景。目前正在携 带KRASG12C的患者中进行临床实验研究。另一方面, 在转移性结直肠癌中,KRAS突变已经成为抗EGFR抗 体的阴性预测因子。因此,每一个生物标志物不能被 简单赋予一个重要性权重,必须结合癌症类型进行评 估。最后,随着测序技术的广泛应用,临床医生将不 得不解释在原肿瘤克隆中发现的癌症驱动基因突变和 可能由于耐药机制产生的亚克隆突变。对亚克隆突变 的临床相关性解释是有挑战性的,但它们对指导二线 治疗方法的选择是重要的。在实践中,ESCAT可能更 适用于分子肿瘤委员会(molecular tumour board, MTB)的应用背景,或在报销目录的选择中辅助政策 制定者。在更普遍的层面上,许多分子生物学实验室 会采纳CAP/IASLC/AMP指南的建议,通过不同的方法学 实验来确认NGS的检测结果,例如通过使用免疫组化 的原理对融合基因的检测结果进行验证。

四、NSCLC生物标志物检测的最佳实践

1. 多学科管理模式:肿瘤治疗团队对于实现患者 最佳诊断和最优治疗非常重要。多学科交叉的方法可 以提供更全面的诊断分型并更优地贴合治疗指南,从 而提高患者的生存期。例如,由临床医生、分子病理 学家、临床分子生物学家、遗传学家和生物信息学家 组成的MTB可以改善应用遗传学指导的癌症治疗方案。 在40%的肺癌病例中,MTBs被正式可以影响提供的最初 治疗方案。多学科管理还有助于反馈测试,但这种方 法可能仅限于具有内部分子实验室的医疗机构;如果 将分子检测外包出去,多学科管理的实施则更具有挑 战性。

2. 组织活检或液体活检的考虑:多学科方法对于 获取适当的诊断用标本是至关重要的,标本可以由不 同专业人员的多种方法获得。通常需要对标志物的诊 断、评估而在基线时采集标本,以及为了确定肿瘤对 靶向治疗的耐药机制而在疾病进展时采集肿瘤标本。 一般采集自肿瘤原发部位或易得的转移部位标本用于 诊断。在选择合适的采集部位时,应维持对于患者而 言最安全、最易得的部位和取得足够的标本量需求 之间的平衡。欧洲专家组(European Expert Group, EEP)建议指出,应至少进行5次气管内超声/经气管镜 活检,并可考虑增加5次活检次数或2次低温活检;建 议每次气管内超声/经气管镜活检至少进行四次穿刺; 至少有两次经皮粗针活检(18-20号针)或3-6次粗针 穿刺活检。为了保证有足够的肿瘤细胞用于检测,上 述建议次数最好当作最低限度。快速现场细胞学评估 (Rapid on-site evaluation,ROSE)是一种可以快速 评估组织活检取得标本是否合格的方法流程,它的使 用有几个优点(见图3),应将其作为NSCLC生物标志 物检测工作流程的一部分。

影像学引导经皮细针穿刺活检可在中间到周围病 变时作为粗针活检的可靠替代方法,更容易收集细胞 学标本,较少引起患者不适,在无法进行组织活检时 在临床实践中常规使用。非小细胞肺癌的细胞学诊断 通常基于气管内超声细针活检、支气管镜刷检、胸腔 积液和远处转移部位经皮细针穿刺。可用于分子检测 的标本类型包括先前染色固定或乙醇固定的涂片、组 织块和液体标本,一般要求标本中肿瘤细胞的质量较 好、占四分之一以上。其中组织块的适用性最好,一 般现有实验室的标准操作流程都可适用。最后,德国 的S3指南建议再次活检时尽量采用液体活检的方法。 如果标本量不足以完成分子检测,病理学家可以 最大化地利用它。形态学分析足以确定肿瘤组织学结 果,如果需要通过免疫组织化学进行亚型分类,大多 数肿瘤也可以通过单一的腺癌标志物(如TTF-1)和 单一的鳞癌标志物(如p40)进行分类。建议用组织块 制备组织切片标本,这样可以保留组织原有结构,并 可提供不同厚度部位的多个切片用于各种分析,包括 形态学和核酸检测。病理学家应在玻片上标记最典型 的区域以便于得到肿瘤信息,最好可以将其提取到另 一张空白玻片上。显微切割可用于获取更高肿瘤/非肿 瘤细胞比值的切片标本,并最好在分子级洁净区域下 进行。这种“肿瘤富集”技术对于直接测序和NGS来说 是必要的。对于反馈实验流程,应保留初次诊断时的 切片,以避免在附加检测中需要从组织块中获取新切 片。为了避免污染风险,只有在洁净环境下进行的反 馈实验才能用于后续的核酸提取和分析。用于分离DNA 的细胞学材料(如涂片)也可作为一种备用方法最大 化地利用组织。 组织活检仍然是NSCLC生物标志物检测地“金标 准”。虽然液体活检在组织活检标本量不足时可以使 用,但检测机构不应以不佳的组织活检/处理程序作为 依赖血液检测的理由。

如果患者存在活检的禁忌症(如出血风险),或 处在一线治疗期间无法进行再活检,且需要检测二 线治疗相关生物标志物时(如EGFR酪氨酸激酶抑制 剂治疗发生疾病进展时对EGFRT790M检测),液体活 检将是好的替代方法。此外,随着严重急性呼吸综合 征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)大流行对常规临床实践 的影响,采用液体活检可以避免有风险的侵入性组织 活检操作。IASLC建议在提取DNA(ctDNA)时采用血浆 而不是血清,从抽血到提取血浆的最长时间不超过2小 时(EDTA管)或3天(保存管),在血浆提取前不得 冻存血液。所需的血液量取决于检测机构的SOP和待测 面板的大小,不过许多欧洲实验室要求使用两支10毫 升的标准采血管。目前欧洲批准的液体活检的靶向测 序仅限于EGFR突变检测,包括cobaseGFR突变检测v2 试剂盒和Therascreen。新的基于NGS的辅助诊断方法 即将在欧洲获批准(见6.3节),Guardant360® CDx和 FoundationOne® Liquid CDx已在2020年获得美国食品 药品监督管理局(US Food and Drug Administration, FDA)的批准。

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3. 下一代测序技术:在常规实践中采用NGS有助 于从足够体积的肿瘤组织中综合地描述当前和新出现 的可靶向治疗的基因组突变特征。NGS可以从肿瘤组织 或ctDNA(液体活检)中对整个基因组或外显子组、转 录RNA或从几个到几百个外显子组以及少量的内含子组 进行测序。NGS不能测量蛋白质表达的生物标记物(如 PD-L1)。单分子检测或小型集合核酸检测通常比NGS 检测更快(因此缩短了总体TAT),并且单个分子检 测的成本通常更低;然而,技术进步已经能够减少NGS 的运行时间,并且可以节约总体检测的成本。考虑到 目前欧洲批准的靶向驱动基因(EGFR、ALK、ROS1、 NTRK、BRAF)突变数量较多,而且其他驱动基因突 变也即将纳入指南推荐(KRAS、MET、RET、ERBB2/ HER2、NRG1、FGFR1),在诊断时扩大NGS的检测面板 (而不是8~12种独立的检测)是确定最佳治疗方案的 最有效的方法,从而改善患者的治疗效果,同时可以 避免不必要的再次活检。如前文所述,NGS与现有传统 检测方法的结合使用策略仍在发展中。总体而言,在 全欧洲使用NGS的局限性可能包括运行时间(正在改 善)、一些国家治疗和检测费用纳入医疗保险情况不 同(可能反映了每个国家的经济状况)、NGS结果的解 释和验证以及大型数据库的管理。

4. 室间质量评估计划:实验室必须建立可接受的 质量控制程序和室内质控监测,并应参与室间质量评 估计划(external quality assessment,EQA)。EQA 对于实现各个实验室的准确性和标准化非常重要。此 外,EQA计划对于比较生物标志物全球预测研究也很关 键。EQA计划的指南已经出台。 EQA的实施已被证明在临床上是有益的,并能 改善结果报告。在欧洲,已建立了几个与NSCLC相关 的EQA计划,最著名的是欧洲分子遗传学质量网络 (European Molecular Genetics Quality Network, EMQN)和英国NEQAS免疫化学(ICC)和原位杂交 (ISH)。

5. 最佳实践建议的概要:基于专家共识,图3总结 了目前对于未经治疗的晚期NSCLC和已治疗的进展/复发 NSCLC患者的诊断和管理的最佳实践建议。最佳实践要 求在现有资源充分利用的情况下,将当前最新科学知 识应用于临床实践。因此,生物标志物的最佳选择可 能根据各国具体的检测方案和相应的靶向疗法的可用 性而有所不同。

五、欧洲NSCLC生物标志物检测的未来发展

1. 新出现的NSCLC靶向疗法:Selpercatinib和 Pralsetinib分别在2020年5月和9月被FDA批准用于RET 融合阳性的NSCLC患者;这两种药物在欧洲尚在审查 种。Tepotinib和Capmatinib于2020年在日本获批用 于METex14跳过突变的NSCLC患者;在2020年5月,FDA 加速批准Capmatinib用于METex14跳过突变的NSCLC患者。

在过去研究中,KRAS是人类癌症种最常见突变的 致癌基因,也是调控细胞增殖和分化的关键分子,被 认为是难以作为治疗靶点的。大多数肺腺癌中的KRAS 突变被认为是肿瘤进化早期的克隆性致癌驱动基因, 尽管亚克隆中KRAS突变可以发生但相当罕见。KRAS突 变很少与其他可操作的致癌驱动基因突变(如EGFR、 ALK、ROS-1)重叠,因此KRAS突变型NSCLC患者不能从 针对这些突变位点的疗法中获益。大多数KRAS突变型 NSCLC患者有吸烟的既往史,但仍约有5~10%的患者没 有吸烟史或轻度吸烟,因此无论有无吸烟史,所有患 者都应进行KRAS突变检测。在缺少KRAS靶向药物的情 况下,KRAS突变型实体瘤患者的治疗方案选择有限。 在欧洲,高达三分之一的NSCLC腺癌病例存在KRAS突变。KRASG12C最为常 见,占KRAS突变的40~46%,占所有NSLCL腺癌病例的13%。然而KRAS的突变 状态对预后的独立影响一直难以评估,因为它与吸烟史及伴随吸烟相关的 共同突变(如TP53/STK11)混杂在一起。

对KRAS的结构研究进展引起Sotorasib(AMG 510)的药物开发,这种 小分子可以共价且不可逆地与KRASG12C突变蛋白的半胱氨酸结合,将其 控制在非活性状态,从而阻止KRAS依赖性致癌信号的转导,而不影响野 生型KRAS信号的转导,从而抑制癌细胞的增殖和存活。Sotorasib在1期临 床的剂量递增部分被证实对NSCLC患者有抗肿瘤活性,并在CodeBreaK 100 研究中注册进入2期临床研究。对于未转移的晚期和转移性NSCLC患者的2 期和3期临床研究正在进行(NCT03600883,NCT04303780)。另一个针对 KRASG12C的靶向药物(Adagrasib, MRTX 849)在一项正在进行的1/2期临床 试验中被证实对NSCLC患者表现出客观反应。其他的KRASG12C抑制剂正在进 行早期阶段的临床试验(如GDC-6036)或前临床实验。对NSCLC的其他几 种靶向治疗方案正在进行临床评估,泛RAS/SOS突变抑制剂也处于临床开发 的早期阶段(见表1)。总体来说,已公布的Sotorasib和Adagrasib的1期临 床数据令人期待,表明等待已久的针对KRAS突变型NSCLC患者的靶向疗法可 能即将出现。这些实验数据提示在一线治疗前应对KRASG12C进入分子检测 面板,以确定这部分可能受益于新兴KRAS靶向疗法的患者。

2. 技术发展:目前正在评估的大量NSCLC靶向疗法强调了不断验证并 修订分子检测策略的必要性。靶向基因数量的增加会给予NGS更多的成本效 益。NSCLC的NGS面板增加将允许同时检测多个靶向基因,并最大限度地减 少额外组织标本的需求。最终,NGS技术的应用取决于检测机构是否有可 行的技术平台(如核酸联合检测能力和全自动平台),以及医疗保险支付 和行政方面的因素。同时,液体活检的应用预计会增加。IASLC最近得出结 论:“液体活检在改善病人护理方面有很大的潜力,并且在临床上立即应 用于多数NSCLC相关的治疗环境是合理的。”然而考虑到液体活检明显较低 的总体检测灵敏度,在不久的将来液体活检仍不太可能代替组织活检。更 有可能的趋势是液体活检将以一种补充的方法在检测中应用,减轻标本相 关的限制因素。如何更好地应用这种检测方法还有待观察研究。

3. 欧洲的立法变化:在欧洲,相对于商业试剂盒而言,经认可的实验 室自行开发的实验可能仍然更受青睐,但这取决于未来几年新的IVD医疗器 械(2017/746)欧洲法规。如果以当前法规的形式实施,这将利于商业测试 的应用推广,因为试剂制造商需要进行临床性能分析,并根据实验的风险 等级证明其安全性和性能。虽然这是向标准化的方向迈进了一步,但也并 非没有问题:目前,提供预测性检测的实验室必须获得认可,或至少参与 一个实施中的质量管理计划(包括室内和室间质量评 价);另一方面,价格较高的CE-IVD试剂盒,以及试 剂和现有检测平台升级的需要可能会增加成本,并限 制医疗资源有限的国家进行检测。最后,对于开发诊 断测试的公司来说,每一次试剂盒的迭代都需要重新 努力获得CE-IVD认证,这可能会阻碍开发新的测试或 试剂盒的改进。

六、总结

所有不可手术治疗的NSCLC患者都需要尽快筛查 生物标志物(5~10天内出结果),以选择一线靶向治 疗、免疫治疗或免疫治疗+化疗组合。在欧洲,分子检 测和靶向治疗的各国临床指南总体上依照ESMO/NCCN指 南,并根据各国的医疗模式和资源相适应。EGFR、ALK 和PD-L1的分子检测在欧洲已得到普遍应用,部分国家 还对ROS1、BRAF和NTRK进行检测。目前,KRAS、MEK、 MET、ERBB2/HER2、RET、FGFR1/2/3和NRG1的检测仅 在学术机构或临床试验机构开展并限用于研究用途。 各国在提供分子检测方案和相应的靶向疗法方面的差异,部分反映了国家或地区一级的报销状况和/或保险 覆盖率。

为了提高遗传学指导下肺癌治疗的应用,ESMO指 南推荐使用MTB模式,由临床医生、分子病理学家、 分子生物学家、遗传学家和生物信息学家共同参与治 疗团队。在医疗机构结构允许的情况下,对晚期NSCLC 患者进行反馈实验是可取的,可以最大程度地缩短组 织学诊断到启动一线靶向治疗之间的时间间隔。NGS技 术的改进增强了一次检测中对一组驱动基因突变的分 析;然而即使在最佳运行设置下,NGS的运行时间仍 然相对较长(1~2周)。目前,可以将NGS与单基因突 变检测的快速筛查方法共同应用以避免时间较长的问 题。因此NGS仍需要进一步改进,以缩短运行时间,避 免重复检测。液体和组织活检的NGS检测被认为可以 互相补充,液体活检的结果报告更快,而组织活检的 假阴性率更低。此外,组织活检和液体活检的联合使 用可以允许对再次活检进行综合的验证,以提供NSCLC 疾病进展过程中纵向肿瘤进化和异质性改变的角度见 解。这一检测思路可以识别可靶向治疗的生物标志 物,并指导后续二线治疗方案;还支持发现新的生物 标志物和治疗药物;然而,随着检测复杂性的增加, 确保分子检测报告的结果被临床医生充分解读也是十分重要的。


译自:LungCancer154(2021)161-175

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