多能干细胞来源的胰岛β细胞 治疗糖尿病的研究策略
【摘要】糖尿病是严重威胁人类健康的慢性代谢性疾病。降糖药物及外源性胰岛素无法根治糖尿病，胰岛移植手术为治愈糖尿病提供了可能，然而临床广泛推广受限于供体严重短缺。多能干细胞具有多向分化的特性，可在体外诱导其分化为功能性胰岛β细胞，替代受损的β细胞，从而为糖尿病治疗提供了新的途径。本文对近年来诱导多能干细胞向胰岛β细胞分化的最新方法、存在的挑战及应对策略进行论述。
【关键词】糖尿病；多能干细胞；胰岛β细胞；干细胞分化；干细胞移植糖尿病（diabetes mellitus）是一种以慢性高血糖为特征的代谢性疾病。国际糖尿病联盟（IDF）数据显示，2019年中国糖尿病患者总数为1.16亿，约占世界总数四分之一，且发病率继续呈现大幅上升趋势 [1] ，为医疗卫生系统带来了沉重的负担。在糖尿病两种主要的类型中，1型糖尿病是自身免疫性疾病，由T细胞介导的胰岛β细胞特异性免疫损伤导致患者胰岛素绝对缺乏；2型糖尿病则以胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷为特征。1型糖尿病患者与胰岛功能受损严重的2型糖尿病需外源性胰岛素来控制血糖，然而外源性胰岛素无法达到β细胞生理性血糖控制的效果，患者糖尿病并发症进展的风险依然存在 [2] 。
一、供体短缺限制了胰岛移植的临床推广
通过在糖尿病患者体内植入功能性β细胞，恢复胰岛素分泌，胰岛移植（islet transplantation）帮助患者减少对外源性胰岛素的依赖，实现血糖控制稳定，并预防并发症的发生 [3] 。胰岛移植经过数十年的发展，其安全性及长期有效性已在临床实践中得到证实。国际胰岛细胞移植登记处（IPTR）2017年的报告显示，患者胰岛移植术后5年生存率可接近100% [4] 。一项针对22项胰岛移植临床试验的回顾性分析显示，胰岛移植术后5年后仍有50%的患者保持胰岛素脱离，患者并发症风险降低，生活质量得到长期改善 [5] 。然而，胰岛移植面临供体严重短缺问题，使其长期无法在临床大规模开展。
二、干细胞疗法是糖尿病治疗的新途径
干细胞具有强大的多向分化潜能、自我更新能力和高度增殖能力，且来源丰富、易于获取，是细胞替代疗法的理想细胞来源。糖尿病干细胞疗法是通过诱导干细胞定向分化为功能性β细胞，再将其移植入糖尿病患者体内，重建患者胰岛内分泌功能，成为再生医学领域备受关注的热点方向 [6] 。干细胞来源的β细胞（stem-cell-derived β cells ，SC-β）理论上可为患者提供无限量、功能稳定的胰岛β细胞来源，为打破胰岛移植供体短缺的局限提供了有效的途径 [6,7] 。随着干细胞技术的迅速发展，诱导干细胞分化为功能性SC-β细胞成为最具潜力的糖尿病替代治疗策略。
三、诱导多能干细胞分化为功能性β细胞
糖尿病干细胞疗法中使用的细胞主要包括多能干细胞（pluripotent stem cells，PSCs）和成体干细胞（adult stem cells）。成体干细胞如间充质干细胞对糖尿病治疗的研究更多集中于免疫调节、抗炎、抗凋亡的作用 [8] ，改善外周胰岛素抵抗、保护受损β细胞并促进其再生的作用。PSCs则包括胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）。ESCs是分离于囊胚内层细胞团或胚胎生殖嵴，在适当条件下可被诱导分化成多种不同类型的细胞和组织，如胰岛细胞、神经元细胞、胶质细胞、肝细胞和心肌细胞等 [9] 。iPSCs则利用逆转录病毒将Yamanaka因子（Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4）转入已分化的成体细胞，将其重编程为胚胎干细胞的状态 [10,11] 。iPSCs不仅同样具有多向分化潜能，也避免了ESCs所面临的细胞来源问题和伦理学争议。利用ESCs和iPSCs的这些特性，可为胰岛组织工程和SC-β细胞移植治疗糖尿病提供理想的种子细胞。
PSCs体外诱导分化为功能性β细胞的基本策略是在体外模拟胰腺发育的主要路径：从原始PSCs逐步分化为内胚层细胞、原肠管细胞、后前肠细胞、内分泌前体细胞（祖细胞），最终形成胰岛β细胞 [12] 。胰腺胚胎发育过程受控于一系列转录因子和信号通路所形成的精细复杂转录调控网络 [13,14] 。通过在诱导分化不同阶段的培养基中添加一系列生长因子及小分子组合（如表皮生长因子、BMP受体抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、唾液素4等），进而激活或抑制胰腺发育的关键信号通路（如Notch信号通路，Wnt信号通路等），PSCs可最终获得功能性β细胞的表型 [15-17] 。
过去近二十年来，PSCs诱导分化功能性β细胞的研究已取得了卓越的进展。2006年，D’Amour等首次将ESCs在体外诱导分化为胰岛素分泌细胞，然而获得的细胞团中仅有7.3%的胰岛素阳性细胞，且对无法对葡萄糖刺激产生应答 [18] 。随着诱导分化方案的不断优化，2014年两个不同的研究组（Pagliuca等和Rezania等）在PSCs诱导分化功能性β细胞上取得了突破性进展，他们报道的分化方案显著提升了分化效率以及SC-β细胞的功能成熟度 [16,17] 。分化而来的胰岛样细胞团中胰岛素阳性细胞可达50%，且具有葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能。获得的SC-β细胞在亚细胞结构和基因表达谱上也与人原代胰岛细胞更为相似，如表达成熟β细胞关键标志物MAFA、PDX1、NKX 6.1和INS。当移植给糖尿病鼠后，这些SC-β细胞可在体内环境中进一步成熟，并在几周内使血糖逐渐恢复至正常水平。
尽管以PSCs诱导分化功能性β细胞的研究已取得显著进展，目前的分化方案分化效率仍相对较低，在功能上也不能达到成熟β细胞的状态 [19] 。首先，不同研究方案的分化效率总体在30~60%，分化步骤中产生异质性细胞的表型仍未完全明确 [20] 。分化获得的胰岛样细胞团中可观察到一定比例的前体细胞，以及同时表达胰岛素和胰高血糖素或生长抑素的多激素细胞，表明仍有大量细胞处于未完全分化状态，在移植后有形成畸胎瘤的风险 [21] 。再者，现有分化方案产生的SC-β细胞在功能上与成体β细胞还有明显差距，主要体现为功能性胰岛素动态分泌功能不完善，如葡萄糖刺激下的二相应答缺失 [16,17,22] 。此外，同成体胰岛β细胞相比，SC-β细胞中前体细胞标志物的表达水平较高，单个细胞胰岛素分泌量仍相对较低，提示SC-β细胞在表型上未完全成熟 [22] 。
四、提高多能干细胞分化效率和SC-β细胞功能成熟度
提高诱导分化效率及SC-β细胞功能成熟度，是糖尿病干细胞疗法临床转化亟待解决的问题 [23] 。近些年来，结合最新的技术手段，研究人员绘制了SC-β细胞体外分化图谱，发现影响分化过程新的调控通路，鉴定不同细胞亚群的标志物，从而使诱导分化程序得到进一步优化 [20, 24] 。Ghazizadeh等利用高通量筛选的方法发现在分化终末阶段加入ROCK II抑制剂H1255可使SC-β细胞的葡萄糖刺激的胰岛素分泌量提高约3倍，且胰岛素含量也更接近人成体胰岛的分泌 [25] Veres等利用单细胞测序技术对分化过程中各阶段细胞进行了单细胞转录组分析，获得了SC-β分化过程中细胞组成和基因表达动态变化图谱，并证明了分化所得细胞团中细胞种类的异质性 [20] 。这项研究同时鉴定了CD49a作为SC-β细胞的表面标志物，利用CD49a对磁性细胞进行富集可使胰岛样细胞团中SC-β细胞比例达80%。Mahaddalkar等则在分化的内胚层阶段利用CD177分离内胚层细胞亚群，均匀地增加特异性胰腺祖细胞的产生，从而提高SC-β细胞对葡萄糖的反应，并改善其异质性 [26] 。多能干细胞向β细胞的分化过程受多种内在和外在信号途径的调控，对该过程进行深入、系统的研究不仅可加深相关研究领域对SC-β细胞分化过程的认识和理解，也为未来分化方案的优化奠定基础。
胰岛内其他种类细胞，包括α细胞、δcells、血管内皮细胞和神经元细胞等，可以通过细胞间紧密连接协同调控胰岛的内分泌功能 [27,28] 。此外，完整的细胞组成和三维结构对胰岛的正常发育也至关重要 [29,30] 。通过细胞聚集效应或特殊三维支架结构的支撑，PSCs可在体外分化为具有完整胰岛功能的胰岛类器官，并提高分化效率和功能成熟度 [31] 。胰岛类器官内添加的血管内皮细胞或神经细胞可为SC-β细胞分化提供关键的生长因子以及细胞间相互作用，从而促进SC-β细胞分化[32] 。此外，基于组织工程预血管化SC-β细胞有助于促进移植后的血管重建，使移植物更快获得血供。辅助细胞如间充质干细胞和SC-β细胞共移植，通过抗炎及免疫调节作用，也有望提高和增强移植物在体内的存活率和功能效应 [33,34] 。真正模拟生理状态下胰岛的特征并达到生理性血糖控制的效果，SC-β细胞与其他胰岛细胞的构成比例和三维结构布局仍有待探索。尽管PSCs分化而来的胰岛样细胞团中存在显著的细胞异质性，考虑到某些细胞亚群仍缺乏有效的标记，开发同时产生多种内分泌细胞的PSCs分化方案也具有重要的研究价值 [21] 。
五、结语
近年来，随着分化方案的不断优化、SC-β细胞功能愈发成熟，移植SC-β细胞治疗糖尿病离临床应用也更近。然而，诱导多能干细胞分化治疗糖尿病的关键技术和核心问题仍有待研究。如何精准高效的获得功能成熟的SC-β细胞仍是未来的研究重点及难点。随着生物组织工程、生物材料、免疫调节方法、基因编辑等多种技术的发展，SC-β细胞的基础研究与临床应用有望突破现有瓶颈，并为糖尿病患者提供可及的治愈性治疗手段。
参考文献
[1] IDF Diabetes Atlas. International diabetes federation. Brussels, 2019.
[2] Jurgens CA, Catherine A, et al. β-cell loss and β-cell apoptosis in human type 2 diabetes are related to islet amyloid deposition. Am J Pathol 2011; 178(6): 2632-2640.
[3] ViSTOL F, BarONT W, MarcHeTTi P, et al. Update on pancreatic transplantation on the management of diabetes. Minerva Medica 2017; 108(5): 405-18.
[4] Collaborative Islet Transplant Registry. 10th annual Collaborative Islet Transplant Registry report. 2017.
[5] Vantyghem MC, de Koning E J, et al. Advances in β-cell replacement therapy for the treatment of type 1 diabetes. The Lancet 2019; 394(10205): 1274-1285.
[6] Tabar V, Studer L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nat Rev Genet 2014; 15(2): 82-92.
[7] Lanzoni G, Ricordi C. Transplantation of stem cell-derived pancreatic islet cells. Nat Rev Endocrinol 2021; 17(1): 7-8.
[8] Moreira A, Kahlenberg S, Hornsby P. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for diabetes. J Mol Endocrinol 2017; 59(3): R109-R120.
[9] Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998; 282(5391): 1145-1147.
[10] Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007; 131(5): 861-872.
[11] Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 2007; 318(5858): 1917-1920.
[12] Bruin JE, Rezania A, Kieffer TJ. Replacing and safeguarding pancreatic β cells for diabetes. Sci. Transl Med 2015; 7(316): 316ps23-316ps23.
[13] Pan FC, Wright C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev Dyn 2011; 240(3): 530-565.
[14] Jennings RE, Berry AA, Strutt JP, Gerrard DT, Hanley NA. Human pancreas development. Development 2015; 142(18): 3126-3137.
[15] Zhang D, Jiang W, Liu M, et al. Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells. Cell Res 2009; 19(4): 429-438.
[16] Pagliuca FW, Millman JR, Gurtler M, et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell 2014; 159: 428–439.
[17] Rezania A, Bruin JE, Arora P, et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol 2014; 32:1121–1133.
[18] D’Amour KA, Bang AG, Eliazer S, et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 2006; 24: 1392–1401.
[19] Russ HA, Parent AV, Ringler JJ, et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta‐like cells in vitro. EMBO J 2015; 34(13): 1759-1772.
[20] Veres A, Faust AL, Bushnell HL, et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature 2019; 569(7756): 368-373.
[21] Shahjalal HM, Dayem AA, Lim KM, et al. Generation of pancreatic β cells for treatment of diabetes: advances and challenges. Stem Cell Res Ther 2018; 9(1): 1-19.
[22] Nair GG, Liu JS, Russ HA, et al. Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells. Nat Cell Biol 2019; 21(2): 263-274.
[23] Sneddon JB, Tang Q, Stock P, et al. Stem cell therapies for treating diabetes: progress and remaining challenges. Cell stem cell 2018; 22(6): 810-823.
[24] Kelly OG, Chan MY, Martinson LA, et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 2011, 29(8), 750-756.
[25] Ghazizadeh Z, Kao DI, Amin S, et al. ROCKII inhibition promotes the maturation of human pancreatic beta-like cells. Nat Commun 2017; 8:298.
[26] Mahaddalkar PU, Scheibner K, Pfluger S, et al. Generation of pancreatic β cells from CD177+ anterior definitive endoderm. Nat Biotechnol 2020; 1-12.
[27] Sharon N, Chawla R, Mueller J, et al. A peninsular structure coordinates asynchronous differentiation with morphogenesis to generate pancreatic islets. Cell 2019; 176(4): 790-804.
[28] Benninger RK, Head WS, Zhang M, et al. Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet. J Physiol 2011; 589:5453–5466.
[29] Cleaver O. Specifying the pancreatic islet through biomechanical forces. N Engl J Med 2019; 380:1281–1283.
[30] Roscioni SS, Migliorini A, Gegg M, Lickert H. Impact of islet architecture on beta-cell heterogeneity, plasticity and function. Nat Rev Endocrinol 2016; 12:695–709.
[31] Vegas AJ, Veiseh O, Gürtler M, et al. Long-term glycemic control using polymer-encapsulated human stem cell–derived beta cells in immune-competent mice. Nature Med 2016; 22(3): 306.
[32] Velazco-Cruz L, Goedegebuure MM, Millman JR. Advances toward engineering functionally mature human pluripotent stem cell-derived β cells. Front Bioeng Biotech 2020; 8: 786.
[33] Tremmel DM, Odorico JS. Rebuilding a better home for transplanted islets. Organogenesis 2018; 14:163–168.
[34] Llacua LA, Faas MM, de Vos P. Extracellular matrix molecules and their potential contribution to the function of transplanted pancreatic islets. Diabetologia 2018; 61:1261–1272.
