肝药酶CYP2C9基因的变异特点与个体药物代谢的差异性

作者:徐仁爱 蔡剑平
2021-12-16

人体内代谢药物的主要酶是细胞色素P450超家族,它们是一类主要存在肝脏、肠道中的单加氧酶,多位于细胞内质网上,氧化许多内源性和外源性化合物,由CYP基因超家族编码。截至如今,确定了人类CYP超家族中共有57个功能基因和58个假基因,其中CYP1,CYP2,CYP3大家族的成员对治疗性药物、外源性物质和内源性物质的代谢起重要作用[1]。CYP2C是目前研究最广泛,特性最清楚的一个亚家族,包括CYP2C8,2C9,2C18和2C19等异构体[1]。其中CYP2C9基因编码的蛋白在人肝微粒体中含量丰富,仅次于CYP3A4,约占肝微粒体P450总量的20%。CYP2C9代谢和活化许多种药物、前致癌物、前毒物和致突变剂,催化约有16%的临床常用药物[2]。CYP2C9具有高度基因多态性,最常见的多态性是单碱基替代(即单核苷多态性SNP)。基因多态性导致了三种不同的代谢表型:正常表型,快代谢型和慢代谢型。快代谢型者具有多个P450基因的拷贝,造成药物在体内迅速代谢,药效降低;慢代谢者的P450基因发生突变,酶活力降低,药物在体内代谢缓慢,容易积累发生中毒。对CYP2C9基因多态性的研究是用药个体化的基础,也是药物基因组学快速扩展的领域。


一、肝药酶CYP450 2C9基因的变异特点与基因频率分布

编码人类CYP2C9的基因位于人染色体10q24.2上,全长约为55.6kb,包含9个外显子和8个内含子,在起始密码子上游57bp和110bp分别有一个TATA和CAAT盒,编码490个氨基酸残基[3, 4]。人CYP2C9的晶体结构如图1所示(氨基酸残基顺序经轻微修改以便测构,Protein Data Bank accession codes 1OG2 and 1OG5)[5]。它的三维结构是由多个α螺旋和少量β折叠组成,黑色的球棍模型代表血红素,底物进入的通道是B,C螺旋和F,G螺旋间的回环。

42.jpg

图1. CYP2C9整体折叠结构。从蓝色的N末端到红色C

末端均已标记,用球棍模型标示的血红素基团

位于分子中心


近年来,很多CYP2C9的多态性位点被不断发现,表明CYP2C9具有高度的遗传多态性。在编码区,由单碱基对交换导致氨基酸残基的替换等,产生了等位变异体。迄今为止,至少有60种CYP2C9编码区突变被发现并被人类细胞色素P450等位基因命名法委员会(Human Cytochrome P450 (CYP) Allele Nomenclature Committee,http://www.cypalleles.ki.se/index.htm) 命名, 这包括CYP2C9 ( 野生型) 和CYP2C9*2-CYP2C9*60(突变型)。大部分突变基因改变底物药的代谢能力。CYP2C9等位基因及变异位点见表1。

43.jpg

第一种经鉴定证实的常见等位基因突变是CYP2C9*2[6],在3号外显子发生C430>T的突变,导致产生Arg144>Cys144氨基酸置换。野生型CYP2C9*1等位基因具有AvaⅡ限制性内切酶位点(ggacc),而CYP2C9*2由于产生突变(ggact)丧失了AvaⅡ限制性内切酶位点,因此可通过基于PCR的限制性片段长度多态性分析(RFLP-PCR)的方法鉴定CYP2C9*2。


第二种常见的突变是CYP2C9*3[7],在7号外显子上1075位发生A>C突变, 造

成Ile359>Leu359氨基酸改变。由于CYP2C9*3在突变位点找不到合适的内切酶,不适合采用经典的RFLP方法进行分型鉴定,因此采用错配引物RFLP方法分析。采用针对Ile359或Leu359的密码子设计两条不同错配正向引物和相同的反向引物进行PCR。由于针对Ile359的引物可使野生型(A1075)在G1073位发生错配,产生NsiI酶切位点(atGcat),而CYP2C9*3等位基因缺乏NsiI酶切位点,因此,只有野生型的样本才有NsiI酶切片(gGtacc),只有含CYP2C9*3等位基因的样本才有KpnI酶切片段。或者,设计反向错配引物,引入SmlI酶切位点,可识别Leu359(CTT)突变,从而进行CYP2C9*3基因分型。除上述方法可用于分型之外,还有如下一些方法[8, 9]:(1)基于PCR的单链构象多态性(SSCP);(2)采用SYBR Green I通用荧光染料实时定量PCR(RT-PCR)快速检测;(3)特异TaqMan荧光探针PCR法。


CYP2C9等位基因的基因频率在世界不同地区、不同种族人群中存在较大差异。CYP2C9*2和CYP2C9*3是发现比较早的两个等位基因,研究的也最广泛。我国CYP2C9基因突变以CYP2C9*3为主,分布频率为3.3~3.6%,而CYP2C9*2等位基因频率几乎为0。CYP2C9*2和CYP2C9*3的基因频率在不同人种和不同民族间差异较大,见表2。

44.jpg45.jpg

CYP2C9*4是罕见的错译突变[8]:7号外显子上T1076>C,导致Ile359(ATT)>Thr359(ACT)。它仅在32例日本癫痛病人中发现一例,但在日本健康人群中以及其他美国非洲人群、美国西班牙人群、加拿大原住民、印度人、中国人和白种人中并没有发现。它与CYP2C9*3一样,CYP2C9*4没有限制性内切酶位点,也采用错配引物PCR-RFLP法分型。引物中错配2bp碱基,引入ApaLI内切酶位点(GtGcac)。CYP2C9*5[11]是第7外显子1080C>G突变,导致Asp360被Glu360代替,这种等位基因在美籍非洲人和美籍西班牙人中发现过,但在高加索人和中国人中均未发现。CYP2C9*6[12]等位基因是由于第5外显子818位A丢失引起的,曾在一位美籍非洲人上发现。


CYP2C9*7-*12是在对来源白种人(美国人和欧洲人)、亚洲人和非洲人三种主要人种的92例gDNA样本CYP2C9全基因测序时发现的[13]。CYP2C9*7位于第一外显子,发生C55>A突变,导致L19>I氨基酸改变;CYP2C9*8位于第3外显子,发生G449>A突变,导致R150>H;CYP2C9*9位于第5外显子,发生A752>G突变,导致H251>R改变。CYP2C9*10位于第5外显子,发生A815

>G突变,导致E272>G氨基酸改变。CYP2C9*11位于第7外显子,发生C1003>T突变,导致R335>W氨基酸改变。CYP2C9*12位于第9外显子,发生C1465>T突变,导致P489>S氨基酸改变。该研究没有进一步在大样本人群中进行突变频率分析,因此还没有建立各等位基因基于PCR的分型方法。


CYP2C9*13位于第2外显子,发生T269>C突变,导致L90>P氨基酸改变[14]。该突变是在中国人群中评价CYP2C9底物药物氯诺昔康一种新制剂生物等效性时,发现一受试者氯诺昔康的消除半衰期特别长,为105小时,而其他受试者平均为4.2小时。通过对CYP2C9已知突变进行分析,发现该受试者为CYP2C9*1/*3杂合子。但野生型CYP2C9*1/*1和其他突变杂合子CYP2C9*1/*3基因型携带者,半衰期分别为3.2-6.3小时和5.8-8.1小时,显然,CYP2C9*1/*3杂合子不足以解释该个体半衰期特别延长的现象。该现象很可能是由于受试还有其它位点的突变,严重影响了CYP2C9的活性。在对该受试者的全基因测序时发现CYP2C9编码区确实存在新的SNP,被命名为CYP2C9*13。在后续突变频率分析中,建立了RFLP分型方法。该方法所采用的PCR引物与CYP2C9*2分型引物一样。CYP2C9*1野生型具有一个EcoⅡ限制性内切酶位点(CCTGG),而CYP2C9*13由于发生T269>C突变,使原基因序列CTTGG改变为CCTGG,产生新的EcoⅡ酶切位点,从而通过RFLP方法分型。


CYP2C9*14-*20是在研究东南亚人群CYP2C9基因多态性对华法林维持剂量的影响时发现的[15]。病例来源东南亚三个主要种族(马来人、印度人和中国人),共125例。CYP2C9*14位于第3外显子,发生G374>A突变,导致R125>H氨基酸改变;CYP2C9*15位于第3外显子,发生C485>A突变,导致S162>X;CYP2C9*16位于第5外显子,发生A895>G突变,导致T299>A改变;CYP2C9*17位于第7外显子,发生C1144>T突变,导致P382>S氨基酸改变;CYP2C9*18位于第7外显子,发生A1190>C突变,导致D397>A氨基酸改变;CYP2C9*19位于第8外显子,发生G1362>C突变,导致O454>H氨基酸改变;CYP2C9*20位于第2外显子,发生G208>C突变,导致G70>R氨基酸改变。目前,尚未建立针对上述新的SNP的基因分型方法。


CYP2C9*21-*23是在研究192例华法林药物治疗的欧洲裔美国患者CYP2C9基因单被型结构及其对药物治疗的影响时发现的[16]。CYP2C9*21位于第1外显子,发生C89>T突变,导致P30>L氨基酸改变;CYP2C9*22位于第1外显子,发生A121>G突变,导致N41>D;CYP2C9*23位于第2外显子,发生G266>A突变,导致V76>M改变。


CYP2C9*24是在斯洛文尼亚人华法林药物治疗病人发现的[17]。研究采用SSCP的方法对CYP2C9所有的外显子进行分析,从202例病人中发现1例样本第7外显子1060位发生G>A突变,导致E354>K氨基酸改变,被命名为CYP2C9*24。研究者基于野生型在第7外显子扩增315bp片段中含有BssSI内切酶位点,而CYP2C9*24由于发生G1060>A突变,使BssSI酶切位点被取消,建立了RFLP-PCR的分型方法。然而,采用该分型方法对另外166例斯洛文尼亚人进行CYP2C9*24分型时,并未发现该SNP。


CYP2C9*25-30是在263名日本人样本CYP2C9全基因测序发现的[18]。CYP2C9*25位于第1外显子,在353位至362位发生AGAAATGGAA序列缺失,导致从118位后9个氨基酸发生改变并提前终止(118-126;Lys-Lys-Trp-Lys-Glu-Ile-Arg-Arg-Phe改变为Arg-Arg-Ser-Gly-Val-Ser-Pro-Ser-Stop, 即Lysl18ArfsX9改变);CYP2C9*26位于第3外显子,发生C389>G突变,导致Thr130>Arg;CYP2C9*27位于第3外显子,发生G449>T突变,导致Arg150>Leu改变。CYP2C9*28位于第4外显子,发生A641>T突变,导致G214>L氨基酸改变;CYP2C9*29位于第5外显子,发生C835>A突变,导致P279>TCYP2C9*30位于第9外显子,发生G1429>A突变,导致Ala477>Thr改变。


2013年,北京医院蔡剑平和温州医科大学胡国新研究团队收集2127份中国汉族人群血样来分析CYP2C9基因多态性,建立了全世界最大的等位基因频率数据库[19]。该研究中共发现了37种新的突变位点,其中有21种突变位点可以改变所编码的氨基酸序列,并且已经被人类细胞色素P450等位基因命名委员会命名为新等位基因CYP2C9*36-*56。同时,Dai等人在800例使用华法林患者中发现了新等位基因CYP2C9*59和CYP2C9*60[20, 21]。此外,Luo等人在一个华法林敏感患者的第7号外显子上发现1009C>A突变,造成P337T氨基酸改变,该突变位点被命名为CYP2C9*58[22]


CYP2C9基因频率分布具有种族和地域差异,24种CYP2C9新等位基因主要在中国汉族人群中发现,其变异位点和频率分布如表3所示[19-24]

47.jpg


二、肝药酶CYP450 2C9基因的变异与药物相互作用

当患者同时接受两种或两种以上的药物时,要高度重视因潜在的药物相互作用所致的药物代谢动力学以及由此引起的疗效和毒性的改变。参与药物代谢的P450酶的一个重要特性就是可以被诱导或抑制。许多临床常用的药物可以对P450酶产生诱导或抑制作用,因此当两种或两种以上的药物合用时就会出现药物间的代谢相互作用。有些药物如苯巴比妥、卡马西平、利福平、地塞米松及乙醇等可使肝药酶的活性增加,称之为肝药酶诱导剂,它们可以加速其他药物的代谢而使药效减弱。有些药物如氯霉素、异烟肼、酮康唑、西咪替丁等可以抑制P450酶,使其活性降低,使其他药物的代谢减慢而药效增强,故药物间的代谢抑制一般被认为是一种潜在危险,应尽量加以避免。仅在美国,每年因ADRs所造成的医疗损失高达数亿美元,尤其对于一些治疗窗口期很窄的药物,因其药物相互作用所引发的不良反应甚至是致命的。因此了解联合用药时药物间的潜在代谢相互作用具有十分重要的临床指导意义。例如,当患者在服用一种治疗糖尿病的药物——甲苯磺丁脲时,此药经由CYP2C9酶代谢,同时该患者又服用磺胺类药物(CYPC9酶抑制剂),就会发生严重低血糖的不良反应。这是因为CYP2C9酶在抑制剂的作用下其活性大大降低,使治疗糖尿病的药物在体内的代谢缓慢,造成血药浓度升高,从而引发严重的低血糖症。相反,如果患者同时服用利福平(CYP2C9诱导剂),能大大提高底物药的代谢速率,从而可能使药物无法达到发挥药效时的血药浓度,降低其生物利用度或者无法达到治疗效果。因此有效预测药物相互作用可能引发的不良反应是在药物开发早期的一项重要的研究内容。表4和5列出了CYP2C9的诱导剂和抑制剂。这些药物通过抑制或诱导CYP2C9的活性,使其底物的代谢速度减慢或加快,血药浓度升高或达不到治疗时的血药浓度,从而产生ADRs或药效达不到理想的效果。

48.jpg


三、肝药酶CYP450 2C9基因的变异与个体化用药

所谓个体化用药即医生根据特定人群甚至特定个人的病情、病因以及遗传基因(SNPs、基因表达),提供针对性治疗和最佳处方用药[23]。


个体基因多态性是一种普遍现象,随着遗传药理学和药物基因组学的发展,人们逐渐认识到药物治疗中药效和毒副作用存在个体差异的潜在原因,除与年龄、致病原、疾病轻重、营养状况、药物相互作用等因素有关外,差异大多源于药物的遗传多态性,可以表现为药物代谢酶的多态性和药物转运体、药物受体的多态性等。例如,CYP450酶与大约25%的常用药物的代谢有关,如果患者该酶的基因发生突变就会对降压药异喹胍产生不良反应。


以华法林为例,它是一种广泛用于临床的口服抗凝药,常以消旋混合物形式用于抗凝治疗,S-对映体的抗凝活性要比R-对映体强3-5倍。CYP2C9介导S-华法林的羟基化代谢。华法林的有效剂量范围为1-60mg/d。其治疗过程中存在自发性出血的并发症,随着抗凝强度的增大,这种并发症的发生率也随着升高,相同剂量时不同患者华法林的抗凝作用个体差异较大,在治疗剂量下不同患者的血药浓度相差可达10倍。因此临床用药中应注重华法林用药剂量的个体化。CYP2C9*2和CYP2C9*3变异者对S-华法林的清除率比正常人要高5.5倍和27倍,需要更长时间才能达到稳态浓度,同时出血的危险也大大增加。CYP2C9*3杂合子患者所需华法林的平均剂量为野生型CYP2C9*1纯合子的60%,而CYP2C9*3的纯合子患者的剂量仅为野生型CYP2C9*1纯合子的10%。CYP2C9*2同样存在类似现象,所用剂量在杂合子和突变纯合子中分别较野生型纯合子降低15-20%和40%。而且,携带CYP2C9*2和CYP2C9*3的患者应用华法林时发生出血并发症等不良反应的概率显著高于野生型纯合子患者。此外,由于CYP2C9突变体的发生频率存在种族差异,导致了华法林维持剂量的种族差异,要达到相同的抗凝效果,华人的华法林的维持剂量(3.3mg/d)比白人(4.9mg/d)低约50%[24]


可见个体化给药必须从基因差异入手,采用药物基因组学的方法,对一些疾病相关基因的SNPs检测,进而对特定药物具敏感性或抵抗性的患病人群进行SNPs差异检测,指导临床开出“基因合适”的药方即基因处方,使患者得到最佳治疗效果,从而达到真正用药个体化的目的。


四、结论

C Y P2C9是人体肝细胞色素P4 5 0酶中含量最丰富的(肝总色素含量的20%),代谢约16%的临床药品(>100药品),其中包括一些治疗范围窄的药物。一些化合物可以诱导或者抑制CYP2C9的活性,这对重要的药物相互作用可以进行解释。CYP2C9基因型的不同解释了有些药物代谢个体和种族的差异,表现在临床上可改变某些药物的药代动力学,导致药效增强或降低,甚至可引起不良反应。CYP2C9*2和CYP2C9*3突变体对于CYP2C9*1而言,代谢减慢,剂量也减少。这对于治疗指数小的药物(如华法林),CYP2C9基因型的作用就显得更加重要了。根据CYP2C9基因型改变病人华法林初始用量,可减少时间达到治疗INR,并减少出血事件。


鉴于CYP2C9基因的遗传多态性以及等位基因的变化,导致个体对药物代谢能力的差异,使药物的临床疗效和毒副作用发生明显变化,因此研究CYP2C9的基因多态性,减少药物反应的个体差异,缩小药物不良反应,优化治疗决策的决定,最终提高临床结果。通过研究CYP2C9的基因型和表型的信息,保健专业人员可以识别病人的基因多态性与疾病的亚型,来确定最有利的给药方式,这包括最有效的及时给药,正确的剂量以保证药物的毒性最小[25]。然而,在这些策略应用于临床之前,必须对基因指导给药剂量的疗效、安全性结果和成本效益等因素作出评价。此外,尽管大量研究说明CYP2C9基因多态性对药物代谢有影响,但不能排除健康状况、种族差异等其它因素的影响,还有CYP2C9其它基因型的发现及其对药物代谢的作用。总之,这些研究结果表明,深入研究CYP2C9代谢的药物和基因-剂量,基因-浓度,及基因-反应的关系是很有意义和必要的。



基金项目:国家重点研发计划资助项目(编号:2020YFC2008301)

作者单位:浙江,温州医科大学附属第一医院(徐仁爱);

北京,国家卫健委北京老年医学研究所(蔡剑平)

通讯作者:蔡剑平