肺癌实验室诊断方法 研究进展与趋势
肺癌（Lung Cancer，LC）是指原发于支气管粘膜或腺体的肿瘤，又称为原发性支气管肺癌。在2018年公布的全球癌症统计报告显示，全球将有1810万新发病例和960万癌症死亡病例。其中肺癌是发病率（11.6%）和死亡率（18.4%）最高，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤 [1] 。肺癌的病因可以大致分为五类，分别是吸烟，职业暴露，环境因素，既往肺部感染或者家族遗传。目前认为吸烟是肺癌高发的主要因素 [2] 。研究证明，长期吸烟者患肺癌的危险程度是终生不吸烟者10-30倍，大约1/9的吸烟者最终患上肺癌 [3] 。
根据世界卫生组织（WHO）指南，使用常规组织学与免疫组织化学主要将肺癌分为两类：小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。SCLC是一种高度恶性肿瘤，起源于具有神经内分泌特征的细胞，占肺癌病例的15% [4] 。NSCLC占剩余病例的85%，进一步分为3种主要病理亚型：腺癌，鳞状细胞癌和大细胞癌 [5] 。腺癌本身占所有肺癌病例的38.5%，其中鳞状细胞癌占20%，大细胞癌占2.9% [6] 。
肺癌早期患者临床表现多以咳嗽为主，其次是咳血，胸痛和呼吸困难 [7] 。由于肺癌患者早期症状不明显且无特异性，多数患者确诊时已发展为晚期，错过手术最佳时期。虽然肺癌以铂类为主的化疗方案与技术不断发展，但仍不能将残余癌细胞清除，肿瘤复发与转移的状况频繁发生。据肺癌流行病学统计分析，从2001年到2007年，肺癌的5年总生存率平均为15.6％。如果早期诊断并进行外科手术介入治疗，患者5年生存率高达70% [8] 。然而，诊断出肺癌远处转移的患者中，超过52%的患者5年生存率仅为3.6% [9] 。降低肺癌患者死亡率的关键在于肺癌的早期发现与早期治疗。
一、肺癌的病理学检查
2015年世界卫生组织提出目前诊断肺癌的“金标准”是肺组织活检，多采用穿刺针对病灶位置穿刺抽取肿瘤组织进行检查，从而确诊肿瘤类型 [10] 。由于穿刺是有创性操作，肺组织活检中气胸的发生率为30% [11] 。病理学检查的不足之处在于其操作复杂，只能片面的反映肿瘤阶段性信息，导致丢失癌症的特征信息。早期肿瘤由于体积小获取足够的活检组织是十分困难，且检测结果易受检测人员水平影响 [12] 。
二、肺癌的影像学检查
临床影像学诊断技术日新月异，其主要包含CXR、胸部CT、PET-CT等。这些技术的出现虽提高肺癌检出率，但也存在一定的技术劣势 [13] 。如CXR由于其分辨率较低而且受病变部位影响大易漏诊肺小结节，现已不推荐其用于早期筛查肺癌 [14] 。常规CT由于其辐射量大，扫描时间长，不适合肺癌早期诊断 [15] 。根据2012版NCCN肺癌筛查指南，推荐使用LDCT技术作为高危人群肺癌诊断的基础检查手段。全国肺癌筛查实验（NLST）结果显示，其假阳性率为96.4%，造成不必要的后续检查，增加检测成本 [16] 。PET-CT是临床上常用于癌症诊断的一项影像学检查方法，其具有97-100%的敏感性和62-100%的特异性 [17] 。由于示踪剂18F-FDG的代谢特点导致一些炎症疾病如肺炎、肺结核、活动性肉芽肿等也可导致高代谢活动 [18] 。由于目前的PET/CT的空间分辨率有限（5-6mm），必须有临界质量的代谢活跃的恶性细胞才能准确检测 [19] 。理想的检测方法是通过分析肿瘤的生物特性，实时监控疾病变化的非入侵性技术，其具有标本易得，价格低廉等特点。
三、肺癌的血清学检查
肺癌个性化治疗的兴起，促使研究人员评估新型诊断工具，以寻求新的突破。患者的外周血取材方便，是替代肺组织作为诊断标本的最佳选择。生物标志物是通过患者血清或血浆检测，具有价格低廉、创伤小、接受度高等特点。正因如此，科研人员将研究焦点逐步转向“液体活检”。即通过对人体体液分析，对生物标志物进行实时检测。液体活检家族中研究最多的有肿瘤标志物、循环肿瘤细胞（circulatingtumor cells，CTCs）、微小核糖核酸（microRNA，miRNA）等。
1. 肿瘤标志物：在基因组学、蛋白质组学、代谢组学和生物信息学的推动下，研究人员努力探索肿瘤标志物在肺癌诊断、治疗和预后中的作用，寻找可作为生物标志物的蛋白质，检测早期肺癌，监测治疗效果，并预测肿瘤复发几率。总的策略是从血液、组织或体液中提取蛋白质，分析它们以发现差异，从而将肺癌患者与健康对照组或对治疗有反应的患者与无反应的患者区分开来。目前，常见的肺癌血清学肿瘤标志物，主要包括CEA、CYFRA 21-1、CA125、NSE、鳞状细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCCA）。
癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是一种具有人类胚胎抗原特性的酸性糖蛋白，在胚胎或者肿瘤组织中含量高。以往将CEA作为早期诊断结肠癌与直肠癌的特异性肿瘤标志物，其后发现在乳腺癌、肺癌等患者血清中含量也有所升高 [20] 。因此，CEA是一种广谱肿瘤标志物，但对肺癌有鉴别性诊断、监控病情等临床价值 [21] 。CYFRA 21-1是被激活的蛋白酶酶解恶性上皮细胞产生的可溶性细胞角蛋白片段，是临床常用的肺癌的肿瘤标志物之一 [22] 。研究结果证明，其诊断NSCLC尤其是肺鳞癌的敏感性和特异性分别为68%和94%，具有重要的临床诊断价值 [23] 。目前，临床上多将CYFRA 21-1和CEA联合诊断肺癌，提高其诊断效能 [24] 。CA125是1981年由Bast等人通过单克隆抗体OC125从上皮性卵巢癌中检测出的一种糖蛋白，不存在于正常卵巢组织 [25] 。因此，对上皮性卵巢癌诊断价值较高。2018年Peter J Mazzone等人通过检测1004份血清标本，运用多元逻辑回顾分析和中位数等方法评估CA125作为肺癌血清学肿瘤标志的诊断价值。报告显示CA125诊断肺癌的曲线下面积（areaunder the curve，AUC）值为0.69，CEA+CA125+CYFRA的组合检测可将AUC值提高至0.75 [26] 。NSE是一种神经元，周围神经内分泌组织和APUD（胺前体摄取和脱羧）细胞的高度特异性标记物,是目前诊断SCLC时最可靠的肿瘤标志物 [27] 。其血清水平根据肿瘤大小，疾病分期和远处转移而有明显差异（P＞0.05），而与性别或年龄均无关联（P＜0.05） [28] 。Huang等为证实NSE对SCLC患者的临床价值，对患者血清NSE水平进行meta分析。分析显示NSE检测SCLC的合并敏感性为0.688（95% CI：0.627-0.743），特异性为0.921（95% CI：0.890-0.944） [29] 。SCCA最初从宫颈癌组织中发现，其对各种鳞状上皮细胞癌的诊断均有很高的特异性 [30] 。科研人员通过对常规肺癌血清标志物实用性和成本的评估，NSE+CEA+CYFRA21-1是检测肺癌的最优组合，具有最高的尤登指数（0.64），更高的敏感性（75.76%）和特异性（88.57%） [31] 。
在肿瘤发生和增殖过程中，癌细胞自身外分泌具有特异性的蛋白分子，这些蛋白分子被称为肿瘤标志物。使用免疫或者生化方式检测肿瘤标志物，有利于实时监控患者病情发展及治疗疗效。由于目前常用的肺癌肿瘤标志物缺乏灵敏度和特异性，临床上多用组合检查的方式提高诊断效率。因此，寻找新型肿瘤标志物用于早期肺癌诊断，对于降低肺癌死亡率显得尤为重要。
2. 循环肿瘤细胞：在大多数实体瘤中，远处转移灶的出现限制临床治疗效果是癌症死亡率高的主要原因 [32] 。远处转移是由CTCs引起的，主要经淋巴转移、血液转移和种植转移的方法从原发病灶向全身各器官浸润 [33] 。多项研究表明，肿瘤远处转移很可能在肿瘤发展早期就已经出现 [34-36] 。故CTCs的检测对多种恶性肿瘤的早期诊断、评估疗效、监测癌症复发等方面具有重要意义 [37, 38] 。
CTCs取材方便、侵入性低，既可以获取基因、mRNA、蛋白质等变异信息，又能指示癌症的实际状态，并且在治疗过程中可以重复进行多次评估 [39] 。2019年发布的《肺癌筛查与管理中国专家共识》中，CTC被纳入作为肺癌筛查的新型标志物。由于CTCs在外周血中数量少、癌组织高度异质性且微环境较为复杂，因此如何准确分离及检测CTCs成为技术性难题[40] 。目前CTCs检查策略是基于物理（梯度离心法、超微膜过滤法）或生化特性（免疫亲和富集法）有效富集及分离CTCs，基于特定蛋白质的表达或分泌，DNA突变或RNA分析等对CTC数量及表型进行精准分析。一项多中心大规模临床试验结果表明，通过使用新型配体靶向（LT）PCR方法的CTCs检测技术，肺癌检测的灵敏度和特异性分别为80.2%和88.2%，其中Ⅰ期非小细胞肺癌患者的诊断灵敏度达到67.2% [41] 。研究证明在部分健康志愿者和吸烟者体内未检测到CTCs, 表明CTCs在肺癌的检测具有较高特异性，有望成为筛查的新方法 [42] 。
CTCs是近些年研究的焦点，为癌症筛查提供新的思路。许多研究小组正在评估CTCs检测的临床价值。目前为止，CTCs分析已经被证明在肺癌、乳腺癌等多种实体瘤提供了重要的预后信息，且早期诊断价值优于传统的影像学方法 [43-45] 。尽管在CTCs的检测和分子表征方面取得了许多进步，但由于癌组织的高度异质性和临床癌症休眠现象的存在，CTCs的检测仍然存在一些挑战 [46] 。
3. miRNA：微小核糖核酸（MicroRNA，miR）是小型非编码RNA（19-24个核苷酸）家族，通过转录后机制调控靶基因的翻译与表达从而控制细胞分裂、转移、代谢 [47] 和凋亡，对肿瘤发展有重要意义 [48] 。其作为肺癌分子诊断标志物，优点在于①患者体液均能作为检测样本，是一种早期非侵入性诊断方式。②体液中的循环miR稳定性高，不受内源性RNase的影响。③循环miRNA克服肿瘤异质性。因此miR不同于传统核糖核酸，成为新的生物标志物和未来潜在的治疗靶点。近些年评估miR作为肺癌诊断、预后、分期标志物成为新的研究热点。
由于miR稳定性好，在从早期到进展甚至转移后均可在体液中被发现。研究结果显示miR对肺癌的诊断价值要高于组织活检或者影像学检查，其在早期无症状患者就可以观察到变化 [49] 。目前已被证实miR-145-5p、miR-21-5p、miR-221-3p、miR-222-5p、mir-20a-5p、miR-146a-5p和miR-223-3p是非小细胞肺癌早期检测的生物标志物 [50] 。Roth等学者通过包含1158个miR的流体生物芯片对NSCLC患者和健康人的血液中的miR进行微阵列分析，发现血清miR-361-3p和miR-625可用于区分恶性肺肿瘤与良性肿瘤 [51] 。Shen等学者通过qRT-PCR分析实时定量miR结果表明，包括miRNA-21、miRNA-126、miRNA-210和miRNA-486-5p在内的4种miRNA在诊断NSCLC患者的敏感性为86.22%和特异性为96.55% [52] 。miR-182-5p、miR-210-3p、miR-
183-5p和miR-126-3p的血清水平在非小细胞肺癌患者中具有早期检测价值。使用逻辑回归模型分析这四种miR与CEA联合诊断其曲线下面积（AUC）为0.965，灵敏度为81.3%，特异性100.0%，准确性为90.8% [53] 。研究学者发现miR的表达量与患者体内的肿瘤体积大小有关[54] 。此外，miR可通过调节与耐药性相关的基因的表达从而改变癌细胞对化疗或放疗的抗性和敏感性。
miR参与人体内多种生物过程，调节包括恶性肿瘤在内的多种疾病基因表达。体液中稳定存在的miR是对疾病各个时期进行实时定量与定性检测的基础。对miR基因调控机制的探究，为疾病诊断、治疗和预后判断开辟了新的领域。
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