代谢组学在肝细胞肝癌个体化 诊疗中应用的临床价值
肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的肿瘤类型之一，世界范围内每年新发病例多于70万，致死病例超过60万 [1, 2] ，是原发性肝癌中最常见的病理类型。在我国肿瘤致死性病例中，肝癌排名第二位，对人民生命和健康造成巨大威胁。
根据目前的诊治方法，HCC患者预后并不十分乐观，研究HCC疾病发生发展机制，并建立针对性的个体化治疗方案是患者的新希望 [3] 。近年来，对HCC等恶性肿瘤的认知由以往的“基因病”逐渐转变为“代谢病” [4] 。氨基酸、脂类和糖类物质代谢异常是HCC的重要特征之一，代谢组学通过对生物体液或组织中所有小分子代谢物的定性和定量筛选分析，揭示了生物系统的代谢表型信息，这为代谢组学研究HCC发病机制和探索有价值诊断和预后标志物提供基础。本文就代谢组学在HCC个体化诊疗中的应用和前景作一论述。
一、代谢标志物及其在HCC中的临床价值
糖代谢重编程及其代谢标志物：HCC肿瘤组织葡萄糖代谢水平较高 [5] ，HCC患者糖代谢重编程的特点表现为即使在氧气供应充足、线粒体功能正常状态下，葡萄糖摄入量和乳酸产量也会增加，肿瘤细胞以糖酵解途径作为能量供应的主要途径，即Warburg效应 [6, 7] ，与此代谢通路相关的代谢物在HCC患者血液和组织中表现出差异，对肿瘤的诊断和预后判断具有一定的辅助价值，并提示潜在的治疗靶点。
Rong等人通过对HCC患者和肝硬化患者循环血清的非靶向代谢物质分析发现包括6-磷酸葡萄糖在内的糖代谢标志物在HCC组显著升高 [8] ，证实癌细胞的高能量代谢状态，并提示6-磷酸葡萄糖可能是早期HCC患者和肝硬化患者的鉴别标志物。通过对HCC肿瘤组织的核磁共振代谢组学研究发现 [9] ，肿瘤在侵袭和转移过程中糖代谢途径中的葡萄糖和乳酸等代谢标志物含量出现显著变化，这可能与肿瘤组织的能量消耗增加有关，提示HCC肿瘤处于进展期。在细胞内，葡萄糖在己糖激酶催化下转换为6-磷酸葡萄糖，敲除HCC的己糖激酶基因能够抑制葡萄糖分解为丙酮酸和乳酸，己糖激酶基因敲除联合索拉非尼能够抑制小鼠体内肿瘤增长 [10] ，是潜在的HCC靶向治疗位点。
此外，多项非靶向代谢组学研究 [8, 11, 12] 还发现在HCC肝癌组织中三羧酸循环相关的苹果酸、琥珀酸等物质含量降低，糖异生途径也受到抑制，而糖酵解途径十分旺盛。尽管无氧酵解是一种效率较低的产能方式，但是在肿瘤组织中该途径速率可高达正常细胞中的200倍 [4] ，从而为肿瘤细胞的生长增殖和侵袭转移提供足够的能量，同时糖酵解途径中的中间代谢物也为肿瘤细胞的增生提供了大量的原材料。2. 脂质类代谢标志物：肝脏在脂类和脂蛋白代谢中具有重要作用，HCC状态下肝脏脂类代谢能力异常，脂肪从头合成途径加强 [13] 。在HCC肿瘤进展过程中，脂肪酸合成酶过表达，这与肿瘤细胞增殖和患者的不良预后相关 [14] 。有报道指出 [15] ，敲除小鼠的脂肪酸合成酶基因，AKT/c-Met诱导的HCC被抑制，提示脂肪酸合成酶作为潜在治疗靶点的可能性。肝脏也是内源性胆固醇合成和代谢的主要部位，肝硬化患者血浆脂蛋白普遍降低，有研究 [16] 指出晚期肝病患者的总胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯出现不同程度的降低。HCC患者体内异常的脂类代谢物主要表现在以下几类。
（1）游离脂肪酸。代谢组学研究HCC患者循环血液中游离脂肪酸的结果并不一致，Patterson和他的同事通过超高液相色谱与三重四级杆质谱联合应用、气相色谱-质谱联用两种方法分析比较HCC患者和肝硬化患者的循环血清中游离脂肪酸含量，发现HCC血浆中几乎不含甘油酸（24:0）和神经酸（24:1）[17] ，韩国的一项研究 [18] 比较了HCC与肝功能正常者的血清游离脂肪酸含量，发现花生四烯酸（20:4n-6）含量在HCC组中显著升高。与此相反，有研究 [19] 指出与健康对照相比，多种游离脂肪酸，例如花生四烯酸、肉豆蔻酸（14:0）和神经酸在HCC患者中含量显著较低。也有报道 [20] 指出，甘油、亚油酸、异丁酸（4:0）和亚油酸异构体（18:2n-6）在肝癌早期就显著升高，与肝硬化患者相比具有统计学差异，是潜在的早期诊断指标。外周血中的游离脂肪酸含量不仅与肝脏代谢能力相关，也受到受试者饮食等个体因素的影响。同时，标本前处理和分离检测参数的不一致也会影响到最终的检测结果，这也是目前代谢组学临床应用推广受限的原因之一。
（2）胆固醇和胆汁酸。有证据表明胆固醇合成的甲羟戊酸途径与HCC的发病相关 [21] ，胆固醇在肝脏中用于合成胆汁酸，部分胆汁酸能够增强肝脏组织氧化应激和炎症反应，参与HCC的发病过程 [22] 。有研究采用超高液相色谱联合质谱分析的代谢组学方法发现，乙肝相关肝硬化患者的外周血中有16种胆汁酸较健康对照组升高，其中5种（甘胆酸、甘鹅脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、甘草脱氧胆酸）的水平随肝硬化从Child-Pugh的A级到C级逐渐升高[23] 。而在胆汁和粪便标本中，肝脏疾病患者的次级胆汁酸含量较正常人显著降低，这可能与肝硬化时患者的肠道菌群失衡导致的初级胆汁酸向次级胆汁酸转变受阻有关 [24] 。采用液相色谱-质谱联用 [25] 、飞行时间质谱 [26] 等代谢组学技术将HCC与肝硬化患者胆汁酸含量比较，结果发现肝硬化组的胆汁酸（甘胆酸、甘鹅脱氧胆酸）水平较高。值得注意的是HCC组较肝硬化组的MELD评分更低。对粪便标本的分析显示，肝硬化和HCC患者的鹅脱氧胆酸水平降低与肝硬化程度相关性高 [27] ；血清中胆汁酸类代谢物含量也与肝硬化程度表现出相关性 [28] ，有理由认为胆汁酸类代谢标志物更倾向于反映肝硬化情况，而非HCC的必然联系指标。这一方面是由于胆汁酸生成依赖于有功能肝细胞的代谢能力，另一方面与参与胆汁酸代谢的肠道菌群变化相关。
（3）磷脂。磷脂类代谢物质包括磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）、溶血磷脂酰胆碱
（lysophosphatidylcholine，LPC）、磷脂酰乙醇胺等甘油磷脂和鞘磷脂，与细胞增殖的调节、肿瘤细胞的侵袭和炎症反应相关。Alexia等人采用高效液相色谱-串联质谱联用平台检测了90例伴或不伴有HCC的肝硬化患者血浆中的磷脂图谱 [29] ，发现HCC组患者PC 16:0/16:1、PC 16:0/16:0、PC 16:0/18:1和鞘磷脂18:2/24:1显著升高，LPC 20:4含量显著降低。溶血磷脂、多不饱和磷脂酰肌醇和一些神经鞘磷脂与HCC患者1年和/或3年低死亡风险相关。鞘磷脂分子中的神经酰胺已被证实是一种细胞增殖负调控因子，具有抑制细胞增殖，促进细胞凋亡的作用，其代谢产物1-磷酸鞘氨醇的生理作用与之相反。目前，这两种代谢物的生理特性被用于HCC的治疗研究 [30] ，或是治疗HCC的可行途径。
3. 蛋白质和氨基酸类代谢标志物：肝脏是蛋白质代谢的主要器官，HCC等肝脏疾病会影响蛋白质代谢情况，出现氨基酸含量的变化。已有研究指出 [31] ，与肝硬化患者相比，HCC患者的循环血谷氨酰胺含量升高，同时丙氨酸、亮氨酸和谷氨酸含量降低。在HCC患者中，支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）减少，芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸和组氨酸）增加，表明衰竭肝脏中支链氨基酸分解代谢增强，芳香族氨基酸分解减少。据报道 [11] ，支链氨基酸通过调节蛋白质合成和降解过程，在癌症中起重要作用。肿瘤细胞增殖需要大量的谷氨酸，肿瘤细胞生长环境中缺少谷氨酸会显著影响肿瘤的生长。代谢组学对HCC患者外周血检测结果显示 [31] ，血清丙氨酸、谷氨酸和赖氨酸在早期与晚期HCC患者中含量存在显著差异，这三种氨基酸含量与肿瘤进展呈负相关，是HCC进展的潜在指标。而血清甘氨酸水平与HCC进展呈正相关，可能是由于晚期HCC患者分解血清甘氨酸减少。代谢通路分析还表明，甘氨酸和丝氨酸代谢是HCC进展过程影响最大的通路之一。
4. 其他代谢标志物：由于HCC涉及多种物质代谢，代谢组学还发现与能量代谢 [32] 、免疫微环境 [32] 和肠道微生物代谢 [33] 相关的代谢标志物在HCC进展过程中发生变化。谷胱甘肽在细胞抗氧化防御中起核心价值，HCC患者血清中与谷胱甘肽合成相关的物质含量显著升高。此外，慢性肝炎患者8-羟基脱氧鸟苷水平也升高，该指标与HCC风险增加呈正相关 [32] 。在肝脏慢性炎症期间，巨噬细胞通过释放促进肿瘤转化的因子，使肝脏更容易发生HCC，在HCC发生过程中，出现局部组织中CD36和白介素-4/10/13/14浓度的变化 [34] 。国内学者研究采用高效液相色谱和质谱联用平台发现 [35] ，前列腺素E1和吲哚丙烯酸等代谢物质与HCC不同的分化程度相关，且具有较高的分期诊断效能，ROC曲线下面积达0.83。雌二醇和生育三烯酚在HCC患者手术前后浓度发生显著变化，对HCC治疗效果具有一定的提示作用[36] 。
二、代谢组学临床应用存在的问题与展望
毫无疑问，代谢组学联合其他组学的研究方法在未来将会在HCC诊断、治疗和基础研究方面带来巨大益处。然而，目前代谢组学距成为临床常规检测方法还有一定距离，一方面是由于代谢组学技术本身的限制，人体内的代谢物大约有2000多种，其物质分类众多，浓度范围跨度大，目前的代谢组学检测技术并不能完全进行定性和定量检测；另一方面不同的代谢物检测具有不同的物理化学性质，分子量大小和亲水性/亲脂性差异等，每种代谢物适合不同的标本前处理和分离方法，常规方法分离的样本在质谱鉴定前已经出现代谢物的部分丢失。靶向代谢组学研究方案针对特定种类代谢物制定分离方案，能够在一定程度上减弱目标代谢物丢失的影响，但是该方法是以放弃其他种类标志物为代价的。此外，代谢组学检测结果的物质鉴定和数据分析是一种基于大数据分析的方法，小样本和不充足的数据库可能会导致假阴性或假阳性的结果。除了代谢组学技术限制，理想的代谢标志物一般源于人体体液，体液标本易受到其他器官和全身环境的影响，其有限的器官特异性也是影响代谢组学向临床推广的因素之一。
不同于基因组学等其他“组学”，代谢组学检测的是人体现存代谢标志物，更接近人体疾病状态下的实际表型，也更能反映不同患者对同一疾病的差异反应，而后者是个体化医疗的基础。肝脏是人体代谢的中枢器官，肝脏代谢组是一种高度复杂和动态的小分子代谢物通量，这使得代谢组学技术平台特别适用于HCC等肝脏疾病的研究。肿瘤的发病十分复杂，涉及基因表达、信号传导和物质代谢等多个过程，单一组学的研究都有一定的局限性。多组学融合能够从多维度、多方位探索肿瘤的发生发展机制，是目前个体化医疗背景下新的发展趋势。
总之，代谢组学是一门结合了化学、信息学和医学的综合科学，不仅可以在HCC早期筛选和检测特异性诊断标志物，还可以用于疗效评估、预后判断和发现新的治疗靶点。随着个体化医疗时代的到来，代谢组学将在探索适合不同个体的治疗方法方面发挥积极作用。
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