心血管疾病中非编码RNA与蛋白质生物标志物的比较
编译：杨子瑶
校审：苏明
随着研究的深入，蛋白质生物标志物检测的灵敏度和可检测性不断提高，蛋白质生物标志物的临床应用范围已扩展至亚临床心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）。但目前已明确的蛋白质生物标志物不能改进现有的CVD风险评估模型，因此还需要补充其他生物标志物以完善对CVD风险的评估。而非编码RNA（noncodingRNA，ncRNA）是一类有潜力的CVD生物标志物，其中微小RNA（microRNA，miRNA）最受关注。目前ncRNA类生物标志物的多项研究正在进行，如长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）和环状RNA（circular RNA，circRNA）的诊断预测价值研究。本文将比较心血管领域中新兴的ncRNA生物标志物和蛋白质生物标志物在心肌损伤中的临床应用潜力。
一、CVD中需要新的生物标志物
在过去的50年里，生物标志物对心血管疾病的治疗决策起到了重要作用。在最新版心肌梗死通用定义中明确区分了心肌损伤与心肌梗死的概念，而不断提升的检测灵敏度实现了循环心肌肌钙蛋白（cardiac Troponins，cTn）微小水平变化的检测，因此cTn能够帮助临床判断心肌损伤和心肌梗死。
然而在检测灵敏度提升的同时，假阳性的可能性随之增加。因此，仍有必要对现有的CVD生物标志物进行改进和补充。在这方面，组合互补的生物标志物有较大前景。当前，循环非编码RNA作为替代和互补的候选生物标志物的研究正在展开。初步结果显示，ncRNA中的miRNA特别具有临床应用的潜力。还有其他类型的ncRNA，如长链非编码RNA和环状RNA也具有循环生物标志物的特性，但它们的科学探索仍处于起步阶段（图1）。
1. 蛋白质生物标志物——肌钙蛋白：肌钙蛋白（Troponins，Tn）是细肌丝的组成部分。Tn是由troponin C（cTnC），troponin I（cTnI）和troponin T（cTnT）三种亚单位组成的。其中cTnI和cTnT是心脏特异性的，是应用最广泛的生物标志物之一（图1）。由于二者具有心脏特异性和检测的高灵敏度，因此它们是检测心肌损伤的金标准。虽然在几年前，任何可检测到的cTn值都提示病理性变化，但最新的高灵敏度cTn（high sensitivity cTn，hs-cTn）的应用使得很大一部分健康人群中也可检测到cTn。因此在hs-cTn检测扩展到亚临床疾病诊断和风险预测之前，检出较低水平的cTn是否反映了临床相关的心肌损伤，或仅仅反映了心肌细胞蛋白的转换仍需进一步探索。
既往研究检测了22000名疑似心肌梗死患者的cTn水平，将cTn从诊断指标扩展至心血管风险评估的潜在预测标记物。心肌梗死组中，1年和2年内心血管事件再发的风险随着cTn水平的升高而逐渐增加——甚至在低于正常参考值上限第99百分位值（即心肌梗死的临界值）的情况下也是如此。引人注目的是，来自70000名普通人群数据集中的8345名配对个体也观察到了同样的趋势，这表明cTn或许可作为初级心血管疾病风险评估的生物标记物。然而，与仅使用传统风险因素的风险评估相比，cTn的加入几乎没有改善现有的CVD风险评估模型。因此，还需要补充其他生物标志物以完善对CVD风险的评估。
2. 蛋白质生物标志物——心肌肌球蛋白结合蛋白：在过去的二十年中，cTn已经彻底改变了急性心肌损伤的诊断方法，但cTn检测在特异性方面还需要改进。另外心肌梗死发病24小时后，cTn水平才达高峰。因此还需要寻找更早释放和更快清除的心脏生物标志物以更好地帮助临床进行决策。心肌肌球蛋白结合蛋白C（Cardiac myosin-binding protein C，cMyBP-C）是一种肌小节、粗肌丝相关蛋白，其在心肌细胞中比cTn含量更丰富（图1）。在缺血的早期阶段，cMyBP-C的N末端区域对蛋白水解非常敏感，因此在心肌损伤早期cMyBP-C就可释放入血。蛋白质组学研究发现，心肌损伤时cMyBP-C的释放早于cTn。在接受经冠状动脉消融术治疗室间隔肥厚（transcoronary ablation of septal hypertrophy，TASH）的患者中，心肌损伤发作后cMyBP-C的升高速度比cTn更快。
通过受试者工作特征曲线（receiver operating Characteristic，ROC）分析了TASH后患者心肌损伤的检测指标，我们发现cMyBP-C优于hs-cTnT和hs-cTnI。随后在心肌梗死人群中进行验证，发现cMyBP-C的性能与急性心肌梗死的诊断依据cTn相当。该研究对照组的所有健康个体中都可以检测到cMyBP-C，而五分之一的健康个体的hs-cTnT水平低于检测下限，说明cMyBP-C有较高灵敏度。这提示cMyBP-C可作为早期和亚临床疾病状态以及风险预测的候选生物标志物。Anand等人报道，cMyBP-C与主动脉狭窄患者的心肌肥大、纤维化和死亡风险增加有关。
然而，到目前为止，cMyBP-C在一级预防中的数据仍不足。而cTn在亚急性CVD的评估和风险预测中较cMyBP-C更为完善。因此，仍需要进一步对CMyBP-C展开研究，并定义cut off值，从而避免高灵敏度生物标记物带来的假阳性风险。
3. 蛋白质生物标志物——生长分化因子-15：cTn和cMyBP-C具有心脏特异性，是急性心肌梗死的生物标志物。而生长分化因子-15（Growth Differentiation Factor-15，GDF15）是非急性CVD和风险预测的潜在生物标志物。GDF15是一种转化生长因子β超家族细胞因子，也被称为巨噬细胞抑制细胞因子1。对参加Framingham心脏研究的3523名个体（平均年龄，62岁，其中53%为女性）进行85种循环蛋白生物标志物筛选，发现GDF15与心力衰竭（HR:2.08）、全因死亡率（HR:1.96）和心血管死亡（HR:1.96）有关。
GDF15还与炎症和动脉粥样硬化的发展有关，并在动脉粥样硬化病变的巨噬细胞中高度表达。此外，GDF15能够调节这些巨噬细胞中自噬相关蛋白的表达水平。研究发现，GDF15与心血管疾病的代谢危险因素相关，并且是非ST段抬高心肌梗死、ST段抬高心肌梗死、稳定性心绞痛和不稳定型心绞痛患者风险分层的生物标志物。此外，也有强有力的证据表明GDF15在心力衰竭中具有预测作用，可作为心力衰竭死亡率的独立预测因子。然而，由于其GDF15缺乏心脏特异性，这可能会阻碍其在临床实践中的实施。
4. 蛋白质生物标志物——NT-proBNP：NT-proBNP是公认的心力衰竭诊断的生物标记物，普遍认为其有预测心力衰竭人群的心血管疾病死亡风险的价值。据报道，除了心力衰竭之外，NT-proBNP还可以帮助预测普通人群和心肌梗死患者的心血管风险。BNP前体分解产生NT-proBNP和BNP，其中BNP具有排钠、排尿，具有较强的舒张血管，减少心力衰竭时循环负荷的作用。虽然NT-proBNP不具备BNP这样的生物活性，但NT-proBNP较BNP更为稳定，具有更长的半衰期，更低的变异性，因此更适合作为生物标志物（图1）。但一项关于急性失代偿性心力衰竭治疗的随机对照试验显示，与常规治疗相比，NT-proBNP指导的治疗并没有获得更好的预后。尽管如此，还是有大量研究揭示了NT-proBNP的生成过程，并证明它是一个高度敏感的生物标志物，发现改变其水平的治疗能够影响预后。因此，NT-proBNP的临床应用范围有望从心力衰竭扩展至其他心血管疾病，帮助疾病诊断和预后判断。
5. 蛋白质生物标志物——High-Sensitive CRP：类似GDF-15，hs-CRP反应的是全身炎症情况并非CVD特异的病理过程。由于动脉粥样硬化也是一种慢性炎症，因此hs-CRP能够作为心血管疾病的生物标志物。有研究认为，hs-CRP能够指导CVD预防中他汀类药物的使用。然而hs-CRP作为心血管生物标志物还没有得到广泛认可。目前指南提出，对中等风险的病人，hsCRP可以作为细化的指标评价10年CVD发生率，推荐等级为IIb类（弱推荐）、2级（弱证据）；并且不推荐低风险和高风险的人使用hsCRP预测10年心血管病发生率。一项关于hs-CRP与冠心病的关系的孟德尔随机化研究表明，hs-CRP水平升高与CVD没有因果关系。此外，有研究指出，由于hs-CRP是全身炎症标记物，因此hs-CRP不如血管标记物更适合指示CVD的发生。
二、ncRNA类生物标志物
在20000个蛋白质编码基因中，仅有12个蛋白具有心脏组织特异性（表1，摘自https://www.proteinatlas.org/humanproteome/tissue/heart），其中的cTns和利钠肽已进入临床应用。随着人类基因组计划的完成，人们发现了越来越多的ncRNA，并且按照其在基因表达调控中所具备的不同生物学功能分为不同的亚类。ncRNA也可作为CVD中的循环生物标志物。虽然仅有少数ncRNA具有心脏组织特异性，但是可以结合ncRNA和现有蛋白生物标志物或组合不同ncRNA以弥补这一缺陷。
在下文中主要讨论了miRNA、lncRNA和circRNA三种不同的ncRNA对CVD的潜在作用。miRNA、lncRNA和circRNA的主要特征如图1所示。
1. ncRNA类生物标志物——miRNA：Mitchell等人里程碑式的研究揭示了miRNA不仅存在于细胞内，也存在于血液循环中。与mRNA不同，循环中的miRNA能够与微小囊泡或蛋白质以及脂蛋白颗粒结合，使其在循环中能够稳定。miRNA是基因表达抑制因子，它能够与mRNA结合继而抑制蛋白质翻译过程。然而，循环中的miRNA的拷贝数很低，它是通过何种放大机制实现显著抑制靶点基因表达的作用尚不明确。不论如何，过去几年已有关于miRNA作为CVD循环生物标志物的潜在价值研究。
在健康志愿者的血浆和血清样本中可以检测到数百种miRNA。然而，部分miRNA只有在心肌梗死后的循环中才能检测到。其中miR-1和miR-133在心脏中高表达，与肌丝蛋白类似，miR-1和miR-133也存在于骨骼肌中。而miR-499和miR-208在心脏中含量较少，但对心肌和骨骼肌损伤更具特异性。van Rooij等人的一项研究揭示了人类和小鼠心脏衰竭前后多种miRNA水平发生改变，此外在心肌梗死和心肌损伤中也存在miRNA水平变化。
Liebetrau等人以TASH患者为模型，评估接受TASH治疗后不同时点上miRNA的水平。与先前的研究一致，在TASH后的前4小时内，血浆中miR-1、miR-133a和miR-208a的水平升高。作者还证明了miRNA释放动力学与cTn水平相关。Manuel Mayr等人为了验证该模型的结果，对TASH和急性心肌梗死队列中ncRNAs和蛋白质生物标志物释放的ROC曲线进行了比较，发现这两个队列中心脏生物标志物组合的AUC相似，说明：（1）TASH模型可以用于研究心肌损伤下生物标志物释放情况。（2）不同生物标志物组合具有作为诊断工具的潜能。
2. 采用miRNA生物标志物的注意事项：目前关于miRNA作为心脏损伤生物标志物的定量依赖于实时定量PCR（qPCR）分析。这需要考虑时间成本问题，并且还需要考虑肝素带来的干扰。肝素是疑似心梗患者的常用药，研究发现即使仅有一次肝素注射，也会对qPCR结果造成干扰。然而，大多数研究miRNA作为急性心肌梗死潜在生物标志物的论文都没有说明肝素的使用情况（表2）。据报道，即使在内源性肝素水平较高的情况下（如胸主动脉瘤），ncRNA的检测也会受到影响。Coelho-Lima, J. 等人提出，可以用肝素酶处理RNA样本以避免肝素对qPCR检测的影响。另外，对于微量miRNA的检测仍需进一步提高灵敏度。对同一队列患者的miRNA和cTn水平进行检测，发现当部分样本hs-CTn＜1000时，无法检出miRNA，说明目前的miRNA检测与蛋白类心脏损伤生物标志物检测相比缺乏敏感性。然而，尽管miRNA检测的灵敏度有待提高，但蛋白质和ncRNA生物标志物的组合在正确识别急性心肌梗死患者方面表现最好，即使在最初hs-cTn值较低然后急剧上升的患者中也是如此。这或许与心肌损伤释放动力学，以及蛋白质和ncRNA生物标志物在循环中清除率的差异有关。
最后由于急性心肌梗死还伴有全身反应，为了辨别是心肌损伤还是心梗伴有全身反应导致miRNA释放，Manuel Mayr等人在健康人血浆中加入心肌组织，并对miRNA进行定量。结果显示，miR-1、-133、-208和-499与心肌组织掺入量线性正相关，而此前认为与心肌梗死有关的miR-126、miR-223和miR-21却没有检测到表达水平改变。考虑到miR-126、miR-223和miR-21均在血小板中高度表达，因此推测该现象与急性心肌梗死时缺血、使用抗血小板药物影响循环中血小板水平有关。虽然血小板miRNA不太可能在急性心肌梗死中起到诊断作用，但可能为CVD风险预测提供信息。
Zampetakiet等人首次进行了基于社区的前瞻性队列研究，探讨循环miRNA对心肌梗死一级预防中的价值。该研究发现血小板富集型miR-223和miR-197，以及内皮细胞和血小板富集型miR-126单独不具备预测能力，但三者组合后与未来CVD的发生有显著的相关性。进一步地，Schulte等人对这三种miRNA在冠心病患者的二级预防价值进行了研究。与一级预防研究结果不同的是，仅miR-126一个指标就可反映未来CVD死亡危险，而miR-197和miR-223也与不良结局呈正相关。二级预防中抗血小板治疗可能影响循环miR-126、miR-197和miR-223水平。这三个miRNA水平或许可以反映抗血小板治疗的对血小板抑制的效果。Bye等人为评估miRNA对未来致命性急性心肌梗死的预测效果，开展了一项前瞻性队列内病例对照研究。该研究提出了由5个miRNA组成的组合，对预测心肌梗死发生的传统算法进行了改进。然而作者未能证实上述先前确认的血小板和内皮细胞miRNA是CVD预后的预测因子。作者认为这可能与qPCR检测过程缺乏标准的归一化方法有关。总之，这些研究表明：(1)miRNAs可以为体内血小板激活或抗血小板治疗的治疗反应提供信息；(2)强调miRNA定量方法需标准化，以促进不同研究之间的可比性。
3. ncRNA类生物标志物——lncRNA：LncRNA指的是长度大于200个核苷酸的ncRNA（图2）。到目前为止，关于lncRNA的亚类分类尚未达成一致。与miRNA不同，lncRNA主要位于细胞核或线粒体内。lncRNA的合成在转录、多聚腺苷酸、封端和剪接方面与mRNA有相似之处。大多数lncRNA的功能尚未明确，目前认为核lncRNA通过转录调节或隔离转录因子抑制基因的表达来调节临近基因表达而其他的lncRNA促进基因转录。
循环中可以检测到lncRNA的存在，这说明lncRNA可能存在类似miRNA的抗RNA酶保护机制或一个可以持续释放lncRNA的来源。研究发现，预测心脏重塑的长链基因间型ncRNA（long intergenic ncRNA predicting cardiac remodeling，LIPCAR）可以预测心梗后心脏重塑和死亡的发生。然而，在急性心肌梗死和TASH后，LIPCAR的水平没有发生显著变化。这说明，LIPCAR水平改变并非来源自心脏。考虑到现已证实LIPCAR来源于线粒体基因组，因此血小板，白细胞和红细胞可能是循环LIPCAR的来源。
目前对于lncRNA的来源仍不明确。近期发现循环lncRNA ZFAS1和ICDR1AS是是心梗的独立预测因子。然而其来源及其与心梗的机制联系有待进一步研究。在另一研究发现心梗患者血浆中有较低水平的lncRNA HOTAIR，该lncRNA通过与miR-1相互作用而起到保护心脏的作用。但由于该lncRNA在循环中的水平较低，因此仍不能确定其来源。当前常误认为疾病中ncRNA的变化与病变组织有关，但在许多情况下，ncRNA的变化是继发性的，比如由于药物、炎症反应或采样的差异（冠脉造影期间采集的外周静脉血与动脉血）造成的。
除上述lncRNA之外，也有许多文章发现了其他可作为CVD生物标志物的lncRNA，但这些报道仅在小队列里进行研究，仍需要进一步的验证。
4. ncRNA类生物标志物——circRNA：circRNA是哺乳动物细胞的内源性RNA，在特定的组织和发育环境中表达。它们通过对初级基因转录本（primary gene transcripts，pre-mRNA）的外显子或内含子的反向剪接而产生的（图2A）。裂解线性RNA的核酸外切酶RNase-R不能降解circRNA，因此，RNase R可用于裂解它们对应的线性RNA，从而富集circRNA（图2B）。
circRNA可以充当miRNA海绵，从而解除miRNAs对蛋白质合成的抑制作用。最近发现circRNA可以被翻译成蛋白质，同时它们的表达受RNA结合蛋白等蛋白质的调控。环状RNA还可通过与其对应的线性RNA的剪接竞争来影响基因表达。circRNA的表达具有组织和细胞特异性，同时也显示出一定程度的跨物种保守性。
测序结果显示，人类心脏中存在超过15000个circRNA；其中一些丰度很高。虽然内含子衍生的circRNA主要位于细胞核，但大多数circRNA，尤其是起源于外显子的circRNA（图2A），位于细胞质。关于circRNA在心肌梗死诱导细胞凋亡中的机制已有研究。有研究对circRNA作为急性心肌梗死的潜在生物标志物的价值进行了评估，该研究发现即使是在如TASH造成广泛的心肌损伤后，一些心脏组织中可检测到的circRNA不能在无细胞血浆或血清中检出。类似地，虽然有研究提出circRNA仅可作为非急性情况下CVD的生物标志物。但该研究团队没有使用血浆或血清样本，而是使用了从全血中分离出来的RNA，这增加了检测到的转录本是来自血细胞的可能性。与LIPCAR相似，circRNA的变化可能反映了心肌梗死后全身反应造成的炎症或其他造血细胞的变化或药物作用的影响。其他关于circRNA作为生物标志物的研究要么规模较小，要么使用常用的细胞内参考基因的转录本进行归一化。后者的结果可以反映血浆中残留血细胞如血小板或红细胞的水平。总之，在无细胞体液中很难检测到circRNA，这对circRNA作为生物标志物是一大挑战，仍需加以改进。
5. ncRNA类生物标志物的挑战：尽管ncRNA的研究取得了进展，但是相对蛋白质生物标志物的研究仍然逊色。目前ncRNA的数据缺乏重复性，这可能与它们的血细胞来源有关，或是受到了分析前变异的影响。比如样品制备和储存条件，RNA降解的控制，体液中残留细胞的存在，以及溶血都会对ncRNA水平有干扰。此外，不同的RNA分离方法、归一化方法以及ncRNA定量平台的选择检测阈值和校准方法等参数，药物（如肝素，抗血小板药物）等混杂因素都会对循环ncRNA的定量产生影响。虽然《Minimum Information for publication of Quantitative real-time PCR Experiments（MIQE）guidelines》的发表提供了国际规范的qPCR定量规则，但是该指南还未得到普遍实施。除此以外，对于临床应用来说，ncRNA定量和RNA分离等操作步骤仍需缩短检测耗时，进一步提高自动化水平。
三、结语
目前，CVD中以蛋白质生物标志物为主，其中cTn是应用最为广泛的CVD生物标志物。cTn不仅是早期心肌损伤和心肌梗死的金标准，还可以作为非急性脑血管病和风险分层的生物标志物。即便如此，对于新兴CVD生物标志物的研究也正在进行。cMyBP-C可以在发病早期帮助排除急性心肌梗死，虽然cTn和cMyBP-C具有高度相关性，这两个指标作为生物标志物提供了相似的信息。但是hs-cTn可能会出现假阳性结果，有必要进一步研究以确定检测cMyBP-C是否可以减少假阳性的出现。
虽然cTn和cMyBP-C都是心脏特异性的，但是以GDF-15、NT-proBNP、CRP为代表的代谢和炎症过程的标志物可以实现早期发现疾病，并且能够预测人群患病风险，从而帮助诊断和风险分层。然而现有的CVD风险评分相比，它们的价值仍然有限。而循环ncRNA具有良好的组织器官特异性，它们具有明显的组织和器官富集性，并结合在不同细胞和组织类型中表达的大量ncRNA转录本。因此ncRNA可作为蛋白质生物标志物的补充，在ncRNA中miRNA是最有潜力的CVD的诊断和风险预测标志物。虽然在过去的十年中，许多团队都开展了miRNA作为CVD生物标志物的研究，但是对于结果的验证很少。这说明急需统一ncRNA量化和报告方法，以促进不同研究之间的可比性。此外，目前miRNA的灵敏度逊于hscTn检测，同时如肝素等干扰qPCR定量的因素仍需要加以处理。
最近，lncRNA和circRNA作为生物标志物的研究也逐渐展开，但与miRNA相比相关报道较少。lncRNAs作为循环生物标志物有待进一步扩大研究规模以更好地验证其作用。而体液中无法检测到circRNA，这使其作为生物标志物的研究受限，然而在液体活检背景下有望应用circRNA评估血小板或白细胞来源的转录本与CVD的关联。
虽然ncRNA展现出作为CVD生物标志物的潜力，但是在大规模临床评估和应用前，仍需要克服分析前变异的影响，规范检测流程，提高检测效率，推进检测自动化和规模化发展。随着ncRNA相关检测技术的完善和标准化检测流程的构建，ncRNA在CVD中的临床价值或可被充分挖掘。
本文译自Trends in Molecular Medicine DOI: 10.1016/j.molmed.2020.02.001
